王 淘，楊 澄，閆亞娜，王雨瀟，李瑞民

（贛南師范大學生命科學學院，江西 贛州 341000）

0 引言

【研究意義】柑橘（Citrusspp.）是世界上最重要的果樹作物之一，也是我國重要的經(jīng)濟果樹作物。柑橘病蟲害嚴重制約柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，在140個柑橘生產(chǎn)國中，有51個國家存在柑橘黃龍?。–itrusHuanglongbing）[1]。柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)上一種毀滅性的病害，由韌皮部桿菌引起，韌皮部桿菌侵染寄主過程中激發(fā)柑橘系統(tǒng)的免疫反應，包括活性氧的產(chǎn)生、胼胝質(zhì)積累以及免疫相關(guān)基因的誘導表達[2]。硫氧還蛋白（Thioredoxin）在清除活性氧代謝中發(fā)揮重要作用，是一類廣泛分布于細胞內(nèi)的小分子蛋白，而對硫功能的解析對于了解柑橘黃龍病的發(fā)生發(fā)展以及寄主對韌皮部桿菌的應答反應具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】硫氧還蛋白分為6種類型，分別為f、h、m、o、x和y。其中f、m、x和y型硫氧還蛋白在葉綠體中發(fā)揮功能，用于穩(wěn)定光合電子傳遞過程中的氧化還原狀態(tài)。o型硫氧還蛋白定位于線粒體，其作用為清除線粒體中產(chǎn)生的活性氧。h型硫氧還蛋白在細胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體中均有分布，參與多種生物學過程[3]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、 水 稻 （Oryza sativa）、 大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、葡萄（Vitis vinifera）、柑橘（C.spp.）基因組中均發(fā)現(xiàn)多個h型硫氧還蛋白，但只有少數(shù)蛋白的生物學功能比較清楚。其中，大豆中一個h型硫氧還蛋白參與大豆根瘤的發(fā)育和共生狀態(tài)的維持[4]。擬南芥AtTRXh5通過非典型機制參與victorin代謝通路[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtTRXh9可以在細胞間移動，有可能參與細胞通訊[6]。水稻OsTRXh1基因受脫落酸和鹽脅迫誘導，在水稻種子萌發(fā)和植株發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[7]。在甘藍型油菜中過表達擬南芥AtTRXh2提高了植株對氧化脅迫和鹽脅迫的耐受性[8]?！颈狙芯壳腥朦c】前人從多個方面探究了h型硫氧還蛋白的功能，但是其參與植物和病原菌互作的研究較少。前期工作中，筆者通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了一個受柑橘黃龍病誘導的h型硫氧還蛋白基因，在甜橙(C.sinensis)、道縣野橘(C.daoxianensis)、宜昌橙(C.ichangensis)的感病植株中均上調(diào)表達。目前，柑橘屬中關(guān)于硫氧還蛋白功能研究的報道較少，硫氧還蛋白參與柑橘免疫反應的作用尚需進一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過克隆甜橙中硫氧還蛋白基因CsTRXh1，進行表達分析和亞細胞定位分析，為深入研究硫氧還蛋白參與柑橘黃龍病應答反應的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為贛南師范大學柑橘種質(zhì)資源圃提供的甜橙品種紐荷爾（Newhall）。分別取3株前期鑒定為健康和感染黃龍病的紐荷爾臍橙葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 甜橙葉片總RNA提取與cDNA合成

甜橙葉片總RNA提取使用Easy RNA Kit試劑盒（易思得公司生產(chǎn)）。利用Nanodrop one超微量紫外分光光度計測定所提取總RNA的濃度和純度，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的完整度，參照聚合美公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover）合成紐荷爾臍橙cDNA。

1.3 基因克隆

從甜橙基因組數(shù)據(jù)庫（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）中獲得CsTRXh1基因的同源序列，根據(jù)CsTRXh1基因的同源序列設計擴增引物CsTRXh1-F和CsTRXh1-R（表1）。所用引物全部由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 基因CsTRXh1克隆、定量分析和載體構(gòu)建所用引物序列Table 1 Primer sequence used for cloning, expression analysis, and vector construction of CsTRXh1

PCR反應體系50 μL，包含紐荷爾臍橙cDNA模板 2 μL，2 × PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，正向和反向引物各 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃15 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。使用1.2%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物，由易思得瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DR0101050）回收目的片段，將其連接至全式金生物公司的平末端T載體pEASY-Blunt Cloning Vector，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中，經(jīng)過藍白斑篩選后，挑取白色單克隆，送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4 生物信息分析

