石陽(yáng)陽(yáng)，徐敏，萬(wàn)勤，謝黛敏，肖笑，伍鈞*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130；2.湖北省丹江口市煙草專(zhuān)賣(mài)局，湖北 丹江口 442700）

重金屬鎘（Cd）具有移動(dòng)性強(qiáng)，毒性大，污染范圍廣的特點(diǎn)，其毒性是鉛（Pb）的5倍以上，被稱(chēng)為“五毒之首”[1-2]。礦山開(kāi)采、金屬冶煉、污水排放和灌溉等是環(huán)境Cd 污染的主要來(lái)源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Cd 污染已經(jīng)涉及我國(guó)11個(gè)省（市）的25個(gè)地區(qū)，Cd污染事件多達(dá)60多起[3]。因此，發(fā)展高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的Cd污染修復(fù)技術(shù)勢(shì)在必行。

微生物具有代謝旺盛、種類(lèi)豐富、比表面積大等特點(diǎn)，參與重金屬的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程，在重金屬元素的溶解釋放、遷移轉(zhuǎn)化和富集沉淀過(guò)程中起重要作用。微生物可以通過(guò)細(xì)胞表面豐富的活性基團(tuán)吸附Cd2+或分泌大量胞外聚合物，利用聚合物中的羧基、羥基、巰基、氨基、酰胺基和磷酸基等活性基團(tuán)中的 N、O、P 和 S 等提供的孤對(duì)電子與 Cd2+結(jié)合，使Cd2+被吸附或形成微沉淀[4-6]。一些微生物還能夠通過(guò)內(nèi)流的方式吸收Cd2+，并與胞內(nèi)的氨基酸或者蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成低毒絡(luò)合物富集在細(xì)胞內(nèi)[7-9]，或者通過(guò)生物礦化作用將Cd2+轉(zhuǎn)化為沉淀物，實(shí)現(xiàn)重金屬解毒[10-11]。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，微生物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、無(wú)二次污染的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生態(tài)效益和應(yīng)用前景，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注[6]。

微生物對(duì)Cd的固持效果和穩(wěn)定性取決于其作用機(jī)制，不同微生物與Cd 之間的相互作用具有復(fù)雜性和差異性。開(kāi)展Cd 耐受微生物資源的挖掘，并明確其Cd固持機(jī)制非常必要。本研究從冶煉廠廢棄地土壤中分離篩選出一株耐Cd 細(xì)菌菌株，初步鑒定為Delftia菌。Delftia菌屬 1999 年由 WEN 等[12]發(fā)現(xiàn)，目前主要應(yīng)用于降解有機(jī)污染物和修復(fù)重金屬污染。劉玉 玲等[1，13]和 LIU 等[14]研究 發(fā)現(xiàn)Delftiasp. B9 能 促使土壤中的Cd由弱酸可溶態(tài)轉(zhuǎn)化為可還原態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)，接種10 mL 菌懸液后土壤中弱酸可溶態(tài)Cd 含量降低25.1%[1]。Delftiasp. B9 可降低水稻幼苗根、莖、葉中的Cd 含量[13]，接種其活體菌株以及滅活菌體均能有效降低水稻籽粒的Cd 含量[14]。AMER 等[15]篩選分離出的Delftia acidovoransPb11 可利用Pb2+并將其還原為 Pb。BISWAS 等[16]報(bào)道了Delftiaspp.BAs29 對(duì)As（Ⅲ）的生物轉(zhuǎn)化，其可通過(guò)氧化酶將As（Ⅲ）氧化為較穩(wěn)定的As（Ⅴ），并利用氧化反應(yīng)釋放的能量維持生存。LI等[17]發(fā)現(xiàn)胞外蛋白在Au3+解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用，納米金顆粒可能是Delftia tsuruhatensissp.GX-3的胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白或孔蛋白將電子轉(zhuǎn)運(yùn)給Au3+形成。

