黨 乙， 張 梁， 翟恒鈺， 李文海

(西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院胸外科, 陜西 西安 710100)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型，化療是其治療手段之一，順鉑(Cisplatin，DDP)可與基因組DNA或線粒體DNA結(jié)合，阻止DNA復(fù)制，抑制細(xì)胞增殖，最終誘導(dǎo)細(xì)胞壞死或凋亡，但長期使用易發(fā)生耐藥性，導(dǎo)致患者生存率下降，因此，研究NSCLC的耐藥機(jī)制，尋找克服腫瘤耐藥方法對改善患者預(yù)后有重要意義[1]。研究顯示，CircBIRC6在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，通過抑制miR-145表達(dá)促進(jìn)NSCLC進(jìn)展[2]，CircBIRC6是否與NSCLC耐藥性有關(guān)尚不清楚。miR-126-5p參與結(jié)腸癌、上皮性卵巢癌等腫瘤的耐藥性[3]，研究顯示，miR-126-5p在DDP耐藥的NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-126-5p可靶向并負(fù)調(diào)控ADAM9表達(dá)，提高NSCLC對DDP的敏感性[4]。經(jīng)starbase在線分析顯示，CircBIRC6與miR-126-5p有靶向結(jié)合位點，CircBIRC6是否通過調(diào)控miR-126-5p表達(dá)參與NSCLC細(xì)胞的DDP耐藥性尚不清楚，本研究探索CircBIRC6對NSCLC細(xì)胞DDP耐藥作用及機(jī)制，為臨床克服NSCLC對DDP耐藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料:A549及A549/DDP細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；DDP(1763258)購自美國Sigma公司；CircBIRC6過表達(dá)載體(pcBIRC6)及對照(pcDNA)、CircBIRC6干擾質(zhì)粒(si-CircBIRC6)及陰性對照(si-NC)、miR-126-5p抑制物(miR-126-5p inhibitor)及其對照(NC inhibitor)、各引物購自上海吉瑪生物科技有限公司；Lipofectamine 6000轉(zhuǎn)染試劑(C0526)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG089S)、CCK-8試劑盒(C0037)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)購自Beyotime生物；兔抗JARID2(13594)、Cyclin D1(55506)、P21(2947)、P-gp(13978)抗體購自CST公司。

1.2標(biāo)本來源:選擇2015年1月至2017年12月在本院接受手術(shù)并進(jìn)行DDP化療的NSCLC患者肺癌組織，其中DDP敏感組織23例，DDP耐藥組織25例。根據(jù)最后一次DDP化療與患者復(fù)發(fā)之間的時間間隔，超過6個月為DDP敏感，小于6個月為DDP耐藥。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情并簽署知情同意書。

1.3方 法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:A549/DDP細(xì)胞在5.0μmoL/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)融合至65%～70%時，使用Lipofectamine 6000轉(zhuǎn)染試劑盒對A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將細(xì)胞分為pcDNA組、pcBIRC6組、si-CircBIRC6組、si-NC組、si-BIRC6+inhibitor NC組，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor組，另設(shè)對照組(Control組)不做轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2A549、A549/DDP細(xì)胞對DDP的半抑制濃度:將A549及各組處理的A549/DDP細(xì)胞2×104個/孔接種于96孔板中，分別使用終濃度為1、10、20、40、80、160μmoL/L的DDP處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，測定酶標(biāo)儀450nm處吸光度值，計算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.3RT-qPCR檢測CircBIRC6、miR-126-5p表達(dá):使用TRIzol試劑提取標(biāo)本及各組細(xì)胞總RNA，然后對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用Taq qPCR Master Mix再進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，分別以β-actin、U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算CircBIRC6、miR-126-5p相對表達(dá)。CircBIRC6上游引物(5′-3′)：TCAAGGAGACCAACTTTGGC；下游引物(5′-3′)：CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG；β-actin上游引物(5′-3′)：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游引物(5′-3′)：GCGCCCAATACGACCAAATC；miR-126-5p上游引物(5′-3′)：GGTATAATCCGCCGCTTAGCTGCC，下游引物(5′-3′)：GTGCAGGGTTGCAAGGT；U6上游引物(5′-3′)：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物(5′-3′)：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.4細(xì)胞增殖實驗:各組處理的A549/DDP細(xì)胞4×104個/孔接種于96孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48h后，使用CCK-8試劑盒檢測各孔吸光度值(A)。

