彭 琴，張往祥,2*

（1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.揚(yáng)州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225000）

0 引言

【研究意義】海棠（Crabapple）是薔薇科蘋果屬（Malus）中果徑較?。ā? cm）的一類植物的總稱[1]。海棠喜溫暖濕潤(rùn)、陽光充足的環(huán)境，其適應(yīng)性較強(qiáng)，對(duì)環(huán)境要求不嚴(yán)，最適宜生長(zhǎng)于排水良好的沙壤土，對(duì)鹽堿土的抗性較強(qiáng)[2]，可栽種于全國(guó)各地。海棠自漢代以來，具有2 000多年的栽培歷史，是重要的觀花觀葉觀果樹種[3]，素有“國(guó)艷”之譽(yù)，觀賞海棠不以果實(shí)產(chǎn)量為主要栽培目的，而是將葉、花、果實(shí)的觀賞價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值有機(jī)結(jié)合起來，有效增加園林樹種的多樣性和景觀持續(xù)性[4]，既能提供良好的生態(tài)效益又能產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此培育優(yōu)良海棠品種是海棠園林應(yīng)用的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。雜交育種是林木種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑，在果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，胚胎存在不同程度的敗育現(xiàn)象，其優(yōu)良特性難以從遺傳學(xué)角度得以保持，這種胚胎敗育特性嚴(yán)重阻礙了海棠雜交育種選優(yōu)的進(jìn)程。分析海棠果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中種子內(nèi)源激素變化規(guī)律與胚珠敗育情況，對(duì)其內(nèi)源激素變化與胚胎敗育的相互關(guān)系、影響進(jìn)行探討，對(duì)海棠果實(shí)生長(zhǎng)調(diào)控、觀果品種的雜交選育、種子質(zhì)量提高具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】在果樹遠(yuǎn)緣雜交和不同倍性親本之間雜交的過程中，常因雜種胚早期敗育而難以形成有生命力的種子，使得常規(guī)雜交育種很難順利進(jìn)行，有關(guān)胚胎敗育的內(nèi)在機(jī)理及外部影響因素一直是國(guó)內(nèi)外育種專家研究的熱點(diǎn)。內(nèi)源激素（IAA、ABA等）[5-6]、解剖學(xué)分析（花器官結(jié)構(gòu)[7-8]、胚胎結(jié)構(gòu)[9]等）及基因調(diào)控[10-11]與胚胎敗育均有一定的關(guān)系。植物內(nèi)源激素是植物自身產(chǎn)生微量可調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)發(fā)育的有機(jī)物質(zhì)，各類激素的生理功能多種多樣，既互相拮抗又互相協(xié)同，共同對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)起控制作用。關(guān)于內(nèi)源激素與胚胎敗育的關(guān)系密切，Su等[12]對(duì)黃瓜單性結(jié)實(shí)研究發(fā)現(xiàn)，IAA 作為一種植物單性結(jié)實(shí)的誘導(dǎo)激素，對(duì)胚胎敗育也有一定的觸發(fā)作用，目前的研究報(bào)道主要集中在西瓜[13]、杧果[14]、荔枝[15]、棗[16]等果樹。閆旭宇等[17]在棗胚敗育分析中認(rèn)為，棗胚發(fā)育后期種子空癟可能與激素IAA、GA3和ABA虧缺、激素Z的異常積累、尤其是Z/GA3異常升高有關(guān)。在對(duì)荔枝的胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)育正常胚胎中 IAA、GA3、CTK 的含量高而 ABA 的含量低[18]。近年來，學(xué)者在觀賞海棠研究中已表明內(nèi)源激素對(duì)花芽分化、花粉發(fā)育有重要影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)優(yōu)良觀賞海棠品種選育多集中于砧木選擇、種質(zhì)資源利用、繁殖方式等研究上，而對(duì)海棠果實(shí)胚胎敗育分析研究鮮見。觀賞海棠是自由授粉植物，通常采用實(shí)生選種方式優(yōu)勢(shì)育種。紅珠寶（M.Red Jewel）與凱爾斯（M.Kelsey） 是觀賞海棠中重要的觀果品種，花期一致，果實(shí)果量大，但凱爾斯落果量大，種子敗育率高，無法保證種子的正常發(fā)育，影響了在生產(chǎn)上對(duì)其進(jìn)行雜交育種選優(yōu)的進(jìn)程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文分別以低敗育率的紅珠寶（M.Red Jewel）和高敗育率的凱爾斯（M.Kelsey）為試驗(yàn)材料，對(duì)比不同敗育程度的觀賞海棠品種果實(shí)生長(zhǎng)規(guī)律并挖掘其中影響胚珠發(fā)育的重要內(nèi)源激素，為進(jìn)一步探討觀賞海棠胚胎敗育原因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)仙女鎮(zhèn)國(guó)家海棠種質(zhì)資源圃（E 119°55′，N 32°42′），屬北亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，年均降水量約為1 000 mm，無霜期長(zhǎng)達(dá)320 d，年平均氣溫14.9 ℃左右。試驗(yàn)地土壤質(zhì)地為砂壤土，地勢(shì)平坦且立地條件一致，土層肥沃，灌排條件良好。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 試驗(yàn)于2019年春季進(jìn)行，以6年生低敗育率紅珠寶與高敗育率凱爾斯為試驗(yàn)材料，2個(gè)品種各選取10株生長(zhǎng)一致、健康的單株作為取材樣株，并隨機(jī)選擇花期一致的50個(gè)花序掛牌標(biāo)記。于海棠末花期后（花柱授粉結(jié)束）、子房開始膨大時(shí)（2019年4月12日），采用游標(biāo)卡尺測(cè)量橫縱經(jīng)（mm），前期每隔5 d測(cè)量，連續(xù)測(cè)量8次，后期每隔10 d測(cè)量1次，到果實(shí)不再膨大時(shí)停止測(cè)量，每個(gè)品種連續(xù)測(cè)量15次。

