林裕勝，黃麗麗，江錦秀，張靖鵬，劉維巍,，劉慶華，胡奇林*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十一師第五中學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】羊口瘡（Orf）是羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種接觸性、嗜上皮性的人畜共患病，給養(yǎng)羊業(yè)造成較大的危害，已經(jīng)成為養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。我國新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、湖北和福建等地均有報道。該病一年四季均可發(fā)病，春秋季節(jié)最為多發(fā)。目前，在Orf的治療方面，臨床上仍無有效的抗病毒藥物，主要依靠接種疫苗、藥物治療及加強飼養(yǎng)管理防治該病。但是，現(xiàn)有疫苗免疫效果不理想[1]。因此，迫切需要從分子水平探討ORFV感染和致病機理，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)，尋找安全有效的防治方法?！厩叭搜芯窟M展】ORFV為痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒屬（Parapoxvirus）的代表種[2-3]。ORFV病毒基因組大小長約134～139 kb，鳥嘌呤和胞嘧啶占比（GC含量）為64%，至少包含134個基因編碼區(qū)（ORF），具有封閉的末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，基因組中央編碼區(qū)ORF009～ORF111高度保守，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制、形態(tài)和結(jié)構(gòu)；兩端重復(fù)序列ORF001～ORF008和ORF112～ORF134，與免疫調(diào)節(jié)、免疫逃逸和病毒毒力等相關(guān)，比如ORFV編碼的病毒白細(xì)胞介素10（127）能夠抑制宿主的炎癥反應(yīng)，干擾素抑制蛋白（020）能夠抑制宿主細(xì)胞分泌的干擾素作用，趨化因子結(jié)合抑制蛋白（112）能夠抑制宿主免疫細(xì)胞的運輸， 血管內(nèi)皮生長因子（132）能夠增加細(xì)胞底物用于病毒自身的復(fù)制，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子/白細(xì)胞介素2抑制蛋白（117）具有抑制宿主細(xì)胞 GM-CSF和IL-2的雙重活性，抗細(xì)胞凋亡因子（125）通過抑制宿主細(xì)胞的凋亡促進病毒的入侵，ANK蛋白（008、123、126、128、129）能夠通過 F-box-like 結(jié)構(gòu)域降解宿主的抗病毒因子，從而促進病毒復(fù)制和感染不同物種[4-8]；此外ORFV還通過編碼多種蛋白（002、024、073、119、121）抑制核轉(zhuǎn)錄因子 κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同過程[9-12]?！颈狙芯壳腥朦c】ORFV兩側(cè)末端基因多數(shù)與病毒的免疫逃避機制和致病機制有關(guān)，因此開展末端基因的研究具有重要的價值[9-10]。115基因位于ORFV基因組末端變異區(qū)，其潛在功能可能與宿主范圍相關(guān)；該基因編碼的蛋白質(zhì)是具有親水性、不穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)比較松散的蛋白質(zhì)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過克隆ORFV FJND株115基因并進行原核表達(dá)，以期為研究ORFV115基因的功能及ORFV致病機制提供研究素材。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ORFV FJ-ND株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草食動物病研究中心分離、鑒定和保存。原核表達(dá)載體pGEX-6P-1、高保真酶 1-5TM2X High Fidelity Master Mix、pMC100-M Top-cloning Mix試劑盒購自齊美欣科生物技術(shù)有限公司；PremixTaq（ExTaqVersion 2.0 plus dye）、T4 DNA連接酶、Marker等購自寶生物（大連）工程有限公司； 大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、RosettaganmiB（DE3）感受態(tài)、IPTG、X-gal、LB瓊脂（肉湯）培養(yǎng)基、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ購自NEB（北京）有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計

參考GenBank中收錄的NZ2株（No.DQ184476.1）115基因序列，利用primer 6.0軟件設(shè)計1對特異性引物，F(xiàn): CGGGATCCATGGCGTGTTTTATCGAATG，R: GCGTCGACTCATTCCGAGGAGGAGAAG，分別帶BamH Ⅰ和R端SalⅠ的酶切位點。引物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