然而目前關(guān)于Delftia對(duì)Cd 的解毒機(jī)制鮮有報(bào)道，基于此，本研究通過(guò)分析其對(duì)Cd最佳吸附條件及細(xì)胞內(nèi)外的Cd 分布，利用掃描電鏡、傅里葉變換-紅外光譜分析以及X射線光電子能譜分析，觀察細(xì)胞形態(tài)，分析Cd 處理后細(xì)胞表面官能團(tuán)的變化以及Cd 在菌體表面存在形態(tài)，以期為微生物修復(fù)Cd 污染技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤采自四川西部某鉛鋅冶煉廠廢棄地，采集深度為0~20 cm。采集樣點(diǎn)5個(gè)，分別標(biāo)記為S1~S5。采集的土樣裝入無(wú)菌自封袋，并置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。土壤pH及重金屬含量如表1所示。

表1 土壤pH和重金屬含量Table 1 pH and heavy metals content of soils

采用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌。LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.00 g·L-1、NaCl 10.00 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1，pH 7.0~7.2，高壓蒸汽滅菌121 ℃，30 min。LB 固體培養(yǎng)基則加入1.5%瓊脂粉，其他操作同液體培養(yǎng)基。試驗(yàn)藥品CdCl2·2H2O、HNO3、HClO4均為優(yōu)級(jí)純，試驗(yàn)用水均為高純水。

1.2 耐鎘菌株的分離與篩選

用CdCl2·2H2O 和高純水配制濃度為1 000 mg·L-1的Cd母液，取適量Cd母液加入液體LB 培養(yǎng)基，使Cd 濃度達(dá)到預(yù)設(shè)濃度。取Cd 濃度為10 mg·L-1的液體培養(yǎng)基45 mL 置于裝有玻璃珠的150 mL 錐形瓶中，滅菌后分別加入 S1~S5 土樣 5 g，在 30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d 后，移取5 mL 轉(zhuǎn)接入Cd 濃度為50 mg·L-1液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，并繼續(xù)轉(zhuǎn)接3 次，直至液體培養(yǎng)基中Cd 濃度為200 mg·L-1。取最后一次轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)液0.3 mL，以10倍比稀釋法稀釋后涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板上，并在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)96 h。觀察菌落生長(zhǎng)狀況和特點(diǎn)，挑選不同形態(tài)的單菌落提純，將得到的純菌種進(jìn)行保存。

將50 mL 無(wú)Cd 液體培養(yǎng)基置于150 mL 錐形瓶中，接種上述分離出的純菌株，30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)1 d 后在3 500 r·min-1下離心 10 min，收集菌體，用無(wú)菌水洗滌兩次后制成菌懸液（OD600=1.5）。按照2%接種比例將菌懸液接入初始Cd 濃度為10、50 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中，不接菌的處理作為空白對(duì)照，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng) 2 d 后于 4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，上清液經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾后用HNO3消解，ICP-MS（Agilent 7700s，美國(guó)安捷倫科技公司）測(cè)定Cd含量，篩選出Cd吸附效果最好的菌株。

1.3 菌株鑒定

將篩選得到的菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基平板上，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)。菌液送至成都擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。獲得的序列用NCBI-Blast 比對(duì)，利用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 培養(yǎng)條件對(duì)菌株Cd吸附效果的影響

1.4.1 菌株生長(zhǎng)曲線

將菌株接種至無(wú)Cd 液體LB 培養(yǎng)基，于30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng) 1 d 后，3 500 r·min-1離心 10 min 收集菌體，用無(wú)菌水洗滌兩次后制成菌懸液，按照2%接種比例將菌懸液接入初始Cd濃度為0、10、100 mg·L-1的液體LB 培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。在0~54 h 周期中，每隔3 h 取樣測(cè)定OD600，繪制不同Cd濃度下的生長(zhǎng)曲線。

1.4.2 pH對(duì)菌株Cd吸附效果的影響

將50 mL Cd濃度為10 mg·L-1的LB液體培養(yǎng)基置于150 mL 錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH 值分別為5、6、7、8、9，滅菌后按照2%接種比例接入菌懸液，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d后測(cè)定OD600并收集上清液，上清液收集及Cd含量測(cè)定方法同1.2。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.3 溫度對(duì)菌株Cd吸附效果的影響

將 50 mL 初始 Cd 濃度為 10 mg·L-1、pH 為 7 的液體培養(yǎng)基滅菌后按照2%比例接入菌懸液，分別在10、20、30、35、40 ℃，120 r·min-1下振蕩培養(yǎng)2 d 后測(cè)定OD600并收集上清液，上清液收集及Cd 含量測(cè)定方法同上。