1.2.2 果實(shí)發(fā)育掛果率與敗育率的測(cè)定 紅珠寶與凱爾斯果實(shí)發(fā)育掛果率、敗育率的測(cè)定與果實(shí)果徑測(cè)量同期進(jìn)行，前期每隔5 d采集拍攝，后期每隔15 d到25 d采集拍攝，各品種共連續(xù)測(cè)定12次。根據(jù)掛牌標(biāo)記的50朵花序分別統(tǒng)計(jì)出花朵數(shù)與掛果數(shù)，計(jì)算掛果率。掛果率/%=坐果數(shù)/花朵數(shù)×100[19]。

觀察記錄各品種所有果實(shí)內(nèi)部胚珠發(fā)育狀態(tài)。果實(shí)心室里的胚珠或胚完全消失或嚴(yán)重褐化、變黑、組織軟化、明顯萎縮皺縮、干癟壞死，即為敗育胚珠；胚珠或胚飽滿圓潤(rùn)、濕脆、乳白色、內(nèi)部透明晶亮、無褐化則為發(fā)育正常胚珠[20]，在生長(zhǎng)一致的健康單株上每個(gè)海棠品種隨機(jī)選擇50個(gè)發(fā)育的果實(shí)，計(jì)算敗育率。敗育率/%=敗育胚珠數(shù)/胚珠數(shù)×100。

1.2.3 種子內(nèi)源激素的測(cè)定 紅珠寶與凱爾斯種子內(nèi)源激素的測(cè)定與果實(shí)敗育率的測(cè)定同期進(jìn)行。分別從紅珠寶與凱爾斯果實(shí)敗育率的12個(gè)測(cè)定時(shí)期中選取7個(gè)時(shí)期取樣，分別為授粉后的第1、13、19、31、43、54、76 天。樣品經(jīng)液氮冷凍后去除外果皮和中果皮的種子進(jìn)行測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（ELISA）測(cè)定種子內(nèi)源赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）、細(xì)胞分裂素（CTK）、吲哚乙酸（IAA）的含量，試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Office 2016與SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅珠寶和凱爾斯果實(shí)生長(zhǎng)規(guī)律

