鄢麗敏, 李雪梅, 雷 沖, 閆繼東, 張志勇

(河北省唐山市工人醫(yī)院， 河北 唐山 063000)

2020年中國(guó)癌癥新發(fā)病例457萬例，肺癌位居第一位；同年，癌癥死亡人數(shù)300萬，其中肺癌死亡人數(shù)遙遙領(lǐng)先，高達(dá)71萬，占癌癥死亡總數(shù)的23.8%[1]。我國(guó)非小細(xì)胞肺癌(Non small cell lung carcinoma,NSCLC)的治療已逐步從傳統(tǒng)放化療手段向分子靶向及免疫治療的方向發(fā)展，表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的肺癌驅(qū)動(dòng)基因，EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是EGFR突變型NSCLC患者的精準(zhǔn)治療手段[2]。程序性死亡配體1(Programmed cell death-ligand 1,PD-L1)可與T細(xì)胞表面程序性死亡受體1(Programmed cell deaths 1,PD-1)結(jié)合，從而抑制活性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視。以PD-L1為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(mune checkpoint inhibitors，ICIs)在NSCLC治療中取得突破性進(jìn)展，但國(guó)外相關(guān)研究卻顯示ICIs對(duì)EGFR突變型NSCLC患者的治療效果并不理想[3,4]。本研究通過分析PD-L1表達(dá)強(qiáng)度與EGFR基因突變率的關(guān)系和PD-L1表達(dá)與EGFR基因突變狀態(tài)之間的相關(guān)性，以期找到EGFR突變型NSCLC免疫治療效果差的原因，為EGFR突變型NSCLC患者的精準(zhǔn)診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集唐山市工人醫(yī)院病理科2020年至2021年二年間行EGFR基因突變檢測(cè)及PD-L1免疫組化染色NSCLC病例共308例，其中包括肺腺癌299例、鱗癌7例、腺鱗癌2例。

1.2PD-L1(22C3)免疫組化染色：石蠟標(biāo)本制成4μm切片，鼠抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號(hào)22C3)購自美國(guó)丹科北美有限公司(Dako North American,Inc)，經(jīng)Dako抗體稀釋液稀釋，工作濃度1∶50，以正常扁桃體組織作為陽性對(duì)照，以PBS代替PD-L1抗體作為陰性對(duì)照。

1.3PD-L1(22C3)判讀標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)整張切片通過腫瘤比例評(píng)分(Tumor Proportion Score,TPS)進(jìn)行整體評(píng)定，任意強(qiáng)度的部分或完全腫瘤細(xì)胞膜染色判定為陽性細(xì)胞。TPS=PD-L1染色陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)量/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100。根據(jù)TPS得分分組：TPS<1%為陰性，1%≤TPS<10%為弱陽性，10%≤TPS<50%為中等陽性，TPS≥50%為強(qiáng)陽性；將PD-L1陰性及弱陽性表達(dá)劃分為低表達(dá)組，將中等陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)劃分為高表達(dá)組。

1.4EGFR基因檢測(cè)：EGFR基因突變檢測(cè)在我院病理科分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)方法對(duì)EGFR基因的18～21號(hào)外顯子的41種突變類型進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)選用美國(guó)羅氏(Cobas EGFR Mutation Test V2)檢測(cè)試劑盒，操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，應(yīng)用陰性、陽性及空白對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。所有標(biāo)本檢測(cè)前均進(jìn)行石蠟包埋切片，并HE染色，進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞含量，確保每例標(biāo)本細(xì)胞含量≥100。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PD-L1表達(dá)情況EGFR基因突變之間的差異性比較采用pearson's χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；PD-L1表達(dá)與EGFR基因突變類型之間的差異性比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。設(shè)定P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果：308例研究對(duì)象中有186例存在EGFR基因突變(突變率60.39%)，其中21外顯子L858R點(diǎn)突變95例(占突變例數(shù)的51.08%)，19外顯子缺失突變73例(占突變例數(shù)的39.25%)，20外顯子插入突變6例，21外顯子L861Q點(diǎn)突變5例，18外顯子G719X點(diǎn)突變2例，21外顯子L859R點(diǎn)突變1例，同時(shí)含上述兩種突變者4例。見圖1。

