付堂清， 李文忠， 羅仕云， 師 路， 杜鎮(zhèn)鴻

(三六三醫(yī)院胸外科， 四川 成 都 610041)

食道癌(Esophageal cancer，EC)，也被稱為食管癌，是一種惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高[1]。鱗狀細(xì)胞癌和腺癌是EC的兩種主要的組織病理亞型[2]。關(guān)于食管癌的各種治療策略已被開發(fā)，包括內(nèi)窺鏡技術(shù)、外科治療、全身化療和免疫療法[3,4]。近年來的研究強(qiáng)調(diào)了分子靶點(diǎn)在EC個(gè)體化治療和早期診斷中的重要意義。非編碼RNA(ncRNAs)包括非編碼環(huán)狀RNA(circRNAs)和microRNAs(miRNAs)是當(dāng)前EC研究的熱點(diǎn)。CircRNAs可以特異性結(jié)合miRNAs，從而發(fā)揮基因的間接調(diào)控作用，促進(jìn)或抑制EC的進(jìn)展。例如，circ_0023397通過靶向miR-106b抑制EC細(xì)胞的增殖[5]，而circ_0004370/miR-1294/LASP1軸被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)EC的發(fā)育過程[6]。據(jù)報(bào)道，hsa_circ_0005273(circPTK2)在結(jié)直腸癌中作為腫瘤啟動(dòng)子[7]，而hsa_circ_0008305(circPTK2)在非小細(xì)胞肺癌中作為腫瘤抑制子[8]。盡管circPTK2在多種癌癥中的生物學(xué)功能已被證實(shí)，但circPTK2在EC中的具體作用仍不清楚。miR-619-5p已被證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌[9]的腫瘤抑制因子，但是miR-619-5p在EC中的表達(dá)和作用尚不明確。本研究將主要研究circPTK2和miR-619-5p在EC中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制，為腫瘤發(fā)生機(jī)制提供更深層次的理解，并為EC的治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：circPTK2的小干擾RNA(si-circPTK2)和siRNA陰性對(duì)照(si-NC)、miR-619-5p mimic(miR-619-5p)和陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-619-5p inhibitor(anti-miR-619-5p)和陰性對(duì)照(anti-NC)、慢病毒包被的circPTK2質(zhì)粒(LV-circPTK2)和陰性對(duì)照(LV-NC)、circPTK2的短發(fā)夾RNA(sh-circPTK2)和陰性對(duì)照(sh-NC)、生物素偶聯(lián)miR-619-5p mimic(Bio-miR-619-5p)和陰性對(duì)照(Bio-miR-NC)均購自RIBOBIO。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Sigma-Aldrich；Lipofectamine 3000試劑、TRIzol購自美國Invitrogen公司；SuperScriptTM IV第一鏈合成系統(tǒng)、SYBR Green一步法qPCR試劑盒、鏈霉親和素磁珠購自美國Thermo Fisher公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)盒-8(CCK-8)購自北京科碩生物技術(shù)有限公司；Transwell室購自美國康寧公司；RIPA裂解緩沖液購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；一抗anti-E-cadherin、anti-N-cadherin、anti-Vimentin、anti-GAPDH和山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗、ECL Western Blotting底物試劑盒購自美國ABCam公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自翌圣生物公司。酶標(biāo)儀購自美國伯樂公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus。

1.2組織獲取和細(xì)胞培養(yǎng)：51例EC患者在本院接受手術(shù)治療。接受化療、放療或其他治療的患者被排除在本研究之外。收集的EC組織(n=51)和正常的癌旁組織(n=51)保存在-80℃。已獲得所有EC患者的書面知情同意書。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人食管上皮細(xì)胞系(HEEC)和EC細(xì)胞系(OE19、KYSE-450、KYSE-520和TE-13)購自北納生物。RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清以維持上述細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2的潮濕空氣中。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組：使用20nmoL/L的siRNA或抑制劑和50nmoL/L的模擬物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將TE-13細(xì)胞接種于96孔板過夜，然后用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染1.1中的寡核苷酸或載體，并分組為對(duì)照組、si-NC、si-circPTK2組、miR-NC組、miR-619-5p組、si-circPTK2+anti-NC組和si-circPTK2+anti-miR-619-5p組。