1.4.4 初始Cd濃度對(duì)菌株Cd吸附效果的影響

按照2%比例接入菌懸液至Cd 濃度分別為10、50、100 mg·L-1，pH 為 7 的液體 LB 培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第18、24、36、48、72小時(shí)取樣，上清液收集及Cd含量測(cè)定方法同上。

1.5 菌株對(duì)Cd吸附機(jī)理研究

1.5.1 Cd在胞外與胞內(nèi)分布

30 ℃下將菌懸液按照2%比例接種于Cd 濃度為10、100 mg·L-1的50 mL 液體培養(yǎng)基中，120 r·min-1振蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第1、3、5 天取樣。樣品于4 ℃、8 000 r·min-1離心 10 min 后收集菌體。胞外 Cd 吸附量的測(cè)定參考喻涌泉等[18]和HAN等[19]的方法，將菌體用無(wú)菌水清洗 2~3 次，隨后用 10 mmol·L-1的 EDTA 洗滌液洗滌3 次。合并全部洗滌液，測(cè)定洗滌液中Cd含量，即胞外Cd吸附量。收集沉淀菌體，真空冷凍干燥后稱(chēng)質(zhì)量，用HNO3和HClO（43∶1）高溫消解后測(cè)定Cd含量，計(jì)算菌體胞內(nèi)Cd積累量。

1.5.2 掃描電鏡分析

將菌懸液按照2%比例分別接種到Cd 濃度為0、100 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中。30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d后收集菌體沉淀，方法同上。菌體用2.5%戊二醛固定，經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、臨界點(diǎn)干燥以及噴金等操作后用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SU8010，日本HITACHI公司）觀察Cd處理前后菌體形態(tài)特征。

1.5.3 傅里葉變換-紅外光譜分析

按照2%比例接種菌懸液于Cd 濃度為0、10、100 mg·L-1液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)及菌體收集方法同上，將收集到的菌體沉淀置于-80 ℃冰箱冷凍過(guò)夜后真空冷凍干燥。取干燥的菌粉與溴化鉀按照1∶50 質(zhì)量比在紅外燈下研磨壓片后用傅里葉紅外光譜分析儀（TENSOR 27，德國(guó)BRUKER 光譜儀器公司）分析菌體表面官能團(tuán)的變化。

1.5.4 X射線光電子能譜分析

按照2%比例將菌懸液接入Cd 濃度為100 mg·L-1的LB 液體培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)及菌體收集方法同上。將真空冷凍干燥后的菌體沉淀用X 射線光電子能譜儀[Thermo Fisher Scientific K-Alpha，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，采用SPSS 19.0 進(jìn)行顯著性分析，XPSPEAK41 軟件擬合XPS光譜，Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選與鑒定

通過(guò)富集培養(yǎng)、分離純化后得到14 株細(xì)菌，編號(hào)為M1~M14。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定液體培養(yǎng)基中Cd 剩余量發(fā)現(xiàn)，Cd濃度為10 mg·L-1時(shí)，菌株M6對(duì)Cd吸附效果最好，吸附率為70.5%，其次為M9，吸附率為57.6%，其他菌株對(duì)Cd吸附率較低，在13.4%~37.3%之間。當(dāng)提高Cd濃度至50 mg·L-1時(shí)，菌株Cd吸附率均下降，但M6 的Cd 吸附率依舊最高。根據(jù)Cd 吸附結(jié)果篩選出對(duì)Cd吸附效果最好的菌株M6進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

由圖1a和圖1b可知，菌株M6的菌落在固體培養(yǎng)基平板上呈乳白色，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，掃描電鏡圖中菌體呈桿狀。16S rRNA 序列對(duì)比結(jié)果如圖1c所示，M6 與菌株Delftiasp.12（KJ191561.1）的同源性達(dá)到100%，初步確定M6為Delftia菌。

圖1 菌株M6形態(tài)特征（a）、掃描電鏡圖（b）和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（c）Figure 1 Morphological characteristic of strain M6（a），scanning electron microscopy image（b），and phylogenetic tree of 16S rRNA（c）

