付海洋，于秋航，2，楊 柳，王召旭，陳丹丹，付步芳

生物瓣屬于長期植入人體的第三類高風(fēng)險醫(yī)療器械，產(chǎn)品質(zhì)量直接關(guān)系公眾身體健康和生命。 為了配合高風(fēng)險醫(yī)療器械的監(jiān)管需求， 完善檢測方法，筆者探索應(yīng)用大鼠皮下植入模型檢測生物瓣抗鈣化性能實驗中陽性對照的限值范圍，為制定相關(guān)方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

生物瓣的材料來源于牛心包或豬心包，生物相容性好，植入后無需終身抗凝治療，植入生物瓣的患者比植入機械瓣的患者具有更高的生存質(zhì)量。但是由于材料的天然特性，生物瓣容易發(fā)生衰敗，使用壽命僅為10 ～15 年，耐久性能方面不如機械瓣[1～4]，鈣化是生物瓣衰敗的重要原因之一，抗鈣化性能是評價產(chǎn)品安全有效的一個重要指標(biāo)[5，6]。大鼠皮下植入實驗評價抗鈣化性能的原理是檢測宿主對植入物的反應(yīng)，以易發(fā)生鈣化反應(yīng)的剛離奶幼年大鼠作宿主模型，觀察其對植入材料的鈣化反應(yīng)，驗證材料抗鈣化處理工藝是否有效。 臨床數(shù)據(jù)顯示，不同個體對鈣化的敏感性不一樣；對于動物個體而言，在鈣化方面也存在個體差異[6]。如何排除對鈣化不敏感的動物個體？為了解決這個問題，制定可行可靠的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，筆者通過非參數(shù)檢驗的單樣本Kolmogorov-Smirnov 法對陽性對照鈣含量的數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗分析[7]，用正態(tài)分布法計算參考值范圍， 以此來限定陽性對照的最低限，以保證實驗體系的可靠性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品與動物

陽性對照樣品： 來自不同廠家12 批次未經(jīng)抗鈣化工藝處理的牛或豬心包材料。

SPF 級3 周剛斷乳Wistar 雄性大鼠384 只，體質(zhì)量45 ～55 g。購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。

1.1.2 主要儀器與試劑

儀器： 火焰-原子吸收分光光度計 （MKⅡM6）（Thermo Fisher 公司， 美國）； 微波消解儀MARS5（CEM 公司，美國）

試劑質(zhì)量濃度：1 000 μg/mL 鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液（GSB G 62012-90）， 中國計量科學(xué)研究院提供； 氧化鑭（99.99 %）、硝酸（優(yōu)級純）、鹽酸（分析純）、過氧化氫（分析純）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備

將未經(jīng)抗鈣化工藝處理的心包材料在無菌條件下剪成1 cm×1 cm 大小作為陽性對照樣品384 個。

1.2.2 動物皮下植入實驗

大鼠背部皮下分別植入陽性對照樣品，在植入第8 周對大鼠實施CO2安樂死， 取出植入陽性對照樣品，經(jīng)恒溫烘箱干燥至恒質(zhì)量，記錄每片樣品的恒質(zhì)量（M1）。

1.2.3 鈣含量測定和計算

樣品經(jīng)微波消解后，采用火焰原子吸收分光光度計測定樣品中鈣含量（M2）。

樣品中鈣元素的含量按式（1）計算：

其中：X 為樣品中鈣含量的質(zhì)量分數(shù)百分比，以% 表示；M2 為樣品中鈣的質(zhì)量，單位為微克（μg）；M1 為樣品的恒質(zhì)量，單位為毫克（mg）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

利用SPSS 21 軟件， 對過去12 次實驗中不同廠家的陽性對照樣品檢測結(jié)果進行非參數(shù)檢驗的單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗， 判斷是否符合正態(tài)分布。 如符合，則用正態(tài)分布法計算參考值范圍。

2 結(jié)果

2.1 陽性對照樣品鈣含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計

選取12 次實驗中植入8 周后的陽性對照樣品鈣含量數(shù)據(jù)共384 份，計算其最大值、最小值、均值、方差、變異系數(shù)（表1）。 用非參數(shù)檢驗的單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗法對所有陽性對照樣品鈣含量數(shù)值進行正態(tài)性檢驗分析， 得出其漸進顯著性（雙側(cè)）sig.=0.279（P ＞0.05），符合正態(tài)分布。