1.3.5細(xì)胞凋亡實驗:離心收集轉(zhuǎn)染的各組A549/DDP細(xì)胞，PBS洗滌后，使用binding buffer制備成1×106個/mL的細(xì)胞懸液，分別加入10μL的Annexin V-FITC與PI溶液，室溫避光孵育20min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.6Western blot檢測JARID2、Cyclin D1、P21、P-gp蛋白表達(dá):使用RIPA液提取各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉2h，加入JARID2(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、P21(1∶1500)、P-gp(1∶1500)一抗稀釋液，4℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記二抗(1∶2000)，室溫孵育1h，ECL試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，分析各蛋白表達(dá)。

1.3.7CircBIRC6、JARID2與miR-126-5p的靶向關(guān)系:使用starbase在線預(yù)測CircBIRC6、JARID2與miR-126-5p的靶向關(guān)系，分別構(gòu)建CircBIRC6、JARID2野生型與突變型表達(dá)載體，使用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CCircBIRC6、JARID2與miR-126-5p的靶向關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1CircBIRC6在敏感及耐藥肺癌組織及A549、A549/DDP細(xì)胞中表達(dá):與敏感肺癌組織相比，CircBIRC6在耐藥肺癌組織中表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞中CircBIRC6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 CircBIRC6在敏感及耐藥肺癌組織及A549、A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)

2.2DDP對A549、A549/DDP細(xì)胞的IC50值:DDP呈劑量依賴性抑制A549、A549/DDP細(xì)胞增殖，經(jīng)計算，DDP對A549、A549/DDP細(xì)胞的IC50值分別為28.60μmoL/L、53.56μmoL/L，見圖2。

2.3CircBIRC6與miR-126-5p靶向關(guān)系驗證:通過starbase在線預(yù)測顯示，CircBIRC6與miR-126-5p有結(jié)合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與CircBIRC6-WT+miR-NC組比較，CircBIRC6-WT+miR-126-5p mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見表1。而過表達(dá)CircBIRC6，miR-126-5p表達(dá)水平顯著降低，抑制CircBIRC6表達(dá)，miR-126-5p表達(dá)水平顯著升高，見表2，證明CircBIRC6與miR-126-5p存在靶向關(guān)系。

圖2 MTT檢測DDP對A549、A549/DDP細(xì)胞的IC50值

圖3 CircBIRC6與miR-126-5p結(jié)合位點預(yù)測結(jié)合

表1 各組A549細(xì)胞雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

2.4各組細(xì)胞CircBIRC6與miR-126-5p表達(dá)比較:與pcDNA組相比，pcBIRC6組CircBIRC6表達(dá)水平顯著升高，miR-126-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-BIRC6組CircBIRC6表達(dá)水平顯著降低，miR-126-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與si-BIRC6+inhibitor NC相比，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor組miR-126-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CircBIRC6表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞CircBIRC6與miR-126-5p表達(dá)比較

2.5各組細(xì)胞JARID2表達(dá)比較:與pcDNA組相比，pcBIRC6組JARID2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-BIRC6組JARID2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-BIRC6+inhibitor NC相比，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor組JARID2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表3與圖4。

圖4 各組細(xì)胞JARID2表達(dá)

表3 各組細(xì)胞JARID2表達(dá)比較

2.6CircBIRC6對A549/DDP細(xì)胞增殖、凋亡及IC50的影響:與pcDNA組相比，pcBIRC6組細(xì)胞增殖、Cyclin D1與P-gp蛋白表達(dá)及IC50值顯著升高，細(xì)胞凋亡率及P21蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-BIRC6組細(xì)胞增殖、Cyclin D1與P-gp蛋白表達(dá)及IC50值顯著降低，細(xì)胞凋亡率及P21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與si-BIRC6+inhibitor NC相比，si-BIRC6+miR-126-5p inhibitor組細(xì)胞增殖、Cyclin D1與P-gp蛋白表達(dá)及IC50值顯著升高，細(xì)胞凋亡率及P21蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表4、圖5、圖6。

表4 CircBIRC6對A549/DDP細(xì)胞增殖凋亡及IC50的影響

圖5 各組細(xì)胞Cyclin D1、P21、P-gp蛋白表達(dá)