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)菌株Cd吸附效果影響

2.2.1 菌株生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線能夠在一定程度上反映微生物生長(zhǎng)數(shù)量和生長(zhǎng)狀況。圖2 是菌株M6 在Cd 濃度分別為0、10、100 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。隨著Cd濃度提高，菌株在進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后的細(xì)胞密度均出現(xiàn)不同程度的降低，且高濃度Cd 使菌株生長(zhǎng)出現(xiàn)延滯。當(dāng)Cd 濃度為10 mg·L-1時(shí)，對(duì)M6 的生長(zhǎng)抑制作用較小。當(dāng)Cd 濃度為100 mg·L-1時(shí)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間比CK延長(zhǎng)9 h，穩(wěn)定期菌株生長(zhǎng)量降低。

圖2 菌株生長(zhǎng)曲線Figure 2 Growth curve of strain

2.2.2 培養(yǎng)pH、溫度、Cd濃度對(duì)Cd吸附效果的影響

培養(yǎng)pH、溫度、初始Cd 濃度對(duì)菌株M6 生長(zhǎng)及其Cd 吸附效果的影響分別如圖3a~圖3c 所示。由圖3a可知，pH 的變化顯著影響M6 對(duì)Cd 的吸附效果及其生長(zhǎng)狀況。在培養(yǎng)溫度為30 ℃、Cd 濃度為10 mg·L-1時(shí)，隨著pH 增加，菌株Cd 吸附量和細(xì)胞密度均表現(xiàn)為先增加后減少。pH小于7時(shí)，菌株M6對(duì)Cd的吸附量、吸附率和細(xì)胞密度隨pH 增高而增加，pH 大于7時(shí)，其隨pH 增加而下降，當(dāng)pH 為7 時(shí)吸附效果最佳，最大吸附率為68.4%。

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株Cd 吸附效果影響如圖3b 所示。Cd 濃度為 10 mg·L-1、pH 為 7 時(shí)，菌株細(xì)胞密度及 Cd吸附量隨著溫度升高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。在10~35 ℃范圍內(nèi)，菌株細(xì)胞密度及Cd吸附量隨著溫度升高而增高；溫度繼續(xù)升高時(shí)，細(xì)胞密度和Cd吸附量均下降。溫度范圍為30~35 ℃時(shí)菌株細(xì)胞密度較大，對(duì)Cd吸附效果較佳，最高吸附率為71.8%。

圖3 pH值、溫度和Cd濃度對(duì)菌株Cd吸附效果的影響Figure 3 Effects of pH，temperature and Cd concentration on strain growth and its Cd adsorption capacities

初始Cd 濃度對(duì)菌株Cd 吸附效果影響如圖3c 所示。培養(yǎng)溫度為 30 ℃、pH 為 7、初始 Cd 濃度由 10 mg·L-1升高至100 mg·L-1時(shí)，吸附達(dá)到穩(wěn)定所用時(shí)間由 36 h 延長(zhǎng)至 48 h。初始 Cd 濃度為 10 mg·L-1時(shí)，穩(wěn)定后的Cd吸附率最高，為71.3%。初始Cd濃度升高，Cd 吸附率降低，當(dāng) Cd 濃度升高至 50 mg·L-1時(shí)，吸附率下降至32.8%。Cd 濃度由10 mg·L-1增加至100 mg·L-1的過(guò)程中，菌株 M6 對(duì) Cd 的吸附量由 7.04 mg·L-1增加至36.73 mg·L-1。

2.3 菌株Cd吸附機(jī)制研究

2.3.1 菌株對(duì)Cd的胞外吸附與胞內(nèi)積累

為了探究菌株M6 對(duì)Cd 的固持機(jī)制，測(cè)定了Cd濃度為10 mg·L-1和100 mg·L-1培養(yǎng)下1、3、5 d時(shí)菌株胞外吸附量和胞內(nèi)積累量。由圖4 可知，相同培養(yǎng)時(shí)間下，隨著Cd 濃度提高，菌株Cd 吸附總量顯著增加。隨著時(shí)間的增加，胞內(nèi)Cd 積累量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)至第5 天時(shí)，胞外吸附量均顯著高于胞內(nèi)積累量。Cd濃度為100 mg·L-1時(shí)，胞外吸附量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，而總積累量卻呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

圖4 菌體胞內(nèi)Cd積累和胞外吸附情況Figure 4 Extracellular adsorption and intracellular accumulation of Cd in strain