由圖1-A與圖1-B可以看出，紅珠寶和凱爾斯授粉后1～126 d果實(shí)橫縱徑逐漸增大，紅珠寶和凱爾斯在授粉后1～43 d果實(shí)生長(zhǎng)迅速（4月12日至5月24日），在授粉后43 ~126 d果實(shí)均有一個(gè)較緩慢的生長(zhǎng)過程（5月24日至8月15日），在授粉126 d后果實(shí)停止生長(zhǎng)；授粉后1～13 d，紅珠寶與凱爾斯的果實(shí)橫縱徑大小無明顯差異；在13 d后大小差異顯著（P＜0.05），紅珠寶的果實(shí)橫縱徑明顯小于同期凱爾斯（P＜0.05）。由圖1-C可以看出，紅珠寶與凱爾斯的掛果率均呈下降趨勢(shì)，在授粉后1～13 d掛果率急速下降，在授粉54 d后趨于穩(wěn)定，紅珠寶與凱爾斯的果實(shí)掛果率有顯著差異（P＜0.05），紅珠寶的掛果率顯著高于同期的凱爾斯的果實(shí)（P＜0.05）。紅珠寶的掛果率在授粉后54 d仍然處于較高水平（81%），凱爾斯的掛果率在授粉后54 d處于極低水平（4.7%）。圖1-D可以看出紅珠寶的種子胚胎敗育率在授粉后1～54 d呈上升趨勢(shì)，在坐果54～87 d急速下降，凱爾斯的種子胚胎敗育率總體呈上升趨勢(shì)，在授粉后54～87 d趨于穩(wěn)定，紅珠寶種子內(nèi)胚胎敗育率在授粉54 d后與凱爾斯有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中種子內(nèi)源激素含量變化

從圖2-A可以看出，紅珠寶的種子內(nèi)源GA3含量變化呈“N”形變化，在授粉后1～13 d，紅珠寶的種子內(nèi)源GA3含量緩慢升高，凱爾斯的種子內(nèi)源GA3急速下降，兩者差異顯著（P＜0.05），在授粉后31～43 d，紅珠寶的種子內(nèi)源GA3含量急速下降，凱爾斯的種子內(nèi)源GA3急速上升，兩者差異顯著（P＜0.05）；在授粉后1～43 d，紅珠寶的種子內(nèi)源GA3含量顯著高于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后43～76 d，紅珠寶的種子內(nèi)源GA3含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05）。

從圖2-B可以看出，紅珠寶的種子內(nèi)源ABA含量變化呈“N”形變化，在授粉后43 d達(dá)到最高值1.625 9 pmol·g-1，隨后急劇下降至最低點(diǎn) 1.202 1 pmol·g-1。在授粉后1～13 d，紅珠寶的種子內(nèi)源ABA含量顯著高于凱爾斯，在授粉后43～76 d，紅珠寶的種子內(nèi)源ABA含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05）。

從圖2-C可以看出，在授粉后1～13 d，紅珠寶的種子內(nèi)源CTK含量急速下降，凱爾斯的種子內(nèi)源CTK急速上升，兩者差異顯著（P＜0.05），在授粉后31～54 d，紅珠寶的種子內(nèi)源CTK含量急速下降后上升，凱爾斯的種子內(nèi)源CTK急速上升后下降，兩者差異顯著（P＜0.05）；在授粉后1～19 d，紅珠寶的種子內(nèi)源CTK含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后19～54 d，紅珠寶的種子內(nèi)源CTK含量顯著高于凱爾斯（P＜0.05）。

從圖2-D可以看出，紅珠寶與凱爾斯的種子內(nèi)源IAA含量變化均呈上升-下降-上升-下降的周期性變化趨勢(shì)，在授粉后31～43 d，紅珠寶的種子內(nèi)源IAA含量急速下降，凱爾斯的種子內(nèi)源IAA急速上升，二者有顯著差異（P＜0.05）；在坐果1～31 d，紅珠寶的種子內(nèi)源IAA含量顯著高于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后43～54 d，紅珠寶的種子內(nèi)源IAA含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05）。

2.3 果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中種子內(nèi)源激素平衡關(guān)系

從圖3-A與圖3-B可以看出，紅珠寶與凱爾斯種子內(nèi)源激素IAA/ABA比值總體均呈“N”形變化，授粉后54～76 d，紅珠寶種子內(nèi)源激素IAA/ABA、GA3/ABA比值顯著低于凱爾斯（P＜0.05），從圖3-B與圖3-C可以看出，授粉后1～13 d，紅珠寶種子內(nèi)源激素GA3/ABA 比值逐漸上升，CTK/ABA比值逐漸下降，而凱爾斯種子內(nèi)源激素GA3/ABA 比值逐漸下降，CTK/ABA比值迅速上升，兩者差異顯著（P＜0.05），從圖3-C還可以看出，授粉后54～76 d，紅珠寶種子內(nèi)源激素CTK/ABA比值逐漸下降，而凱爾斯種子內(nèi)源激素CTK/ABA 比值迅速上升，兩者差異顯著（P＜0.05），從圖3-D可以看出，授粉后13～19 d，紅珠寶種子內(nèi)源激素（IAA+CTK）/ABA比值緩慢上升，而凱爾斯種子內(nèi)源激素（IAA+CTK）/ABA比值迅速下降，兩者差異顯著（P＜0.05）；從圖3-E可以看出，授粉后31～43 d，紅珠寶種子內(nèi)源激素（GA3+IAA+CTK）/ABA比值迅速下降，而凱爾斯種子內(nèi)源激素（GA3+IAA+CTK）/ABA比值逐漸上升，兩者差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