通過在線軟件ProtParam[9]和SOPMA[10]預測蛋白質(zhì)分子量、等電點、蛋白穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)；利用CLC sequence viewer 8進行蛋白質(zhì)序列比對；用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預測蛋白保守結(jié)構(gòu)域。在甜橙基因組（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）、擬南芥基因組（www.arabidopsis.org）和NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中檢索并下載同源蛋白序列，用MEGA 11軟件[11]進行同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.5 基因表達分析

使用PrimerQuest Tool設計CsTRXh1基因的定量引物CsTRXh1-q-F和CsTRXh1-q-R（表1），qRT-PCR使用聚合美生物的M5 HiPer Realtime PCR Super mix，20 μL反應體系，組分為M5 HiPer Realtime PCR Super mix 10 μL，定量引物正向和反向引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補齊至 20 μL。以柑橘GAPDH基因為內(nèi)參基因，引物為GAPDH-F和GAPDH-R（表1）。qRT-PCR反應程序為：95 ℃熱啟動變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；60 ℃梯度升溫至95 ℃，每秒升溫0.15 ℃。qRTPCR結(jié)果使用2-ΔΔCt法[12]進行分析，所得表達數(shù)據(jù)在SPSS 26中使用單因素ANOVA進行顯著性分析。

1.6 植物表達載體構(gòu)建和亞細胞定位分析

通過同源重組法將CsTRXh1基因插入植物雙元表達載體pCAMBIA2300-GFP上，雙酶切位點分別為SacI和XbaI，包含同源接頭的擴增引物為CsTRXh1-2300-F和 CsTRXh1-2300-R（表1），擴增體系同方法1.3，檢測正確后獲得重組植物表達載體pCAMBIA2300-CsTRXh1-GFP，將重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)中，挑取單克隆菌落檢測，將正確菌落搖菌擴繁后瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙草葉肉細胞，培養(yǎng)2~3 d后使用共聚焦顯微鏡進行熒光觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜橙CsTRXh1基因的cDNA全長克隆

使用甜橙葉片cDNA為模板，通過PCR擴增后，獲得1條約360 bp大小的基因片段，與預期結(jié)果一致。擴增產(chǎn)物膠回收后，連接至T載體上，經(jīng)過藍白斑篩選，將陽性克隆測序，基于測序結(jié)果獲得甜橙CsTRXh1基因的完整開放閱讀框，長度為360 bp，編碼119個氨基酸殘基（圖1）。

2.2 CsTRXh1蛋白的理化性質(zhì)分析

CsTRXh1蛋白分子式為C591H940N150O172S6，相對分子質(zhì)量為13.09 kDa；帶負電荷的氨基酸殘基16個，帶正電荷的氨基酸殘基13個，等電點為5.37；穩(wěn)定系數(shù)為23.09，屬于穩(wěn)定蛋白。CsTRXh1蛋白的二級結(jié)構(gòu)由4種卷曲類型組成，分別為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲（表2）。其中α-螺旋占比最高，為47.90%；其次為無規(guī)則卷曲，占22.69%；然后是延伸鏈，占19.33%；β-轉(zhuǎn)角包含位點數(shù)量最少，為10.08%。CsTRXh1蛋白的C末端主要由α-螺旋組成。

表2 CsTRXh1蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structure of CsTRXh1

2.3 CsTRXh1序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過Blastp搜尋甜橙CsTRXh1蛋白在克萊門柚(C.clementina)、 芒 果 (Mangifera indica)、 可 可(Theobroma cacao)、棗 (Ziziphus jujuba)、梅 (Prunus mume)、蘋果 (Malus domestica)、油菜 (Brassica napus)和擬南芥等物種中的同源基因，并利用CsTRXh1和同源基因的氨基酸序列進行序列比對與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

序列比對結(jié)果表明，CsTRXh1和其他物種中的同源蛋白高度保守，序列相似度較高（圖2）。甜橙CsTRXh1蛋白與克萊門柚TRXh蛋白相似性最高，達到99.2%；與蘋果TRXh蛋白相似性最低，為83.9%。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CsTRXh1及其同源蛋白分為三簇（圖3），其中，梅、蘋果、棗和可可的TRXh1蛋白聚為一簇（I），甜橙、克萊門柚和芒果的TRXh1蛋白聚為一簇（II），油菜和擬南芥的TRXh1蛋白聚為一簇（III）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明甜橙、克萊門柚和芒果的TRXh1蛋白之間親緣關(guān)系較近，與油菜和擬南芥親緣關(guān)系較遠。

