王 健，張海歐，楊晨曦，李 娟*

（1.自然資源部退化及未利用土地整治重點實驗室，陜西 西安 710075；2.陜西地建土地工程技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075）

0 引言

【研究意義】自20世紀中葉以來，化石燃料的大量燃燒、化肥的過量使用以及過度放牧等人類活動導(dǎo)致大氣中的活性氮氧化物含量激增，大氣氮素沉降也呈迅猛增加的趨勢[1]。有研究表明，2010年我國華北平原部分經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)氮沉降速率已接近30 kg·hm-2·a-1[2]。人為干擾下的大氣氮素沉降已成為全球氮素生物化學(xué)循環(huán)的一個重要組成部分，大氣氮沉降速率的急劇增加將嚴重影響生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和穩(wěn)定性[3]。由于自然生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和生物多樣性對外源氮的敏感性，氮沉降對植物的影響受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[4-6]。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是土壤里廣泛分布的一類有益微生物，能與絕大多數(shù)的陸生植物形成菌根互惠共生體[7]。AM真菌通過其密集的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)幫助宿主植物汲取土壤中的水分和無機營養(yǎng)，換取宿主植物光合作用產(chǎn)物用于自身的生長繁殖。預(yù)測大氣氮沉降速率增加的背景下，研究AM真菌對作物，尤其是對莊稼作物的影響，對于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的施肥管理具有重要的理論和實踐意義。【前人研究進展】研究表明，AM真菌能顯著提高宿主植物對氮、磷的吸收，進而提高其生物量[8]。此外，氮沉降引起的土壤氮含量增加會直接影響AM真菌的多樣性和功能，進而影響植物的生長[9]。Johnson等[10]發(fā)現(xiàn)在氮受限制的土壤環(huán)境下，氮含量的增加有利于菌根與植物形成共生，而Jiang等[11]的研究結(jié)果則表明在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中隨著氮含量的增加，AM真菌與植物的關(guān)系逐漸由共生變?yōu)榱思纳?。由此可見，AM真菌在不同氮環(huán)境下或不同生態(tài)系統(tǒng)中，形成菌根的能力不同，對植物生長效應(yīng)也不同。張旭紅等[12]研究證明，AM真菌對宿主植物的有效性決定了他們之間的相互選擇性。【本研究切入點】先前關(guān)于不同施氮背景下的宿主植物對AM真菌的響應(yīng)研究主要集中于高寒草甸或干旱半干旱性草原，且供試宿主也多以草本植物為主。一年生草本植物高粱（Sorghum hicolorL.Mocrnch）是關(guān)中平原地區(qū)常見的糧食作物，又因其侵染率高、生物量大、根系發(fā)達、生長速度快，常被作為AM真菌功能研究的模式宿主之一。當前我國關(guān)中平原地區(qū)高粱復(fù)種指數(shù)高、氮肥施用量大且利用效率低。關(guān)中平原地區(qū)高粱氮肥減施增效技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用對我國粗糧生產(chǎn)具有典型性和引領(lǐng)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以高粱為研究對象，通過溫室盆栽模擬試驗探究AM真菌和氮添加對高粱生物量及氮磷吸收的影響，旨在為全球氣候變化背景下AM真菌生理生態(tài)學(xué)的研究提供一定的科學(xué)依據(jù)，為我國高粱的高產(chǎn)種植以及微生物肥料的制備提供實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種為摩西球囊霉（Glomus mosseae），以高粱為宿主植物擴繁得到，每克菌劑含有110個孢子，包括植物根斷、菌絲等。菌種來自蘭州大學(xué)細胞活動與逆境適應(yīng)教育部重點實驗室。供試高粱品種為京雜抗四雜交高粱（Sorghum hicolorL.Mocrnch），來自陜西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。供試盆栽基質(zhì)為河沙與沸石混合物[V（河沙）∶V（沸石）=1∶1]，沸石和河沙購自北票市天翊沸石礦業(yè)有限公司，河沙粒徑1 cm，沸石粒徑2 cm。洗凈后，混合均勻，121 °C滅活2 h，隔天再滅活1次備用。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計，設(shè)置2個接種處理和4個施氮處理。2個接種處理為接種AM真菌菌劑（+AMF）和接種滅活A(yù)M菌劑（-AMF）；4個施氮水平（以NH4NO3形式添加）分別為0、200、400、500 mg·kg-1，相當于 0、10、20、30 kg·hm-2·a-1氮沉降水平，分別用N0、N1、N2和N3表示；試驗共8個處理，每個處理6盆，總計48盆。