2.3.2 掃描電鏡分析

圖5 為Cd 處理前后菌體電鏡掃描圖，Cd 處理前后M6 菌體形態(tài)有明顯變化。無(wú)Cd 處理組菌體形狀為桿狀，表面光滑；Cd 處理后，菌體表面變得粗糙。與無(wú)Cd 處理相比，Cd 處理后菌體表面出現(xiàn)顆粒狀沉淀物質(zhì)。

圖5 菌株在空白組（a）和100 mg·L-1 Cd處理組（b）的掃描電鏡圖Figure 5 SEM images of strain without（a）and with（b）100 mg·L-1 Cd treatment

2.3.3 傅里葉-紅外光譜分析

Cd 處理濃度為 0、10、100 mg·L-1的 FTIR 譜圖如圖6 所示。菌體表面具有豐富的官能團(tuán)，位于3 305 cm-1處較寬的吸收峰代表的振動(dòng)；2 960 cm-1和2 926 cm-1處吸收峰代表細(xì)胞膜磷脂脂肪酸中的伸縮振動(dòng)；1 655 cm-1和 1 543 cm-1處吸收峰代表酰胺Ⅰ帶和細(xì)胞蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶的彎曲振動(dòng)與伸展）；1 453 cm-1處吸收峰為肽鏈中面內(nèi)彎曲振動(dòng)；1 402 cm-1處吸收峰是蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶或肽鏈末端羧基對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)；1 239 cm-1處的吸收峰是脂質(zhì)和多糖的伸縮振動(dòng)峰；1 088 cm-1處吸收峰是磷酸基團(tuán)以及胺基中的等引起；659 cm-1處吸收峰代表蛋白質(zhì)酰胺帶；548 cm-1處吸收峰是和的振動(dòng)吸收峰。

圖6 菌株吸附Cd前后的傅里葉-紅外光譜圖Figure 6 The FTIR spectrograms of strain before and after adsorption of Cd

由圖6 可知，與無(wú)Cd 處理相比，接觸Cd 后位于659 cm-1處吸收峰增強(qiáng)變寬并逐漸向高波數(shù)偏移，Cd處理濃度為100 mg·L-1時(shí)峰位偏移至682 cm-1處，表明菌體中的蛋白質(zhì)酰胺帶可能參與了Cd 的吸附固定。另外，隨著Cd 濃度升高，位于548 cm-1處吸收峰變強(qiáng)，說(shuō)明Cd 處理使和基團(tuán)增加在結(jié)合Cd過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。其他吸收峰的變化體現(xiàn)在峰強(qiáng)逐漸減弱，高濃度Cd 處理后這些吸收峰的峰強(qiáng)明顯比無(wú)Cd 處理弱，說(shuō)明這些官能團(tuán)活躍地參與了Cd絡(luò)合作用。

2.3.4 X射線光電子能譜分析

為確定吸附Cd2+后菌體表面Cd形態(tài)，對(duì)菌體進(jìn)行掃描分析，M6吸附Cd2+后的XPS譜圖如圖7所示。

對(duì)O1s 峰進(jìn)行擬合，由圖7 可知，O1s 峰可分為2個(gè)亞峰，結(jié)合能為531.23 eV 處的譜峰代表532.67 eV 處的譜峰代表C1s 峰擬合后分成 3 個(gè)亞峰，分別位于 284.8、286.3 eV 和 287.8 eV處，284.8 eV 和 287.8 eV 處的譜峰代表長(zhǎng)鏈或可能與結(jié)合[22-23]，286.23 eV 處譜峰可能是化合物[24]。Cd3d5/2 譜峰包括位于404.8eV和405.6eV的2個(gè)亞峰，分別代表Cd（OH）2和說(shuō)明菌體表面可能存在Cd（OH）2和CdCO3沉淀。