成熟的有生命力的胚胎是植物產(chǎn)生種子的基礎(chǔ)。然而在一些觀賞植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，存在胚早期退化和敗育[21，22]現(xiàn)象，這對(duì)觀賞植物育種來說是一個(gè)不良的特性，降低了育種效率。觀賞海棠是重要的觀果樹種，探究胚胎敗育原因?qū)τ^賞海棠的優(yōu)良雜交育種具有重要意義。

試驗(yàn)對(duì)低敗育率的紅珠寶（M.Red Jewel）和高敗育率的凱爾斯（M.Kelsey）的果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和胚胎敗育情況，及內(nèi)源激素變化規(guī)律進(jìn)行了初步探究。結(jié)果表明，在授粉13 d后，紅珠寶的橫縱徑生長(zhǎng)顯著低于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后紅珠寶的掛果率顯著高于凱爾斯（P＜0.05），而在授粉后1～13 d，二者的掛果率急速下降，在授粉54 d后，二者的掛果率均趨于穩(wěn)定。授粉后1～13 d是凱爾斯的生理落果期，大量的落果可能是由于種子內(nèi)低水平的GA3、ABA與高水平的CTK，而此時(shí)IAA并不缺乏。在授粉后的發(fā)育過程中，果實(shí)的內(nèi)源激素起著連續(xù)的協(xié)調(diào)作用[23]，Gustafson[24]在1936年首次證實(shí)在番茄和其他一些物種柱頭上施加人工合成的生長(zhǎng)素能刺激未授粉子房發(fā)育形成無籽的果實(shí)，Chen等[25]研究表明果樹胚胎的敗育是多種激素間協(xié)同作用的結(jié)果。

在授粉54 d后紅珠寶的胚胎敗育率有下降趨勢(shì)，并且在授粉54 d后凱爾斯的敗育率趨于穩(wěn)定，這表明授粉后1～54 d是紅珠寶與凱爾斯胚胎敗育發(fā)生的主要時(shí)期，大量的胚敗育果實(shí)在胚胎發(fā)育完成后并未脫落，而是持續(xù)生長(zhǎng)到果實(shí)成熟，這可能與種子中高水平的GA3含量和（GA3+IAA+CTK）/ABA比值沒有下降反而升高有關(guān)，這與賀金虎等[26]在金煌杧果上的研究有相同之處；在胚胎發(fā)育前期，低敗育率的紅珠寶種子內(nèi)源激素GA3、IAA含量及GA3/ABA、（GA3+IAA+CTK）/ABA比值顯著高于高敗育率的凱爾斯（P＜0.05），在胚胎發(fā)育后期，低敗育率的紅珠寶種子內(nèi)源激素GA3、ABA、IAA含量及IAA/ABA、GA3/ABA、（GA3+IAA+CTK）/ABA比值顯著低于高敗育率的凱爾斯（P＜0.05），這表明GA3和IAA在種子敗育過程中起著重要作用，保持胚早期含有較高水平的GA3和IAA ，是確保其正常發(fā)育的重要條件，這與祁業(yè)鳳等[27]對(duì)棗果實(shí)發(fā)育過程的研究和韓東花等[28]在對(duì)楸樹種子發(fā)育過程中內(nèi)源激素變化上的研究一致。

4 結(jié)論

觀賞海棠的生理落果與種子內(nèi)源激素含量存在相關(guān)性。授粉后1～13 d是凱爾斯的生理落果期，在生產(chǎn)上，該時(shí)期落果嚴(yán)重，是提高凱爾斯坐果率及果實(shí)觀賞價(jià)值的最佳時(shí)期；授粉后1～54 d是紅珠寶與凱爾斯胚胎敗育發(fā)生的主要時(shí)期，在胚胎發(fā)育前期，保持種子含有較高濃度的GA3和IAA能確保其正常發(fā)育，在胚胎發(fā)育后期，種子內(nèi)單一激素的高低無法確保胚胎的正常發(fā)育，低濃度的GA3和IAA能確保其正常發(fā)育。