1.3 115基因克隆

按照生工生物工程（上海）股份有限公司提供的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒說明書提取ORFV FJ-ND株DNA，以抽提的DNA為模板，用設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增。擴增體系為：高保真酶 1-5TM2X High Fidelity Master Mix 10 μL，上、下游引物 10 μmol·L-1各 1 μL，模板 2 μL，RNase-Free H2O 6 μL，反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃15 s，72 ℃ 15 s，34個循環(huán)；72 ℃ 7 min。目的片段經(jīng)膠回收后連接至pMC100-M載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，驗證正確的陽性克隆并送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pGEX-6P-1質(zhì)粒和克隆質(zhì)粒pMC100-M-115同時進行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含有Amp抗性的LB瓊脂平板上，通過菌液PCR、雙酶切鑒定，鑒定正確的菌液進行擴大培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，隨后送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pGEX-6P-115陽性質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入表達(dá)菌株RosettaganmiB（DE3）感受態(tài)，劃線接種于含Amp的LB瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取過夜培養(yǎng)的單個菌落于含Amp的新鮮LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r·min-1振蕩過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)物 3 mL按 1∶100的比例轉(zhuǎn)接于 300 mL含 Amp的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，測OD600nm約為0.6時加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)4 h后取1 mL 誘導(dǎo)產(chǎn)物，于 4 ℃、8 000 r·min-1離心 5 min 收集菌體沉淀，用1×PBS清洗菌體沉淀3次，最后加入100 μL DEPC水重懸沉淀，SDS-PAGE蛋白電泳檢測，并設(shè)置誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的空載菌、未誘導(dǎo)的重組菌做陰性對照，以確定蛋白表達(dá)情況。在重組菌初步誘導(dǎo)表達(dá)后，37 ℃條件下分別設(shè)置不同IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間，即IPTG終濃度為0.4 、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1條件下進行誘導(dǎo)，確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度；重組菌在最佳IPTG誘導(dǎo)濃度條件下，設(shè)置不同的誘導(dǎo)時間，即在2 、3、4、5和6 h條件下進行誘導(dǎo)，其他條件保持不變，確定最佳誘導(dǎo)時間。

1.6 重組蛋白的可溶性分析

重組誘導(dǎo)菌經(jīng) 4 ℃、8 000 r·min-1離心 5 min 收集菌體沉淀，用1×PBS清洗菌體沉淀3次，加入30 mL的DEPC水重懸沉淀，重懸菌體沉淀經(jīng)超聲破碎（超聲5 min，工作3 s，間歇4 s，保護溫度25 ℃，功率30%，共超聲破碎20～30 min），超聲后的菌體經(jīng)4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min，分離上清和沉淀，并向沉淀中加入3 mL DEPC水混勻，取少量樣品進行10倍稀釋，其余樣品-20 ℃保存。取稀釋后的沉淀及破碎后分離的上清，加入4×SDS Buffer用移液槍吹打混勻，沸水煮6 min ，樣品冷卻后進行SDSPAGE檢測。

1.7 重組蛋白的純化

根據(jù)北京天恩澤基因科技有限公司包涵體純化試劑盒進行蛋白純化。

2 結(jié)果與分析

2.1 115基因PCR擴增與克隆

以O(shè)RFV FJ-ND株DNA為模板， PCR擴增115基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見1條450 bp左右條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1）。目的片段經(jīng)膠回收后連接至pMC100-M載體上，克隆質(zhì)粒pMC100-M-115經(jīng)酶切得到450 bp左右的片段，測序結(jié)果與GenBank中公布的15株ORFV全基因組序列的115基因序列比較同源性為85.96%～98.89%。

2.2 重組質(zhì)粒鑒定

挑單菌落接種LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進行質(zhì)粒PCR， 擴增條帶大小與預(yù)期相符（圖2），用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒，分別得到一個約5 000 bp條帶，與 pGEX-6P-1大小相等；另一個片段約450 bp，與目的片段大小相符（圖3）。