1.3 試驗方法

試驗于2020年5月15日至9月15日在陜西地建土地工程技術(shù)研究院溫室內(nèi)進行。高粱種子用10%的NaClO表面消毒后，于無菌沙中催芽。待種子出芽后，移苗于培養(yǎng)盆（直徑37.5 cm×高度34.5 cm）內(nèi)（基質(zhì)約10 kg·盆-1），施以hoagland營養(yǎng)液維持植物正常生長，每兩周一次，一次200 mL。2周后，每盆定苗5株幼苗，并在+AMF處理組幼苗根系穴施AM菌劑15 g·盆-1，在-AMF處理組幼苗根系穴施滅活A(yù)M菌劑15 g·盆-1。將定量的NH4NO3溶于水中，分別于第4周、第6周、第8周以及第12周加入不同施氮處理盆中。溫室光強為120 μmol·m-2·s-1，晝夜交替時間為15 h/9 h，晝夜交替溫差為23 ℃/16 ℃，生長周期為4個月，每隔一周隨機移動花盆的位置[13]。待植物生活史完成后，分別收集植物地上莖葉和地下根系，取部分鮮細根系用于侵染率的測定，剩余樣品用于生物量的測定，烘干的植物組織粉碎后用于氮磷含量測定。

1.4 測定指標方法

1.4.1 菌根侵染率 取鮮根樣1 g左右裝入試管中，加入10% KOH溶液沒過根樣，于水浴鍋（70～80 ℃）中堿化處理15~30 min，自來水沖洗3遍；加入2%HCL溶液沒過根樣于水浴鍋中酸化處理30 min，自來水沖洗3遍；加入0.05% 臺盼藍[V（乳酸）∶V（甘油）∶V（水 ）=1∶1∶1]染 色 10 min， 自 來 水 洗 3遍 ；染色后的根樣剪成1 cm左右的根斷，均勻地鋪在涂有PVLG的載玻片上，蓋上蓋玻片，小心壓片至皮層被壓開。制備好的裝片置于顯微鏡下（200×）觀察并計數(shù)[14]。

式中，A為每個樣品中觀察到的有叢枝結(jié)構(gòu)的視野數(shù)；V為每個樣品中觀察到的有泡囊結(jié)構(gòu)的視野數(shù)；N為每個樣品中沒觀察到任何菌根侵染的視野數(shù)；T為每個樣品中觀察的總視野數(shù)。

1.4.2 生物量及氮磷含量測定 將高粱收獲后的地上部分、洗凈后的地下部分分別裝信封后，于恒溫干燥箱（60 ℃）中烘干48 h至恒重，稱其生物量。烘干后的植物組織經(jīng)球磨儀粉碎，過100目篩，制成供試樣品。取0.2 g供試樣品，精準置于消煮管底部，加 1 g催化劑 [m（K2SO4）∶m（CuSO4）∶m（硒粉） = 100∶10∶1]，加入 5 mL濃硫酸靜置碳化 30 min，于消煮爐420 ℃消煮約40 min，直至消煮液呈現(xiàn)透明的青綠色。待冷卻后，將消煮液轉(zhuǎn)移到容量瓶內(nèi)，用蒸餾水定容至50 mL，用流動注射分析儀測定植物組織氮磷含量（QuikChem 8500）[15]。

1.5 菌根效應(yīng)計算

計算菌根生長效應(yīng)（Mycorrhizal growth response,MGR）、菌根氮吸收效應(yīng)（Mycorrhizal N-uptake response, MNR）和菌根磷吸收效應(yīng)（Mycorrhizal P-uptake response，MPR），評估不同氮梯度下AM真菌對植物的影響作用[16]，下面用MGR為例來進行說明。