圖7 菌株吸附Cd后的XPS譜圖Figure 7 XPS spectra of strain after Cd adsorption

3 討論

3.1 培養(yǎng)條件對(duì)菌株Cd吸附效果的影響

微生物對(duì)重金屬的吸附效果受其種類(lèi)、生長(zhǎng)狀況和培養(yǎng)環(huán)境的影響較大。為了探求菌株M6 最佳Cd吸附條件，本研究分析了pH、溫度、初始Cd濃度對(duì)Cd吸附效果的影響。環(huán)境pH 可以影響菌株的生長(zhǎng)、吸附電位的性質(zhì)以及重金屬在溶液中的存在形態(tài)，進(jìn)而影響菌株Cd 吸附效果[18]。pH 較低時(shí)，液體培養(yǎng)基中過(guò)多的H+會(huì)與Cd2+競(jìng)爭(zhēng)菌體表面吸附位點(diǎn)；pH 較高時(shí)，液體培養(yǎng)基中的Cd2+會(huì)以氫氧化物形式存在，附著在菌體表面，覆蓋部分吸附位點(diǎn)，從而降低菌體對(duì)Cd 的吸附量[1]。有研究表明，Delftiasp.最適生長(zhǎng)的pH 為7.0，pH 過(guò)低會(huì)降低菌株生長(zhǎng)量和Cd 吸附位點(diǎn)數(shù)量，使Cd 吸附量下降[26]。本研究中pH 低于7 和高于7 均不利于菌體生長(zhǎng)和Cd 吸附，當(dāng)pH 為7 時(shí)菌株生長(zhǎng)狀況最佳，Cd 吸附量顯著高于其他pH 處理，說(shuō)明最適宜M6 生長(zhǎng)和吸附Cd 的環(huán)境pH 為7。溫度不僅影響細(xì)胞表面官能團(tuán)的電離活性，而且影響官能團(tuán)與重金屬離子形成絡(luò)合物的穩(wěn)定性[18]。溫度過(guò)高和過(guò)低不僅不利于菌株生長(zhǎng)，而且會(huì)降低其表面官能團(tuán)與Cd2+的親和性以及吸附Cd2+過(guò)程中需要的活化能，進(jìn)而降低菌株的Cd吸附量[1，18]。本研究中M6在35 ℃時(shí)Cd吸附量最大，與劉玉玲等[1]的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd 濃度的提高，M6 的生長(zhǎng)出現(xiàn)遲滯，進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間延長(zhǎng)，且穩(wěn)定期細(xì)胞密度下降，說(shuō)明高濃度Cd 對(duì)M6 的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。整體而言，M6 的生長(zhǎng)及其對(duì)Cd 的吸附量仍較高，表明M6 對(duì)Cd 具有較強(qiáng)的耐受性。微生物吸附重金屬的能力與菌株表面吸附位點(diǎn)的飽和程度密切相關(guān)[27]。低濃度Cd對(duì)M6生長(zhǎng)的抑制作用較小，吸附位點(diǎn)數(shù)量較多且未達(dá)飽和狀態(tài)，能與液體培養(yǎng)基中的Cd2+充分結(jié)合，增加吸附量。當(dāng)Cd 濃度逐漸增加時(shí)，M6 對(duì)Cd的吸附量增加，但是吸附率卻下降，這可能是因?yàn)榫w表面吸附位點(diǎn)被大量的Cd2+占據(jù)，同時(shí)高濃度Cd抑制了M6的生長(zhǎng)，所提供的吸附位點(diǎn)數(shù)量減少。

3.2 菌株對(duì)Cd吸附機(jī)理

通過(guò)研究Cd 在菌體胞內(nèi)胞外的分布發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過(guò)程中，胞內(nèi)Cd積累量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，最終以胞外吸附為主。胞內(nèi)Cd積累量的變化趨勢(shì)與活細(xì)胞能將過(guò)多的金屬離子排出細(xì)胞質(zhì)的觀點(diǎn)相吻合，這可能是一種細(xì)胞解毒方式[18]。而通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸方式吸收Cd2+，將Cd2+轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的沉淀或隔離在胞內(nèi)特定區(qū)域以降低環(huán)境中Cd2+濃度，提高抗性則是胞內(nèi)解毒的重要途徑[9]。當(dāng)Cd 濃度為10 mg·L-1時(shí)，菌體Cd 積累總量隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，這可能是由于菌株生長(zhǎng)較快，消耗了培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使其生物量快速趨于穩(wěn)定，部分菌體出現(xiàn)了Cd2+解吸的現(xiàn)象，或者是其生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物及Cd對(duì)M6產(chǎn)生了毒害作用，降低了吸附量[28]。而高濃度Cd處理下，Cd積累總量卻表現(xiàn)為先增加后降低，這可能是由于Cd濃度較高時(shí)菌株生長(zhǎng)較慢，在菌株生物量逐漸增加至穩(wěn)定的過(guò)程中菌體Cd積累總量逐漸增加。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，高Cd處理下部分細(xì)胞破裂，胞內(nèi)積累的Cd釋放到培養(yǎng)液中，而其中只有一部分Cd被暴露的吸附位點(diǎn)或菌體表面吸附，從而導(dǎo)致后期菌體Cd積累總量降低。含Cd培養(yǎng)下M6菌體表面的不規(guī)則顆粒沉淀物可能是Cd對(duì)菌體造成的脅迫作用促使其產(chǎn)生了分泌物將Cd2+沉淀在細(xì)胞表面以降低其毒性[19，29]。這說(shuō)明胞外沉淀很可能是菌體對(duì)Cd固定的機(jī)制，也是其吸附Cd的重要原因。