1.4qRT-PCR檢測(cè)EC組織和細(xì)胞內(nèi)circPTK2和miR-619-5p的表達(dá)：用TRIzol試劑從組織和細(xì)胞中純化RNA。通過SuperScript IVSuperScriptTM IV第一鏈合成系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)使用說明采用SYBR Green一步法qPCR試劑盒進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)。引物序列為：circPTK2為5’-AATGCCTGTGAACCCATAGTG-3’(正向引物)和5’-CTGACAGCATGAGCATCCCT-3’(反向引物)；miR-619-5p為5’-GGGGGTCCCCGGTGCT-3’(正向引物)和5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’(反向引物)；GAPDH為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(正向引物)和5’-GAGATGGTGATGGGATTTC-3’(反向引物)；U6為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’(正向引物)和5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’(反向引物)。GAPDH作為circPTK2的內(nèi)參。U6為miR-619-5p的內(nèi)參。最后，用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析。

1.5CCK-8評(píng)估TE-13細(xì)胞活力：TE-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，96孔板每孔移入10μL CCK-8試劑；4h后，在酶標(biāo)儀上450nm處檢測(cè)吸光度，以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度百分比表示細(xì)胞活力(%)。

1.6Transwell檢測(cè)TE-13細(xì)胞侵襲、遷移：上室接種1×104個(gè)TE-13細(xì)胞(轉(zhuǎn)染24h后)，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，24h后小心擦去未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色。Transwell上腔涂布基質(zhì)后進(jìn)行細(xì)胞侵襲檢測(cè)；將1×105個(gè)TE-1細(xì)胞接種到上腔室，按照遷移試驗(yàn)的步驟進(jìn)行后續(xù)處理。倒置顯微鏡下保存100倍鏡下細(xì)胞圖像，計(jì)數(shù)遷移或侵襲細(xì)胞。

1.7Western blot檢測(cè)EC組織和細(xì)胞內(nèi)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)：用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液提取總蛋白；用SDS-PAGE分離40μg總蛋白，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶孵育膜，以阻止非特異性蛋白信號(hào)之間的結(jié)合，然后在4℃條件下孵育一抗過夜。使用的一抗如下：anti-E-cadherin、anti-N-cadherin、anti-Vimentin、anti-GAPDH。將PVDF膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗在室溫下孵育；1h后，使用ECL Western Blotting底物試劑盒顯影。用Image Lab軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)circPTK2與miR-619-5p的關(guān)系：將含有miR-619-5p結(jié)合位點(diǎn)的circPTK2 3’-非翻譯區(qū)(3’ UTR)的序列克隆到基礎(chǔ)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-control中，構(gòu)建野生型熒光素酶質(zhì)粒。野生型熒光素酶質(zhì)粒命名為WT-circPTK2。此外，突變體circPTK2 3’ UTR序列(包含miR-619-5p結(jié)合的突變位點(diǎn))被插入到pGL3-control中，以產(chǎn)生突變型(MUT)熒光素酶質(zhì)粒(MUT-circPTK2)。TE-13細(xì)胞分別用上述質(zhì)粒與miR-NC或miR-619-5p在37℃下轉(zhuǎn)染48h。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶活性。

1.9生物素偶聯(lián)miRNA pull-down試驗(yàn)：分別將Bio-miR-619-5p和Bio-miR-NC轉(zhuǎn)染TE-13細(xì)胞48h后，將細(xì)胞裂解，在4℃條件下與鏈霉親和素磁珠孵育16h，提取磁珠結(jié)合的總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)circPTK2的相對(duì)水平。

1.10荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)觀察TE-13細(xì)胞在體內(nèi)的抗瘤能力：將6周齡雄性BALB/c裸鼠，購自長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SYXK(吉)2017-0005。實(shí)驗(yàn)分為5組(每組6只)：對(duì)照組、sh-NC組、sh-circPTK2組、sh-circPTK2+anti-NC組、sh-circPTK2+anti-miR-619-5p組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-NC、sh-circPTK2、sh-circPTK2+anti-NC、sh-circPTK2+anti-miR-619-5p后，將1×106個(gè)TE-13細(xì)胞重懸于100μL磷酸鹽緩沖液中，皮下注射裸鼠。每周用數(shù)字卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，腫瘤體積計(jì)算公式為：長(zhǎng)×寬2×0.5。5周后處死裸鼠，用電子秤稱腫瘤重量。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。裸鼠的所有實(shí)驗(yàn)均符合美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