其中，NMmean代表每一個氮水平下-AMF處理組高粱生物量的平均值，AM代表每一個氮水平下+AMF處理組高粱的總生物量。同樣地，MNR和MPR也按公式（4）來計算。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)整理，原始數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布后進行下一步數(shù)據(jù)分析，由R語言（R version 3.3.2）進行統(tǒng)計分析和圖表繪制。施氮和接種AM真菌處理對侵染率變量、植物生物量以及植物組織氮磷含量的影響利用雙因素方差分析進行分析。采用Duncan多重檢驗比較不同處理下各因變量之間的差異（P≤0.05），采用T-test比較各因變量在+AMF處理和-AMF處理之間的差異（P≤0.05）。此外，利用線性回歸分析不同氮水平下菌根效應(yīng)的變化規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加及接種AM真菌對高粱菌根侵染率的影響

由表1可以看出，摩西球囊霉可與高粱宿主形成良好的共生。不接種AM真菌處理（-AMF）組的高粱根系均沒有AM真菌侵染；而接種AM真菌（+AMF）顯著促進了高粱根系的菌根侵染率（P＜0.001）、叢枝侵染率（P＜0.001）和泡囊侵染率（P＜0.001）。此外，菌根侵染率（P＜0.001）和泡囊侵染率（P＜0.001）受氮添加影響顯著，表明在不同氮水平處理下，AM真菌對高粱的侵染能力存在明顯差異；隨著氮施肥梯度增加，菌根侵染率和泡囊侵染率隨之增加，高氮水平可以抑制AM真菌對宿主的侵染。

表1 不同處理下高粱菌根侵染狀況Table 1 AM fungi colonization on inoculated sorghum plants grown on soil with varied N deposition

2.2 氮添加及接種AM真菌對高粱生物量及根冠比的影響

由圖1可以看出，施氮顯著促進了高粱地上生物量（P＜0.001）和總生物量（P＜0.001），降低了高粱根冠比（P＜0.001），但對地下生物量沒有顯著影響（P＞0.05）。地上生物量和總生物量隨著氮肥施用量的增加而增加，根冠比則隨著氮肥施用量的增加而降低。接種AM真菌對高梁地上生物量、地下生物量、總生物量以及根冠比在全部水平下無顯著影響（P＞0.05），表明在各個氮處理水平下接種AM真菌對高粱的生物量影響不大。在未施氮處理（N0）組，接種AM真菌顯著提高了高粱的地上生物量和總生物量（P＜0.05）；在高水平氮添加下（N3），接種AM真菌顯著抑制了高粱的地上生物量和總生物量（P＜0.05）；在N2和N3處理下，接種AM真菌顯著增加了高粱的根冠比（P＜0.05）。此外，由圖1可以看出，接種AM真菌和氮添加處理對高粱的地上生物量（P＜0.001）、地下生物量（P＜0.05）、總生物量（P＜0.001）以及高粱根冠比（P＜0.05）存在顯著的交互作用。

2.3 氮添加及接種AM真菌對高粱氮磷吸收的影響

雙因素方差分析結(jié)果表明施氮顯著增加了高粱植株的全氮含量（P＜0.001），接種AM真菌對高粱植物的全氮含量無顯著差異（P＞0.05），施氮和接種對高粱組織的全氮含量存在顯著交互作用（P＜0.001）。在未施氮處理組接種AM真菌顯著增加了高粱植株的全氮含量（P＜0.05），而在高水平氮添加下（N2和N3），接種AM真菌顯著降低了高粱植株的全氮含量（P＜0.05）（圖2-a）。由圖2-b可以看出，高粱組織的全磷含量（P＜0.05）受氮添加處理的影響達到了顯著水平，而受AM真菌接種的影響較弱，此外，施氮和接種AM真菌對高粱組織的全磷含量存在顯著交互作用（P＜0.001），在未施氮處理下，接種AM真菌顯著促進了高粱植株的全磷含量（P＜0.05），而在高水平氮添加下（N3），接種AM真菌對植株全磷含量則表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.05）。施氮顯著促進了高粱植株的氮磷比（P＜0.001），接種AM真菌對高粱植株的氮磷比在各氮水平梯度下無顯著影響（P＞0.05），但在未施肥處理組，接種AM真菌顯著提高了高粱的氮磷比；接種AM真菌和氮添加對高粱的氮磷比的影響也不存在顯著的交互作用（P＞0.05）（圖2-c）。

2.4 氮添加及接種AM真菌對高粱生長的交互效應(yīng)

