王正君， 白馬恒

(1.陜西省榆林市急救指揮調(diào)度中心業(yè)務(wù)科, 陜西 榆林 7190002.陜西省榆林市星元醫(yī)院骨科， 陜西 榆林 719000)

骨質(zhì)疏松癥是一種常見全身性骨骼疾病，多發(fā)于老年人群，其特征包括骨量減少、骨脆性增加、骨組織結(jié)構(gòu)退化等[1]。在我國，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢，在常見病中位居第5[2]。近年基于微小核糖核酸(miRNA)的靶向基因療法在骨骼相關(guān)疾病中顯示出良好的開發(fā)前景。miR-106b可調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，在骨骼代謝中發(fā)揮重要作用。既往研究證實[3]，核因子κB受體激活因子配體(RANKL)/核因子κB受體激活因子(RANK)/骨保護(hù)素(OPG)信號通路可調(diào)節(jié)骨吸收與骨生成的平衡，且此通路的異常激活與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)研究報道[4]，miR-106b可通過下調(diào)軟骨細(xì)胞丙酮酸脫氫酶激酶(PDK4)表達(dá)，影響RANKL/RANK/OPG通路，但其是否可直接調(diào)控RANKL/RANK/OPG通路抗骨質(zhì)疏松癥尚不明確。本研究通過建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，探討miR-106b介導(dǎo)RANKL/RANK/OPG通路對骨質(zhì)疏松癥的治療作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和細(xì)胞：Wistar雌性大鼠70只，6月齡，體質(zhì)量(280±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]。遵循減少、替代和優(yōu)化原則設(shè)計實驗。人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑和儀器：miR-106b mimics-NC、miR-106b mimics、miR-106b inhibitor-NC和miR-106b inhibitor均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司(貨號：15596026)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：G1120)；兔抗鼠RANKL、RANK、OPG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，二抗均購自美國Thermo Fisher公司(貨號：PA5-110268，PA5-80144，PA5-86053，PA1-16777；31460，G-21234，65-6120，32460)；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司(貨號：E1910)；RAD SPEED-M型X線機(jī)購自日本株式會社島津制作所；Axio Imager 2光學(xué)顯微鏡購自北京普瑞賽司儀器有限公司；JC-TG-16R臺式離心機(jī)購自青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；C1000 Touch熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀購自美國Bio-Rad公司；Mini-PROTEAN?蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1建模、分組和轉(zhuǎn)染:取60只Wistar大鼠，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥鈉致其麻醉。沿大鼠腰背椎側(cè)正中切口，切除雙側(cè)卵巢；另10只大鼠僅切除卵巢旁脂肪組織作為假手術(shù)組[5]。正常飼養(yǎng)8周后，造模大鼠陰道涂片檢查未見成熟脫落上皮細(xì)胞，且無規(guī)律動情變化，X線片顯示股骨骨質(zhì)變薄，骨紋理稀疏，提示骨質(zhì)疏松癥大鼠模型建立成功。51只大鼠建模成功，成功率85%。建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(11只)、miR-106b mimics-NC組(10只)、miR-106b mimics組(10只)、miR-106b inhibitor-NC組(10只)、miR-106b inhibitor組(10只)。除模型組外其余各組分別轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物陰性對照、miR-106b模擬物、miR-106b抑制劑陰性對照和miR-106b抑制劑，具體轉(zhuǎn)染方法：建模成功7d后向大鼠皮下注射對應(yīng)的200μL含轉(zhuǎn)染試劑的核酸溶液，每周1次，連續(xù)4周。

1.3.2X線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度:采用雙能X線骨密度儀，掃描大鼠兩側(cè)股骨，測骨密度。

1.3.3HE染色觀察大鼠右側(cè)股骨組織病理學(xué)變化:頸椎脫臼法處死大鼠，分離大鼠右側(cè)股骨組織，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、脫蠟，蘇木素、伊紅依次染色，脫水、透明、封片，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.3.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測大鼠右側(cè)股骨組織miR-106b表達(dá)、RANKL、RANK、OPG信使核糖核酸(mRNA)表達(dá):取大鼠右側(cè)股骨組織，Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，反應(yīng)體系20μL。反應(yīng)程序：94℃ 5min，94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 45s，45個循環(huán)。miR-106b檢測以U6為內(nèi)參，RANKL、RANK和OPG檢測以GAPDH為內(nèi)參。2-△△Ct法計算各基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.3.5免疫印跡(WB)檢測大鼠右側(cè)股骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá):取大鼠右側(cè)股骨組織，提取總蛋白，蛋白變性，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗4℃孵育過夜，洗膜，加二抗室溫孵育1h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光液顯影。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-106b和RANKL的靶向關(guān)系:Target scan網(wǎng)站預(yù)測miR-106b和RANKL的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建插入野生型(WT)、突變型(Mut)RANKL的雙熒光素酶報告質(zhì)粒，將報告質(zhì)粒與miR-106b mimics或miR-106b mimics-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測試劑盒測內(nèi)參基因、報告基因發(fā)光值。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠股骨骨密度:轉(zhuǎn)染期間各組大鼠均未發(fā)現(xiàn)排異反應(yīng)。與假手術(shù)組比，模型組股骨骨密度降低(P<0.05)；與miR-106b mimics組比，模型組、miR-106b mimics-NC組股骨骨密度下降(P<0.05)；與模型組、miR-106b inhibitor-NC組比，miR-106b inhibitor組股骨骨密度降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度比較