2 結(jié) 果

2.1circPTK2和miR-619-5p在EC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)：與正常的癌旁組織和HEEC細(xì)胞相比，circPTK2水平在51個(gè)EC組織和4個(gè)細(xì)胞系(OE19、KYSE-450、KYSE-520、TE-13)中明顯升高，miR-619-5p在51個(gè)EC組織和4個(gè)細(xì)胞系(OE19、KYSE-450、KYSE-520、TE-13)中明顯降低(P<0.05)，見表1、表2。后續(xù)研究采用TE-13細(xì)胞(circPTK2表達(dá)量高于其他三種EC細(xì)胞系)。

表1 qRT-PCR測(cè)定正常組織與EC組織中circPTK2和miR-619-5p的表達(dá)

2.2miR-619-5p過表達(dá)抑制了EC細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、遷移和EMT：與對(duì)照組和miR-NC組比較，miR-619-5p組TE-13細(xì)胞中的miR-619-5p水平顯著升高，細(xì)胞活力顯著下降，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少，E-cadherin的表達(dá)顯著增高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖1、圖2、表3。

表2 qRT-PCR測(cè)定HEEC與EC細(xì)胞系中circPTK2和miR-619-5p的表達(dá)

圖1 miR-619-5p上調(diào)對(duì)EC細(xì)胞侵襲、遷移的影響

圖2 Western blot檢測(cè)EC細(xì)胞中EMT蛋白標(biāo)記物水平

2.3circPTK2通過海綿吸附降低miR-619-5p的水平：生物信息學(xué)分析顯示了circPTK2和miR-619-5p序列之間的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-619-5p+WT-circPTK2組的熒光素酶活性明顯低于miR-NC+WT-circPTK2(P<0.05)，而miR-619-5p+MUT-circPTK2組的熒光素酶活性與miR-NC+MUT-circPTK2組無顯著差異(P>0.05)，見表4。同時(shí)，circPTK2可被miR-619-5p在生物素偶聯(lián)miRNA下拉實(shí)驗(yàn)中捕獲(P<0.05)，見表5。此外，si-circPTK2組的miR-619-5p表達(dá)增高，LV-circPTK2組的miR-619-5p表達(dá)降低(P<0.05)，見表6。

表3 轉(zhuǎn)染miR-619-5p對(duì)EC細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲遷移及EMT蛋白標(biāo)記物的影響

圖3 circPTK2和miR-619-5p的結(jié)合位點(diǎn)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析circPTK2和miR-619-5p的交互

表5 pull-down實(shí)驗(yàn)分析circPTK2和miR-619-5p的交互

表6 qRT-PCR測(cè)定各組TE-13細(xì)胞中miR-619-5p的表達(dá)

2.4miR-619-5p抑制劑逆轉(zhuǎn)了si-circPTK2的抗腫瘤作用：與對(duì)照組和si-NC組比較，si-circPTK2組TE-13細(xì)胞中circPTK2的水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著下降，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少，E-cadherin的表達(dá)顯著增高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與si-circPTK2組和si-circPTK2+anti-NC組比較，si-circPTK2+anti-miR-619-5p組TE-13細(xì)胞中的miR-619-5p水明顯降低，細(xì)胞活力顯著增高，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯增多，E-cadherin的表達(dá)顯著下降，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖4、圖5、表7、表8。

圖4 si-circPTK2和anti-miR-619-5p共轉(zhuǎn)染對(duì)EC細(xì)胞侵襲、遷移的影響

表7 si-circPTK2和anti-miR-619-5p共轉(zhuǎn)染對(duì)EC細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲遷移的影響

表8 si-circPTK2和anti-miR-619-5p共轉(zhuǎn)染對(duì)EC細(xì)胞中EMT蛋白標(biāo)記物的影響

2.5circPTK2和miR-619-5p對(duì)EC在體內(nèi)腫瘤發(fā)生的影響：sh-circPTK2組腫瘤體積(第3、4、5周)和重量均較sh-NC組和對(duì)照組減輕，sh-circPTK2+anti-miR-619-5p組腫瘤體積(第3、4、5周)和重量較sh-circPTK2組和sh-circPTK2+anti-NC組增高(P<0.05)，見表9。