傅里葉-紅外光譜分析官能團(tuán)變化發(fā)現(xiàn)，與無(wú)Cd處理相比，吸附Cd 后659 cm-1處吸收峰變寬變強(qiáng)、548 cm-1處吸收峰變強(qiáng)，這可能是因?yàn)楦邼舛菴d毒性較強(qiáng)且造成胞內(nèi)外滲透壓差異過(guò)大，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞暴露出更多活性基團(tuán)[30]。隨著Cd 濃度提高、細(xì)胞膜磷脂脂肪酸中的蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶、肽鏈中、蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶或肽鏈末端羧基、脂質(zhì)和多糖的、磷酸基團(tuán)以及胺基中的的作用增強(qiáng)，使代表這些基團(tuán)的吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱，說(shuō)明Cd濃度的提高增強(qiáng)了多種官能團(tuán)對(duì)Cd 的吸附作用，這與前人研究結(jié)果一致[29-32]。

目前微生物對(duì)Cd 固持機(jī)制主要有胞外吸附、胞內(nèi)富集、沉淀、誘導(dǎo)礦化等[18，29，33]。與胞外吸附和胞內(nèi)富集作用相比，沉淀和誘導(dǎo)礦化作用形成的化合物較穩(wěn)定[34]。部分微生物利用其表面的一些特殊的蛋白質(zhì)、官能團(tuán)或其代謝過(guò)程產(chǎn)生的分泌物對(duì)重金屬離子產(chǎn)生螯合作用或誘導(dǎo)產(chǎn)生固相礦物、沉淀，以降低其生物毒性[19，35-36]。前人研究表明，微生物對(duì)重金屬的固持可能是一種復(fù)雜的、多種反應(yīng)共同作用的過(guò)程[37]。菌株分泌物以及細(xì)胞表面官能團(tuán)在降低重金屬遷移性方面發(fā)揮著重要的作用。GUPTA 等[38]研究表明枯草芽孢桿菌螯合的Pb 中有8.5%通過(guò)物理作用固定在細(xì)胞壁，9.7%與細(xì)胞表面的官能團(tuán)絡(luò)合或在細(xì)胞表面沉淀。楊礴東[36]研究表明，菌Ⅰ對(duì)Cd固定部位以胞外為主，胞內(nèi)和細(xì)胞膜部位僅占22.09%和2.01%。菌體表面參與Cd 吸附固定的有OH、COOH、仲酰胺等基團(tuán)，X 射線光電子能譜分析發(fā)現(xiàn)菌體表面存在Cd（OH）2沉淀。目前關(guān)于Delftia對(duì)Cd 固持機(jī)制的研究較少，李楊等[4]研究表明，Delftia菌體表面的羧基和氨基參與Cd 和As 的絡(luò)合反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，分離出的菌株M6 對(duì)Cd 具有較好的吸附效果，其對(duì)Cd 的固持以胞外固定為主，固持機(jī)制包括胞內(nèi)積累、胞外吸附和胞外沉淀，菌體表面可能存在Cd（OH）2和CdCO3沉淀。

4 結(jié)論

（1）從重度Cd 污染土壤中分離篩選出1 株對(duì)液體培養(yǎng)基中Cd 吸附效果最佳的菌株，命名為M6，經(jīng)鑒定為Delftiasp.。其最佳吸附條件為溫度35 ℃、pH=7、培養(yǎng)時(shí)間 48 h，初始Cd 濃度為 10 mg·L-1時(shí)吸附率最高，為71.8%。