2.3 陽性重組菌誘導(dǎo)表達(dá)

pGEX-6P-115重組菌在37 ℃下通過對表達(dá)時間和IPTG終濃度條件進行優(yōu)化，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示37 ℃ IPTG終濃度為1 mmol·L-1、誘導(dǎo)表達(dá)4 h為重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件（圖4、5）。

2.4 表達(dá)蛋白的可溶性分析

重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，重懸菌體沉淀經(jīng)超聲破碎，分離上清和沉淀并進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)重組菌破碎后上清中未出現(xiàn)目的蛋白條帶，在沉淀中出現(xiàn)42 kDa左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。

2.5 重組蛋白純化結(jié)果

誘導(dǎo)表達(dá)得到的重組菌經(jīng)處理后，使用北京天恩澤基因科技有限公司生產(chǎn)的包涵體純化試劑盒進行純化，純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖7所示，在42 kDa左右處出現(xiàn)目的蛋白條帶，且主帶突出，幾乎無其他雜帶。

3 討論與結(jié)論

在長期的進化過程中，ORFV基因組編碼一系列免疫調(diào)節(jié)和致病性相關(guān)基因，通過各種表達(dá)產(chǎn)物限制宿主的免疫清除，致使該病疫苗免疫效果不理想，此外ORFV的毒性基因功能尚未完全明確，其致病機理還有待于進一步闡明。雖然目前已鑒定了多個ORFV的末端基因，如002、112、121和127等，其靶標(biāo)主要為宿主的細(xì)胞因子、趨化因子和NF-κB信號途徑等[9-12]，這些基因協(xié)同作用使ORFV具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用[13]；但仍有些毒性基因的功能不太清楚，如009、016和115基因等[14]。

本研究通過設(shè)計特異性引物，采用PCR技術(shù)擴增出ORFV FJ-ND株115基因，將其克隆至pMC100-M克隆載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并進行藍(lán)白篩選，挑取陽性克隆子，提取其質(zhì)粒，通過PCR、雙酶切鑒定以及測序進行驗證。測序結(jié)果顯示 ORFV FJ-ND株115基因全長 450 bp，編碼149個氨基酸。隨后將115基因連接到pGEX-6P-1原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌RosettaganmiB（DE3）中進行表達(dá)；通過對IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化以確定最佳表達(dá)條件，表達(dá)產(chǎn)物純化后進行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，在37 ℃下最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間4 h和IPTG終濃度為1 mmol·L-1；重組蛋白大小約為42 kDa；可溶性分析結(jié)果表明該重組蛋白主要以包涵體形式存在，這可能與該原核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)有關(guān)；利用包涵體純化試劑盒進行純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，已純化出單一目的蛋白。本研究結(jié)果為下一步制作單克隆抗體以及細(xì)胞表位篩選打下堅實基礎(chǔ)。ORFV兩側(cè)末端基因具有較高的中間變異性，且大多數(shù)與病毒的致病機制有關(guān)，因此開展末端變異區(qū)的研究對于解析該病毒致病機制具有重要作用[15]。通過對GenBank中公布的15株ORFV全基因組序列進行對比發(fā)現(xiàn)，15株ORFV008基因之間相似性在94.20%以上，15株ORFV113基因之間相似性在94.20%以上，15株ORFV121基因之間相似性在90.88%以上，15株ORFV122基因之間相似性在94.88%以上，15株ORFV115基因之間的相似性在85.96%以上。ORFV末端基因（008、019、020、023、121、122、127）原核表達(dá)蛋白多以包涵體形式存在，然而包涵體的形成原因較為復(fù)雜，除了外界因素可以影響其形成外，還與蛋白內(nèi)部是否存在信號肽等結(jié)構(gòu)也有較大關(guān)系。據(jù)報道信號肽結(jié)構(gòu)有利于提高蛋白質(zhì)的可溶性，無信號肽結(jié)構(gòu)可能因可溶性較低而更容易形成包涵體[16]。

綜上，本研究克隆了ORFV115基因，成功構(gòu)建了pGEX-6P-115原核表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化了重組蛋白表達(dá)條件并進行純化，將為進一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主過程中的機制和作用奠定基礎(chǔ)。