表9 sh-circPTK2和anti-miR-619-5p影響EC在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生

圖5 Western blot檢測(cè)EC細(xì)胞中EMT蛋白標(biāo)記物水平

3 討 論

CircRNAs的共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)使其比傳統(tǒng)的線性RNA更穩(wěn)定地對(duì)抗RNase和外切酶，能夠長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮其生物學(xué)功能[10]。近年來，高效測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了circRNAs的鑒定和功能研究。已有研究證實(shí)許多circRNAs的異常表達(dá)作為腫瘤抑制或啟動(dòng)子參與了EC[11]等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，circPTK2在臨床EC組織和體外培養(yǎng)的EC細(xì)胞系中顯著上調(diào)。與該結(jié)果一致，circPTK2在多種人類惡性腫瘤(如口腔鱗狀細(xì)胞癌[9]和胃癌[12])中作為生物活性的調(diào)節(jié)因子。此外，本研究通過功能缺失實(shí)驗(yàn)探究了circPTK2的生物學(xué)作用。結(jié)果表明，在EC中下調(diào)circPTK2導(dǎo)致細(xì)胞活力、侵襲、遷移和EMT過程受到顯著抑制。這些結(jié)果均證實(shí)circPTK2在EC中表達(dá)上調(diào)，并作為一種致癌分子發(fā)揮作用。

在眾多的miRNAs中，miR-619-5p在癌癥中得到了新的關(guān)注。以往的研究表明，miR-619-5p在腫瘤進(jìn)展中的功能不同。例如，miR-619-5p通過靶向ATXN3抑制口腔鱗癌的增殖，增強(qiáng)順鉑耐藥性[9]，而在膠質(zhì)瘤中miR-619-5p過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移并抑制凋亡[13]。miR-619-5p在不同癌癥中功能不一致的原因可能是由于癌細(xì)胞的不同類型導(dǎo)致的。本研究發(fā)現(xiàn)miR-619-5p在EC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)可抑制EC細(xì)胞侵襲、遷移和EMT過程。提示miR-619-5p在EC中作為抑癌分子發(fā)揮作用。

大量研究表明circRNA在包括EC在內(nèi)的各種癌癥中可作為miRNA的分子海綿。例如，circ_0006168作為miR-384的海綿，促進(jìn)EC的發(fā)展[14]；circ_0000554沉默可通過海綿吸收miR-485-5p下調(diào)FERMT1抑制EC進(jìn)展，增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性[15]。本研究的生物信息學(xué)分析推測(cè)了circPTK2與miR-619-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)。然后，通過miRNA pull-down實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)確認(rèn)它們之間的結(jié)合能力。而且，circPTK2與miR-619-5p呈負(fù)調(diào)控。此外，拯救實(shí)驗(yàn)顯示，miR-619-5p的衰減可以逆轉(zhuǎn)circPTK2下調(diào)介導(dǎo)的EC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移效應(yīng)。并且，miR-619-5p缺失可部分恢復(fù)circPTK2下調(diào)對(duì)體內(nèi)EC瘤體生長(zhǎng)的抑制作用。

本研究首次提供了circPTK2/miR-619-5p軸調(diào)控EC進(jìn)展的證據(jù)。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，可以通過更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這些結(jié)果：例如通過MTT法或5-乙基-2-脫氧尿苷(Edu)法進(jìn)一步證實(shí)circPTK2對(duì)細(xì)胞增殖的影響；為了探索circPTK2的調(diào)控機(jī)制，可以通過免疫熒光檢測(cè)來確定circPTK2的亞細(xì)胞定位。眾所周知，circRNA可能在多種癌癥的發(fā)展過程中作為一種競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)源性RNA(ceRNA)。因此，還需要進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究circPTK2在EC進(jìn)展過程中可能存在的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，circPTK2在EC中上調(diào)，miR-619-5p下調(diào)，circPTK2通過下調(diào)miR-619-5p促進(jìn)EC進(jìn)展，提示在EC中發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)控機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)可能為啟發(fā)新的EC分子診斷和治療策略提供科學(xué)依據(jù)。