林志堅，陳長江，周挺，顧鋼*，胡方平，李春英，蔡學清*

（1.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學計算機與信息學院，福州 350002；3.福建省煙草公司煙草科學研究所，福州 350003）

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的作物青枯病是典型的維管束病害，該病菌可侵染番茄、辣椒和煙草等50多個科450余種作物，在我國長江流域及其以南地區(qū)普遍發(fā)生且有向北擴散的趨勢，個別年份爆發(fā)流行，嚴重時甚至絕產(chǎn)[1-2]。自然狀態(tài)下，青枯菌致病性、生理生化分化嚴重，寄主適應性強，屬于土壤習居菌，給防治增加了難度[3]，目前主要采用抗病品種、栽培管理、輪作換茬、化學防治等措施進行防治。

噬菌體（bacteriophage）是一類?；詷O強的細菌病毒，廣泛存在于自然界中[4]，按生活周期可分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體。烈性噬菌體感染宿主菌后會裂解宿主菌釋放子代，是細菌的天然殺手，能有效地控制宿主菌的種群數(shù)量[5]。噬菌體具有防控作物細菌性病害的巨大潛力，已應用于馬鈴薯黑脛病、玉米細菌性枯腐病、棉花黑枝病、梨火疫病等病害的防治[6]。Addy 等[7]從土壤中分離到一株肌尾噬菌體RsoM1USA，能顯著抑制宿主菌的生長，但對番茄青枯病無防效；Wang 等[8]從生姜地中分離到一株能裂解青枯菌（演化型Ⅳ型）的烈性短尾噬菌體GP4，并進行了基因組測序分析；Van Truong 等[9]對長尾青枯菌噬菌體RS138 的基因組分析結(jié)果顯示，其基因組全長41 941 bp，GC 含量65.1%，含56 個開放閱讀框，不含tRNA；Ahmad 等[10]從青枯菌中分離到一株原噬菌體Rs551，噬菌體呈線狀，長1 200 nm，寬7 nm，基因組全長7 929 bp，GC 含量61%，編碼14 個開放閱讀框，該噬菌體對其青枯菌的生長無影響，但能降低青枯菌的致病性從而推遲植株發(fā)病。近年來，盡管有很多青枯菌噬菌體被挖掘，但由于青枯菌的高度遺傳多樣性及噬菌體高度特異性，使得噬菌體對來源不同、類型不同的青枯菌表現(xiàn)出不同的侵染力[11-12]。因此，不同區(qū)域的青枯菌噬菌體在應用上有一定的局限性。為獲得適合防治福建煙草青枯病的噬菌體，本課題組以福建煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）為對象，從煙草根際土壤中分離獲得一株烈性青枯菌噬菌體RPZH6，該噬菌體裂解譜廣且對環(huán)境適應性強。為明確該噬菌體的生防潛力及分類地位，本研究測定了其生防效果并分析其全基因組序列，以期為該噬菌體的開發(fā)應用及其生防機制探討提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草青枯菌TBRS12 分離自福建省南平市政和縣煙草病株，噬菌體RPZH6 分離自福建省南平市政和縣煙草根際土壤，二者均由本實驗室分離鑒定保存。煙草翠碧1 號種子由福建省煙草科學研究所提供。

TTC 固體培養(yǎng)基和NB 培養(yǎng)基[13]用于青枯菌及噬菌體培養(yǎng)。SM 緩沖液[14]用于噬菌體保存。DNase Ⅰ、RNase A、EcoRⅠ、蛋白酶K購自寶生物工程（大連）有限公司；57.6%氫氧化銅水分散粒劑，上海紐發(fā)姆化學品有限公司。氯化鈉、聚乙二醇8000（PEG8000）、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris-酚、乙醇等均為國藥分析純。

1.2 方法

1.2.1 青枯菌的培養(yǎng) 將保存于-75 ℃的青枯菌在TTC 平板培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落于NB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)16～18 h，獲得對數(shù)生長期（OD600值≈0.8）的菌液，用于噬菌體的培養(yǎng)和盆栽實驗接種。

1.2.2 噬菌體的培養(yǎng) 取4 ℃保存的噬菌體RPZH6 菌液，按1%（體積分數(shù)）的量接種于培養(yǎng)好的青枯菌菌懸液中混勻，靜置15 min，28 ℃、130 r·min-1振蕩培 養(yǎng)12～16 h，培養(yǎng)液12 000 r·min-1離心5 min，取上清液，用0.45μm 濾膜抽真空過濾除菌，過濾液為噬菌體原液，效價為109pfu·mL-1，備用。