表1 陽性對照樣品鈣含量統(tǒng)計Tab.1 Statistics of calcium content in positive controls

2.2 陽性對照樣品數(shù)據(jù)計算結(jié)果

為了制作直方圖和正態(tài)分布圖，需要對384 份數(shù)據(jù)進行相關(guān)計算，具體計算結(jié)果：最大值29.8%，最小值6.3%，極差23.5%，分組數(shù)20，分組組距1.1，均值（）19.6%，標(biāo)準(zhǔn)差（s）4.3%。

2.3 陽性對照樣品直方圖、正態(tài)分布圖

計算陽性對照樣品中鈣含量的頻數(shù)，在Excel 軟件中制作頻數(shù)分布直方圖；計算鈣含量的正態(tài)分布曲線函數(shù)值，添加正態(tài)分布曲線，調(diào)整圖表形式，形成正態(tài)分布曲線圖[8]（圖1）。

2.4 陽性對照樣品鈣含量的正常參考值范圍

采用正態(tài)分布法計算參考值范圍，按其給定的百分范圍計算，計算公式見表2[8，9]。 參考值范圍取95%的概率為正常值參考區(qū)間，陽性對照樣品鈣含量的正常參考值范圍為11%～28%。

表2 醫(yī)學(xué)參考值范圍的正態(tài)分布計算公式Tab. 2 Normal distribution calculation formula of medical reference value range

3 討論

臨床分析表明，生物瓣植入年齡小的宿主體內(nèi)更易發(fā)生嚴(yán)重鈣化。 在生物瓣植入10 年內(nèi)，年齡＞65歲患者有不到10%的會發(fā)生瓣膜衰?。?而年齡＜35歲患者，在植入后5 年就會幾乎一致地出現(xiàn)嚴(yán)重的瓣膜衰敗狀況[10，11]。 同樣幼年動物普遍具有較高的鈣化敏感性，但動物個體仍然存在差異性，即使都是幼年動物，也有少數(shù)動物對鈣化不敏感。 筆者研究中的陽性對照樣品來自多個廠家，所采取的處理工藝也不盡相同，共同之處是都未經(jīng)抗鈣化處理。 筆者研究匯集了12 次檢驗中的陽性對照樣品384 個數(shù)據(jù)， 通過統(tǒng)計分析的方法驗證了其鈣含量數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)分布。 綜合考量大鼠模型的鈣化情況后，認為95%的概率范圍能較好地兼顧可信度和精確度[9]，故實驗中的參考值范圍取95%的概率為正常參考值區(qū)間，即陽性對照樣品的鈣含量的正常參考值范圍為11%～28%，與均值19.6%的出現(xiàn)區(qū)間相吻合。 設(shè)置陽性對照樣品的目的是為了排除對鈣化不敏感的動物個體，若動物對鈣化敏感性高，則陽性對照樣品鈣含量高，其檢測值可能會大于95%正常參考值區(qū)間的上限， 但這種個體更加有利于人們進行抗鈣化性能檢測，因此這種個體不應(yīng)被排除在外，陽性對照樣品只需設(shè)置鈣含量的下限參考值，該值的確定有助于對實驗體系的可靠性進行控制。 例如在進行抗鈣化評價實驗時，大鼠背部左右兩側(cè)分別植入陽性對照樣品和實驗樣品，如果陽性對照樣品鈣含量的值小于11%， 可以推測該動物不是對鈣化敏感的個體，則實驗樣品的檢測值可靠性就差，該動物個體就不是合格的實驗動物，該樣品的檢測結(jié)果應(yīng)該被排除。在筆者所在課題組起草的醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動物源性心血管植入物抗鈣化評價：大鼠皮下植入實驗》中，陽性對照樣品是未經(jīng)抗鈣化處理的生物材料，其目的是通過設(shè)立陽性對照樣品以獲得確定的陽性結(jié)果，以此來判定實驗體系的可靠性，陽性對照樣品下限值是該標(biāo)準(zhǔn)的一個重要技術(shù)參數(shù)，對制定該方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的制定具有重要意義。