圖6 各組細(xì)胞凋亡

2.7miR-126-5p與JARID2的靶向關(guān)系:通過starbase在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)JARID2-3’UTR上與miR-126-5p存在結(jié)合位點，見圖7。進(jìn)一步使用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-126-5p與JARID2的靶向關(guān)系，與JARID2-WT+miR-NC相比，JARID2-WT+miR-126-5p mimics組細(xì)胞的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而JARID2突變型細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化，見表5，表明JARID2是miR-126-5p的靶基因。而過表達(dá)CircBIRC6，miR-126-5p表達(dá)水平顯著降低的同時，JARID2表達(dá)水平升高，抑制CircBIRC6表達(dá)，miR-126-5p表達(dá)水平升高的同時，JARID2表達(dá)水平降低，見表3，證明CircBIRC6可調(diào)控miR-126-5p/JARID2軸。

圖7 miR-126-5p與JARID2靶向關(guān)系預(yù)測

表5 各組A549細(xì)胞雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

3 討 論

DDP為常見的化療藥物，用于多種惡性腫瘤的治療，然而腫瘤對DDP的耐藥性問題越來越突出，研究DDP的耐藥性機(jī)制顯得尤為重要[5]。有報道顯示，circRNA可以調(diào)節(jié)DDP在NSCLC中的耐藥性，CircBIRC6屬于circRNA之一，在膀胱癌、肝癌中均上調(diào)表達(dá)，抑制CircBIRC6表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]。本研究結(jié)果顯示，CircBIRC6在耐藥肺癌組織與細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，提示CircBIRC6可能與NSCLC耐藥有關(guān)。已有報道顯示，CircBIRC6在NSCLC組織與細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，通過抑制miR-217表達(dá)，上調(diào)β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白2表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[7]。在卵巢癌中，抑制CircBIRC6表達(dá)可上調(diào)miR-367-3p表達(dá)，降低卵巢癌細(xì)胞對DDP的耐藥性[8]。為探索CircBIRC6在A549/DDP細(xì)胞中的功能，本研究在A549/DDP細(xì)胞中干預(yù)CircBIRC6表達(dá)，結(jié)果顯示，過表達(dá)CircBIRC6可增加A549/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性，而抑制CircBIRC6表達(dá)增加A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性，然而其具體作用機(jī)制尚不清楚。

circRNA可以作為miRNA海綿參與腫瘤耐藥性，如上調(diào)circCUL2表達(dá)可通過抑制miR-888-5p表達(dá)，上調(diào)RB1CC1表達(dá)增強A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性[9]。本研究顯示上調(diào)或下調(diào)CircBIRC6表達(dá)，可抑制或下調(diào)miR-126-5p表達(dá)，研究表明，miR-126-5p在NSCLC中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-126-5p可抑制NSCLC細(xì)胞增殖和進(jìn)展[10]；本研究通過生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，CircBIRC6與miR-126-5p存在靶向結(jié)合位點，抑制miR-126-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制CircBIRC6表達(dá)對A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用，提示CircBIRC6靶向調(diào)控miR-126-5p表達(dá)參與NSCLC化療耐藥性。Han等研究也證實，miR-126-5p與肺腺癌的放射敏感性有關(guān)，過表達(dá)miR-126-5p通過調(diào)控EZH2/KLF2/BIRC5軸，抑制細(xì)胞遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強肺腺癌細(xì)胞對放射治療的敏感性[11]。

JARID2是Jm-jC域(具有去甲基化活性)的SMCX蛋白，為Jumonji蛋白家族中的一員，在多種腫瘤中上調(diào)表達(dá)，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[12]。

在膠質(zhì)瘤中，JARID2表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)JARID2可抑制CCND1表達(dá)調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性[13]。本研究結(jié)果顯示，在過表達(dá)CircBIRC6的A549/DDP細(xì)胞中，miR-126-5p表達(dá)水平降低，JARID2表達(dá)增加，而抑制CircBIRC6表達(dá)后，JARID2表達(dá)水平降低，并且在抑制CircBIRC6基礎(chǔ)上同時下調(diào)miR-126-5p表達(dá)后，JARID2表達(dá)增加，表明miR-126-5p可靶向調(diào)節(jié)JARID2表達(dá)，且starbase在線預(yù)測與雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果證實miR-126-5p與JARID2有靶向結(jié)合位點，提示CircBIRC6可能通過miR-126-5p調(diào)控JARID2蛋白表達(dá)，參與NSCLC對DDP耐藥性。Kuang等研究顯示JARID2在DDP耐藥的NSCLC細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，通過上調(diào)Notch1促進(jìn)NSCLC干性和順鉑耐藥[14]，也表明JARID2與肺癌順鉑耐藥有關(guān)。

綜上，CircBIRC6在A549/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，CircBIRC6可通過靶向抑制miR-126-5p表達(dá)，上調(diào)JARID2表達(dá)，促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。