1.2.3 噬菌體對煙草青枯病的防效測定 將煙草種子點播到育苗盤中，每穴1 粒，待生長至3 片真葉時，移入AB∶150型花盆。置于溫度25 ℃、光照16 h∕黑暗8 h的溫室內(nèi)培育至5片真葉，6株為1組，分別設計以下3 種處理：①每株澆灌30 mL 噬菌體RPZH6 原液；②每株澆灌30 mL 57.6%氫氧化銅水分散粒劑1 000倍液；③每株澆灌30 mL 無菌水；24 h 后，用滅菌的小刀在煙苗主根兩側(cè)各切1 刀，澆灌30 mL 煙草青枯菌菌TBRS12 懸液（OD6000.8）。以不澆灌TBRS12，只澆灌無菌水處理為空白對照（CK）。每個處理3 次重復，每重復6株。培養(yǎng)條件：白天30 ℃，夜間28 ℃，光照12 h、黑暗12 h 的溫室里培養(yǎng)，每隔7 d 調(diào)查1 次病情[15]，計算病情指數(shù)和防效。

1.2.4 噬菌體核酸的提取及類型鑒定 參照《分子克隆實驗指南》[16]方法獲得粗制噬菌體顆粒，4 ℃保存?zhèn)溆?。參考蘇靖芳等[17]的方法提取噬菌體核酸，-25 ℃保存?zhèn)溆谩：怂犷愋丸b定參考Jin 等[18]方法，在噬菌體核酸中分別加入DNase Ⅰ（RNase Free）、RNase A（DNase Free）和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，37 ℃溫浴4 h 后，經(jīng)1%（體積分數(shù)）瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.5 噬菌體全基因組測序 全基因組測序委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。將檢測合格的DNA 樣品先經(jīng)Covaris 隨機打斷成350 bp 的片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit 試劑盒進行建庫，采用IlluminaHiSeq2000 進行測序。采用Trimmomatic軟件進行包括去接頭、低質(zhì)量區(qū)域等質(zhì)量過濾，其中平均每個堿基質(zhì)量大于20，可用堿基錯誤概率小于0.001[19]。基因序列組裝和拼接用MITObim(https:∕∕github.com∕chrishah∕MITObim)軟件[20]。

1.2.6 噬菌體全基因組分析 使用BioEdit 軟件[21]分析序列堿基成分；使用在線軟件GeneMarks（http:∕∕exon.biology.gatech.edu∕GeneMark∕genemarks.cgi）對編碼基因進行預測[22]；全基因圖譜用在線軟件CGView Server V 1.0（http:∕∕stothard.afns.ualberta.ca∕cgview_server∕）繪制[23]；獲得的基因編碼序列與GO（http:∕∕geneontology.org∕）、KEGG（https:∕∕www.kegg.jp∕）、COG（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕COG∕）和NCBI（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）數(shù)據(jù)庫比對進行基因功能注釋（E-values＜1e-5）；使用在 線tRNAscan-SE(v1.3.1)（http:∕∕lowelab.ucsc.edu∕tRNAscan-SE∕）預測tRNA 編碼序列[24]，其中參數(shù)Sequence source 選擇bacterial，其他參數(shù)默認；用在線軟 件Promoter Prediction（http:∕∕www.fruitfly.org∕seq_tools∕promoter.html）和 ARNold: finding terminators（http:∕∕rssf.i2bc.paris-saclay.fr∕toolbox∕arnold∕index.php）預測噬菌體的啟動子序列和終止子序列[25-26]。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫比對和搜索，下載已公布的噬菌體全基因組序列和相關(guān)蛋白序列，比較基因組用在線軟件Blastn（https:∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast.cgi），比對結(jié)果 用Esayfis 2.2.2 軟件進行可視化[27]；序列多重比對用MAFFT 7.427軟件，用PhyloSuite V1.2.1 軟件中 的ModelFinder 模塊計算最佳模型，用IQ-TREE 模塊構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap抽樣1 000次[28-30]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel、DPS 15.10 軟件進行處理和統(tǒng)計分析，采用Duncan 氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體RPZH6對煙草青枯病的防治效果

噬菌體RPZH6 對煙草青枯病的生防效果（表1）顯示，接種后14 d，噬菌體和氫氧化銅處理的病情指數(shù)顯著低于對照組，噬菌體RPZH6 對煙草青枯病的防治效果為58.83%；接種后21 d，防效為60.98%；接種后35 d，噬菌體RPZH6 的防治效果仍有53.85%，顯著高于氫氧化銅處理。

表1 噬菌體RPZH6對煙草青枯病的防治效果Table 1 Control effect of phage RPZH6 on tobacco bacterial wilt

2.2 噬菌體的核酸類型鑒定

分別用DNase Ⅰ、RNase A 及EcoRⅠ酶切噬菌體的核酸，電泳結(jié)果如圖1，噬菌體RPZH6的核酸能被DNase Ⅰ消化，同時能被限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ切成多個條帶，但不被RNase A 降解，說明噬菌體RPZH6的核酸類型為雙鏈DNA（dsDNA）。