2.4 CsTRXh1基因表達分析

對感染黃龍病與健康紐荷爾成熟葉片進行CsTRXh1相對表達分析，發(fā)現(xiàn)CsTRXh1在感染黃龍病的紐荷爾葉片中上調(diào)表達，是健康葉片表達水平的4.23倍（圖4）。表明CsTRXh1的表達在黃龍病菌入侵柑橘過程中受到誘導。

2.5 CsTRXh1蛋白的亞細胞定位分析

通過激光共聚焦顯微鏡觀察CsTRXh1在煙草中的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)對照綠色熒光蛋白在細胞中均有分布，CsTRXh1在細胞中分布在細胞質(zhì)和細胞膜（圖5），推測CsTRXh1的亞細胞定位與其參與細胞氧化還原反應的生物學功能相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

在植物抗病反應中，活性氧產(chǎn)生是一個常見的應答過程?；钚匝醢l(fā)揮多個生物學功能，包括作為抗菌劑、增強植物細胞壁結(jié)構(gòu)、誘導細胞過敏性壞死、激活鄰近細胞的防衛(wèi)反應和參與系統(tǒng)獲得性抗性的建立等[13,14]。甜橙感染黃龍病后，其韌皮部過氧化氫含量顯著升高，而活性氧清除劑可以抑制過氧化氫積累[2,15]。在植物細胞內(nèi)，活性氧清除需要復雜的酶組分體系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、硫氧還蛋白（TRX）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）等[16,17]。本研究利用同源克隆法從甜橙中克隆1個h型硫氧還蛋白基因CsTRXh1。蛋白序列分析表明，CsTRXh1含有保守的Thioredoxin結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，CsTRXh1與其他h型硫氧還蛋白聚為一簇。這些為CsTRXh1蛋白的功能研究提供基本線索。

由于引起柑橘黃龍病的韌皮部桿菌尚不能進行離體純化培養(yǎng)，其致病機理仍不清楚[18]。利用芯片技術(shù)比較耐病種質(zhì)粗皮檸檬和感病種質(zhì)甜橙感染黃龍病后差異代謝途徑，發(fā)現(xiàn)粗皮檸檬中細胞壁合成相關(guān)基因和多個β-1,3-葡聚糖酶基因上調(diào)表達[19]。同樣地，通過芯片比較感染黃龍病甜橙品種哈姆林和瓦倫西亞及健康甜橙的果皮、維管以及果肉中轉(zhuǎn)錄本的變化，發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病顯著影響轉(zhuǎn)運蛋白和碳水化合物代謝相關(guān)基因的表達水平，此外，一個硫氧還蛋白基因（Cit.20400.1.S1_s_at）表達量上調(diào)高達7.4倍[20]。使用RNA-seq技術(shù)解析耐病種質(zhì)箭葉橙與感病種質(zhì)甜橙的差異表達基因，結(jié)果表明多數(shù)參與細胞壁代謝和次生代謝相關(guān)的基因在感染黃龍病的箭葉橙中上調(diào)表達，不同的是硫氧還蛋白M3基因在感染黃龍病的甜橙中下調(diào)表達[21]。本研究中，利用qRT-PCR技術(shù)檢測感染黃龍病與健康紐荷爾臍橙中硫氧還蛋白基因CsTRXh1的表達水平，發(fā)現(xiàn)CsTRXh1在感染黃龍病的紐荷爾臍橙中上調(diào)達4.23倍。因此，推測硫氧還蛋白參與柑橘黃龍病的免疫應答，但是不同成員的功能存在差異。

本研究克隆得到了甜橙中一個硫氧還蛋白基因CsTRXh1，其編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和延伸連組成，CsTRXh1受黃龍病菌侵染誘導表達，在細胞中定位于細胞質(zhì)和細胞膜。這些結(jié)果表明CsTRXh1參與黃龍病菌入侵生物學過程的應答，后續(xù)研究可以進一步通過農(nóng)桿菌介導法將CsTRXh1基因遺傳轉(zhuǎn)化甜橙，獲得過表達株系后，檢測轉(zhuǎn)基因植株對柑橘黃龍病的抗性，將有助于進一步揭示CsTRXh1基因的功能，為解析硫氧還蛋白參與柑橘黃龍病應答反應的分子機制提供參考。