2.2PD-L1(22C3)表達(dá)結(jié)果：308例研究對(duì)象中，PD-L1表達(dá)結(jié)果陰性108例(占病例總數(shù)的35.06%)，弱陽性106例(占病例總數(shù)的34.42%)，中等陽性60例(占病例總數(shù)的19.48%)，強(qiáng)陽性34例(占病例總數(shù)的11.04%)。見圖2。

2.3PD-L1(22C3)表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性：PD-L1陰性、弱陽性、中等陽性和強(qiáng)陽性的病例EGFR突變率分別為71.30%、57.55%、50.00%、44.12%，PD-L1表達(dá)強(qiáng)度與EGFR基因突變率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)，并且PD-L1表達(dá)強(qiáng)度與EGFR突變率之間呈現(xiàn)較弱的負(fù)相關(guān)性(r=-0.176，P=0.002)，見表1。EGFR突變型中，PD-L1低表達(dá)率和高表達(dá)率分別為74.19%和25.81%，EGFR野生型中PD-L1低表達(dá)率和高表達(dá)率分別為62.30%和37.70%，EGFR基因狀態(tài)與PD-L1表達(dá)強(qiáng)度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)。見表2。

表1 PD-L1(22C3)表達(dá)強(qiáng)度與EGFR基因突變的關(guān)系

表2 EGFR基因狀態(tài)與PD-L1(22C3)表達(dá)的關(guān)系

圖1 EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果

圖2 PD-L1染色強(qiáng)度TPS評(píng)分分級(jí)(IHC×200)

2.4EGFR基因突變類型與PD-L1(22C3)表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系:186例EGFR突變的病例中，21外顯子L858R點(diǎn)突變95例，19外顯子缺失突變73例，其余罕見位點(diǎn)突變及雙基因突變18例，EGFR基因突變類型與PD-L1表達(dá)強(qiáng)度之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.251)。見表3。

表3 EGFR基因突變類型與PD-L1(22C3)表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系

3 討 論

EGFR是最重要的肺癌驅(qū)動(dòng)基因，其產(chǎn)物通過細(xì)胞外表皮生長(zhǎng)因子的作用，使得下游靶點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，進(jìn)而促使腫瘤發(fā)生。針對(duì)EGFR的靶向治療應(yīng)用于臨床并延長(zhǎng)了NSCLC患者的生存期[2]。PD-L1可與T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。一些腫瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)PD-L1表達(dá)上調(diào)，抑制活性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視。靶向抑制PD1與PD-L1免疫檢查點(diǎn)，能夠活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，是近年來肺癌治療領(lǐng)域的新突破。但國(guó)外相關(guān)研究卻顯示ICIs對(duì)EGFR突變型NSCLC患者的治療效果并不理想[3,4]。

Takada等[5]回顧性分析了441例手術(shù)切除的原發(fā)性肺腺癌PD-L1表達(dá)與EGFR基因突變的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR突變的患者PD-L1表達(dá)率增高，但是EGFR突變位點(diǎn)與PD-L1表達(dá)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)。Azuma等[6]通過免疫組化染色分析并評(píng)估了164例手術(shù)切除的NSCLC樣本，結(jié)果顯示，EGFR突變與PD-L1表達(dá)有顯著相關(guān)性。EGFR突變型NSCLC比EGFR野生型NSCLC表達(dá)更高的PD-L1,且EGFR突變是導(dǎo)致PD-L1表達(dá)上調(diào)的獨(dú)立因素。Ota研究團(tuán)隊(duì)[7]通過RT-PCR及流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)EGFR突變細(xì)胞系(HCC827、H1975、PC-9、11-18、H1650)及野生型細(xì)胞系(H322、A549、1-87、LK87、H23、H2122、H1437、H1573、H1944、H157、H596、H460、H1299)的PD-L1mRNA以及PD-L1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)EGFR突變型細(xì)胞系PD-L1 mRNA以及蛋白表達(dá)均高于野生型。Song等[8]對(duì)385例肺腺癌PD-L1的表達(dá)情況進(jìn)行研究，將腫瘤細(xì)胞TPS≥5%視為陽性cut off值，該研究發(fā)現(xiàn)205例EGFR突變患者中，112例(54.6%)PD-L1表達(dá)陽性；180例EGFR野生型患者中74例(41.1%)表達(dá)陽性(P=0.008)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在385例患者中有24例存在基因突變共表達(dá)的情況，且共突變比單基因突變對(duì)PD-L1陽性表達(dá)的影響更大(P<0.001)。