圖1 噬菌體RPZH6核酸酶切Fig.1 Enzyme digestion of nuclear acid of phage RPZH6

2.3 噬菌體RPZH6的基因組特性分析

經(jīng)測序，獲得30.16 Mb 原始測序數(shù)據(jù)reads數(shù)，4.52 Gb 原始測序數(shù)據(jù)量，質(zhì)控處理后，有效reads數(shù)為25.41 Mb，有效數(shù)據(jù)量為3.81 Gb。經(jīng)過拼接、組裝，噬菌體RPZH6 的基因全長64 657 bp（GenBank 登錄號：MT361768），GC 含量64.84%，其中A、C、G、T 含量分別為15.88%、33.15%、31.70%、19.28%。噬菌體RPZH6 預測含有92 個開放閱讀框（open reading frame，ORF），1 個tRNA基因（tRNA-Ser-TAG）（圖2），30 個啟動子序列和18 個終止子序列。預測的開放閱讀框序列總長58 694 bp，平均長度638 bp，占全基因組總長90.78%；起始密碼子為ATG 的有74 個，GTG 的有12 個，TTG 的有5 個，TAT 的1 個。在92 個開放閱讀框中，只有16 個正向排列，占17.4%；其他均為反向排列。

圖2 噬菌體RPZH6全基因圖譜Fig.2 Complete gene map of phage RPZH6

2.4 基因功能分析

對預測得到的編碼基因在GO、KEGG、COG NR 等數(shù)據(jù)庫進行功能注釋。結(jié)果顯示，噬菌體RPZH6 的92 個ORFs 中，有47 個被注釋為功能蛋白（表2），42 個被注釋為假定蛋白，3 個在數(shù)據(jù)庫中比對不到任何信息。在47 個功能蛋白中，噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白有4 個，分別為衣殼蛋白（ORF5）、門脈蛋白（ORF11）、尾纖蛋白（ORF80～81）；噬菌體相關(guān)功能蛋白有26 個，主要包括病毒粒子相關(guān)蛋白（ORF4、74、76、79、82、84、85、88）、復制蛋白（ORF42）、DNA 結(jié)合蛋白（ORF50、57、58）、類RecT 蛋白（ORF56）、DarB 類抗抑制蛋白（ORF72、73、90）等；噬菌體相關(guān)酶蛋白有10 個，包括末端酶（ORF14、32）、裂解酶（ORF16）、HNH 歸巢核酸內(nèi)切酶（ORF34）、Recb 內(nèi)切酶（ORF55）、DNA 聚合酶（ORF59）、酪氨酸重組酶（ORF63、64）等；噬菌體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有6 個，分別為1 個碳儲調(diào)節(jié)因子（ORF7）和5 個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（ORF1、24、52～54）。

表2 噬菌體RPZH6基因組47個ORF功能預測Table 2 ORF function prediction of the phage RPZH6 genome

表2 噬菌體RPZH6基因組47個ORF功能預測Table 2 ORF function prediction of the phage RPZH6 genome 續(xù)表Continued

2.5 比較基因組及系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫上BLASTn 比對顯示，噬菌體RPZH6 的全基因組與Ralstoniaphage GP4（MH638294，覆蓋率76%，一致性95.00%）、Burkholderiavirus Bcep22（AY349011，覆蓋率16%，一致性 80.57%）、Burkholderiavirus BcepMigl（JX104231，覆蓋率15%，一致性80.21%）、Burkholderiavirus BcepIL02（FJ937737，覆蓋率13%，一致性80.79%）和Burkholderiavirus DC1（JN662425，覆蓋率13%，一致性81.22%）相似。與其中2 株相似度最高的噬菌體全基因組比較分析結(jié)果如圖3，噬菌體RPZH6 與GP4 表現(xiàn)相似的基因排列結(jié)構(gòu)，但在部分區(qū)域序列（如ORF34～ORF46 之間）存在一些差異；與Bcep22 基因排列結(jié)構(gòu)差異較大，相同功能的基因在基因組中的分布位置不同。

圖3 菌體RPZH6與GP4、Bcep22全基因組序列比對Fig.3 Complete genome alignment of phage RPZH6 with GP4 and Bcep22