2.2各組大鼠右側(cè)股骨組織病理學(xué)變化:假手術(shù)組骨小梁排列緊密、厚度均勻。模型組、miR106b mimics-NC組、miR106b inhibitor-NC組骨細(xì)胞數(shù)明顯減少，骨小梁間隙較大，排列紊亂。miR106b mimics組骨細(xì)胞數(shù)明顯增多，排列較緊密，骨小梁厚度增加。miR106b inhibitor組骨細(xì)胞數(shù)缺失，骨小梁間隙極大，排列紊亂。見圖1。

圖1 大鼠右側(cè)股骨組織HE染色(×200)

2.3各組大鼠右側(cè)股骨組織miR-106b表達(dá)、RANKL、RANK、OPG mRNA表達(dá):與假手術(shù)組比，模型組右側(cè)股骨組織RANKL mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，miR-106b表達(dá)和OPG mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組、miR-106b mimics-NC組比，miR-106b mimics組右側(cè)股骨組織RANKL mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，miR-106b表達(dá)和OPG mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、miR-106b inhibitor-NC組比，miR-106b inhibitor組右側(cè)股骨組織RANKL mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，miR-106b表達(dá)和OPGmRNA表達(dá)降低(P<0.05)；各組大鼠右側(cè)股骨組織RANK mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠右側(cè)股骨組織RANKL RANK OPG mRNA表達(dá)

2.4各組大鼠右側(cè)股骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá):與假手術(shù)組比，模型組右側(cè)股骨組織RANKL蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，OPG蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組、miR-106b mimics-NC組對比，miR-106b mimics組右側(cè)股骨組織RANKL蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，OPG蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、miR-106b inhibitor-NC組比，miR-106b inhibitor組右側(cè)股骨組織RANKL蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，OPG蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；各組大鼠右側(cè)股骨組織RANK蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠右側(cè)股骨組織RANKL RANK OPG蛋白表達(dá)

2.5雙熒光素酶報告基因驗證miR-106b和RANKL靶向關(guān)系:Target scan網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，miR-106b可以結(jié)合RANKL的3'-UTR區(qū)域，見圖2A。在轉(zhuǎn)染野生型RANKL細(xì)胞中，miR-106b mimics組細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于miR-106b mimics-NC組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在轉(zhuǎn)染突變型RANKL細(xì)胞中，miR-106b mimics組和miR-106b mimics-NC組細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2B。

圖2 A miR-106b和RANKL靶向關(guān)系；B雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C結(jié)果

與miR-106b mimics-NC組比，*P<0.05

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生涉及年齡、遺傳因素、性別、女性絕經(jīng)、激素、生活方式及營養(yǎng)狀態(tài)等因素[6]。正常的骨代謝依賴于骨重建平衡，骨吸收增加或骨形成減少均引起骨量丟失、骨強(qiáng)度不足，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[7]。因此，研究骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)、新療法具有重要意義。

miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與多種生理、病理過程[8]。Ménard C等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b可抑制病理性視網(wǎng)膜血管生成。Yu B等[10]研究表明，抑制miR-106b表達(dá)可抑制磨損碎片誘導(dǎo)的大鼠假體周圍骨溶解的炎性骨破壞。本研究建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，為觀察miR-106b過表達(dá)、miR-106b低表達(dá)對骨質(zhì)疏松的影響設(shè)置miR-106b mimics組、miR-106b inhibitor組，同時為避免干擾因素的影響另設(shè)置miR-106b mimics-NC組、miR-106b inhibitor-NC組；各組轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)miR-106b mimics組miR-106b表達(dá)最高，假手術(shù)組miR-106b表達(dá)次之，模型組、miR-106b mimics-NC組、miR-106b inhibitor-NC組表達(dá)稍低，miR-106b inhibitor組表達(dá)最低，證實轉(zhuǎn)染成功；miR-106b mimics組大鼠股骨骨密度升高，骨細(xì)胞數(shù)增多，排列緊密，骨小梁厚度增加；miR-106b inhibitor組大鼠股骨骨密度降低，骨細(xì)胞數(shù)缺失，排列紊亂，骨小梁間隙較大，提示miR-106b可增加骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨骨密度，減輕右側(cè)股骨組織病理損傷。

RANKL是破骨前體細(xì)胞分化、成熟的必需因子，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞凋亡[11]。OPG是調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵因子。RANKL通過與破骨前體細(xì)胞、破骨細(xì)胞膜受體RANK結(jié)合，發(fā)揮加快骨質(zhì)吸收、溶解的作用；同時，成骨細(xì)胞分泌OPG，與RANK競爭性結(jié)合RANKL，抑制破骨前體細(xì)胞分化、成熟，降低破骨細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成間的平衡[12]。Wang X等[13]研究表明，香葉甲素可通過調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG信號通路對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠發(fā)揮骨保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，miR-106b mimics組大鼠右側(cè)股骨組織RANKL mRNA、蛋白表達(dá)降低，OPG mRNA、蛋白表達(dá)升高；miR-106b inhibitor組大鼠右側(cè)股骨組織RANKL mRNA、蛋白表達(dá)降低，OPG mRNA、蛋白表達(dá)升高；雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示miR-106b直接靶向RANKL。上述結(jié)果提示miR-106b可靶向調(diào)控RANKL的表達(dá)，從而抑制RANKL/RANK/OPG信號通路。而關(guān)于miR-106b靶向RANKL通路影響成骨細(xì)胞增殖和分化的結(jié)論已有文獻(xiàn)資料報道[14]證實，本研究結(jié)果與上述報道一致，再次證實miR-106b可直接靶向RANKL從而可以防治骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述，上調(diào)miR-106b表達(dá)可增加骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨骨密度，減輕右側(cè)股骨組織病理損傷，可能與抑制RANKL表達(dá)，促進(jìn)OPG表達(dá)有關(guān)，為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療研究提供了新思路。