本文分析了308例同時(shí)行EGFR基因突變和PD-L1免疫組化檢測(cè)的NSCLC病例，將PD-L1免疫表達(dá)根據(jù)TPS評(píng)分分為陰性(TPS<1%)、弱陽性(1%≤TPS<10%)、中等陽性(10%≤TPS<50%)、強(qiáng)陽性(TPS≥50%)四組，發(fā)現(xiàn)隨著PD-L1表達(dá)的加強(qiáng)，EGFR突變率呈現(xiàn)一個(gè)逐步下降的趨勢(shì)(71.30% vs 57.55% vs 50.00% vs 44.12%)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析PD-L1表達(dá)強(qiáng)度與EGFR突變率之間有顯著相關(guān)性(P=0.017)，并且二者之間呈現(xiàn)較弱的負(fù)相關(guān)性(r=-0.176，P=0.002)，也就是說PD-L1表達(dá)越強(qiáng)，EGFR的突變率越低。此外，將PD-L1陰性或弱陽性表達(dá)劃分為低表達(dá)組，將PD-L1中等陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)劃分為高表達(dá)組，EGFR突變型中低表達(dá)組占74.19%、高表達(dá)組占25.81%，野生型中PD-L1低表達(dá)組和高表達(dá)組分別占62.30%和37.70%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析EGFR基因突變狀況與PD-L1表達(dá)水平高低之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EGFR突變型NSCLC患者中PD-L1更傾向于低表達(dá)。我們的研究結(jié)果與Takada[5]、Azuma[6]、Song[8]等的研究結(jié)果略有不同，分析可能是由于我們的研究沒有把PD-L1的表達(dá)結(jié)果簡(jiǎn)單的區(qū)分為陰性或陽性，而是分為陰性、弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性四等級(jí)分組來觀察PD-L1蛋白表達(dá)與EGFR基因突變率的相關(guān)性；又根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度不同劃分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，來觀察EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系。我們的研究結(jié)果更能詳盡的分析EGFR基因狀態(tài)與PD-L1表達(dá)強(qiáng)度之間的關(guān)系，對(duì)解釋ICIs對(duì)EGFR突變型NSCLC治療效果不理想的現(xiàn)象更具有說服力。EGFR突變型NSCLC患者的治療應(yīng)以EGFR-TKIs或EGFR-TKIs聯(lián)合化療為主。

308例研究對(duì)象中，有186例存在EGFR基因突變，其中95例為21外顯子L858R基因突變，73例為19外顯子缺失基因突變73例，18例為罕見位點(diǎn)突變或雙基因突變。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)強(qiáng)弱與EGFR基因突變類型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.251)，PD-L1表達(dá)強(qiáng)弱與EGFR基因突變類型之間無相關(guān)性，與以往研究結(jié)果相同。

綜上所述，通過我們的分析發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)強(qiáng)度與EGFR突變率之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，PD-L1表達(dá)越強(qiáng)，EGFR的突變率越低；EGFR突變型NSCLC患者PD-L1更傾向于低表達(dá)，這也解釋了EGFR突變NSCLC患者的ICIs免疫治療效果不理想的原因。但是PD-L1表達(dá)強(qiáng)弱與EGFR基因突變類型之間無相關(guān)性。