為進一步明確噬菌體RPZH6的分類地位?；诒Ｊ氐囊職さ鞍谆颍∣RF5）和尾纖蛋白基因（ORF80）的氨基酸序列，分別以LG+F+G4（ORF5）和PMB+F+G4（ORF80）為最佳建樹模型，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，基于衣殼蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4A），噬菌體RPZH6 與Ralstoniaphage GP4聚成一支，與噬菌體Bcep22、BcepIL02、BcepMigl和DC1聚為同一亞枝；基于尾纖蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4B），噬菌體RPZH6與Burkholderiavirus DC1 聚為一支，而噬菌體Ralstoniaphage GP4、Burkholderiavirus DC1、Bcep22、BcepIL02 及BcepMigl 均屬于短尾噬菌體科、Bcep22屬，表明噬菌體RPZH6也屬于短尾噬菌體科、Bcep22家族。

圖4 基于衣殼蛋白序列和尾纖蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetics tree were based on major capsid protein and tail fiber protein

3 討論

作物青枯病是一種世界分布的細菌性病害，化學防治是控制該類病害的主要手段之一，但防治該類病害的農(nóng)藥種類較少，防效不理想。利用噬菌體防治細菌性病害已有很長的歷史，自發(fā)現(xiàn)噬菌體以來，人們就嘗試應用噬菌體防治植物細菌性病害。由于細菌對抗生素產(chǎn)生抗性并漸增，利用噬菌體防治細菌性病害的技術(shù)越來越受重視[6,31]。高苗等[14]從煙草病圃土壤中分離到一株肌尾噬菌體∈RS-1，并研究了其生物學特性；Tanaka等[32]利用噬菌體防治煙草青枯病取得良好的效果；Wei 等[33]研究不同噬菌體混合制劑防治馬鈴薯青枯病，經(jīng)噬菌體處理的植株，青枯病發(fā)病率降低20%；蘇靖芳等[17]從土壤中分離獲得1 株短尾噬菌體RS-PII-1，并對其基因組學進行分析。本研究從煙草根際土壤中分離獲得一株能在宿主菌苔上產(chǎn)生透明、圓形的噬菌斑，并能使宿主菌液變澄清的烈性青枯菌噬菌體RPZH6，盆栽防效測定結(jié)果顯示，接種后21 d，對煙草青枯病的防治效果為60.98%；接種后35 d，防效仍有53.85%，其防效顯著高于化學藥劑。

核酸類型是噬菌體重要的分類依據(jù)，根據(jù)核酸類型，噬菌體可分為dsDNA 病毒、ssDNA 病毒、dsRNA 病毒和ssRNA 病毒[34]。目前已報道的青枯菌噬菌體主要有2 種：一種為dsDNA 病毒，如長尾噬菌體（Siphoviridae）ΦRS138[9]、短尾噬菌體（Podoviridae）RS-PII-1[17]和phiAP1[35]、肌尾噬菌體（Myoviridae）ΦRSF1 和ΦRSL2[36]等；另一種 為ssDNA 病毒，如絲狀噬菌體（Inoviridae）ΦRs551[10]等。本研究獲得的噬菌體RPZH6 核酸類型為dsDNA，基因組全長64 657 bp，GC 含量64.84%，含有92 個ORFs，1 個tRNA-Ser-TGA。與其他青枯菌噬菌體相比，噬菌體RPZH6 的GC 含量高于多個已報道的噬菌體，如RS-PII-1 為63.2%[17]、phiAP1為61%[35]；Ralstoniaphage GP4為64.01%等[8]。同時，噬菌體RPZH6 的全基因組長度也大于同類噬菌體，RS-PII-1 長42 042 bp，phiAP1 長44 793 bp，Ralstoniaphage GP4 長61 129 bp。另外，在預測的ORF 框中，噬菌體RPZH6 存在3 個未知蛋白，在數(shù)據(jù)庫中比對不到相近的蛋白產(chǎn)物，說明噬菌體在進化過程中存在遺傳多樣性?；谝職さ鞍?、尾纖蛋白的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，噬菌體RPZH6 與Bcep22-like 家族的短尾噬菌 體 phage GP4、phage Bcep22、phage BcepIL02、phage BcepMigl 和phage DC1 聚成一支。Blastn 比對分析顯示，噬菌體RPZH6 與Ralstoniaphage GP4 有較高的同源性，但覆蓋率僅為76%，覆蓋區(qū)的一致性為95%。基于全基因組序列比較分析，噬菌體RPZH6 與Ralstoniaphage GP4 的基因排列結(jié)構(gòu)相似性較高，但在ORF34～ORF46 等區(qū)域之間存在一些差異，序列同源性低（圖3）。寄主范圍上，Ralstoniaphage GP4 主要寄生姜青枯病菌及部分桑青枯病菌[8]，而噬菌體RPZH6 的宿主菌為煙草、番茄、辣椒和甘薯青枯病菌(實驗室數(shù)據(jù))。綜上分析，認為噬菌體RPZH6 屬于Bcep22 家族成員，是一株新的青枯菌短尾噬菌體。