由圖3-a可知，施氮顯著影響了高粱的菌根生長效應(yīng)，在N0和N3處理組，AM真菌對高粱植株的促生效應(yīng)MGR的影響達顯著水平（P＜0.05），菌根生長效應(yīng)隨氮施肥梯度的增加而逐漸降低，呈線性關(guān)系（R2= 0.81，P＜0.001）。菌根氮吸收效應(yīng)（MNR）（R2= 0.93，P＜0.001）和菌根磷吸收效應(yīng)（MPR）（R2= 0.88，P＜0.001）和氮添加梯度呈線性關(guān)系，均隨氮添加濃度的增加而降低，且在N0、N2和N3均達到顯著水平。

3 討論與結(jié)論

菌根侵染率是AM真菌與宿主植物建立共生成功與否的重要標志，并在一定程度上決定著宿主植物的生長和抗逆能力[17]。泡囊和叢枝是AM真菌的根內(nèi)菌絲特化的結(jié)構(gòu)，其數(shù)量決定著菌根共生體內(nèi)物質(zhì)交換的頻率和強度[18]。菌根侵染率既受宿主植物限制，也受土壤速效氮、磷含量制約[19]。目前，土壤速效磷含量對菌根侵染率的影響已被深入研究[20-21]，相對而言，氮添加處理對菌根侵染率的影響研究較少。已有研究結(jié)果表明，土壤中速效氮含量過高會降低AM真菌對宿主植物的侵染[22]，而在氮素缺乏的地區(qū)，施氮則有利于AM真菌對宿主植物的侵染[23]。本研究中，在未施氮處理組，AM真菌的菌根侵染率和泡囊侵染率均最高，且隨著氮水平的不斷增加，AM真菌的菌根侵染率和泡囊侵染率逐漸降低，Jiang等[11]在模擬氮沉降對青藏高原優(yōu)勢種垂穗披堿草的生長效應(yīng)時，也發(fā)現(xiàn)氮添加逐漸降低了AM真菌的菌根侵染率。張彩麗[24]從超微結(jié)構(gòu)上得出，氮添加對植物根系造成傷害，導(dǎo)致細胞線粒體腫脹、細胞質(zhì)分解等現(xiàn)象。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)叢枝受氮添加的影響不大，這可能和叢枝的特性有關(guān)。不同于泡囊和菌絲，叢枝在植物根系皮層細胞內(nèi)的壽命較短，一般新形成的叢枝1~2周就會被植物根系細胞的內(nèi)分泌酶消化掉，目前理論尚不能解釋為什么叢枝的壽命如此之短。

氮、磷是植物生長不可或缺的營養(yǎng)元素，參與了植物體內(nèi)許多重要化合物的組成及代謝途徑[25]。前人的研究表明，接種AM真菌可以促進宿主植物對土壤氮、磷的吸收，尤其在土壤養(yǎng)分匱乏的地區(qū)[26-28]。本研究中在未施肥處理組（N0）中，接種AM真菌顯著提高了高粱的地上生物量及組織氮、磷含量，這與徐如玉等[27]的研究一致。AM真菌對宿主植物的促生作用主要得益于AM真菌密集的根外菌絲和無隔的菌絲內(nèi)壁。通過AM真菌菌絲的磷轉(zhuǎn)運要比通過植物根系的磷轉(zhuǎn)運效率高10倍左右，植物體內(nèi)約90%的磷和25%的氮是通過AM真菌的菌絲獲得[29]；此外，AM真菌提高植物營養(yǎng)吸收的原因還在于其土壤里密集的根外菌絲，尤其土壤中的速效磷容易受土壤膠體吸附，擴散系數(shù)低，隨著土壤中植物根系對磷的吸收，很快就會形成一個磷匱乏區(qū)，而AM真菌的根外菌絲網(wǎng)可以達到植物根系到達不了的地方，擴大了植物根系的吸收面積，大大增加了植物對磷的吸收[30]。

AM真菌對宿主植物的促生效應(yīng)與土壤環(huán)境條件密切相關(guān)。在一定土壤養(yǎng)分范圍內(nèi)，菌根的促生效應(yīng)隨土壤養(yǎng)分的減少而增強，原因在于土壤養(yǎng)分較低時，植物生長受限，光合作用產(chǎn)物向根系及AM真菌分配減少，此時適當施肥便能增加AM真菌侵染，從而增加宿主植物對土壤速效養(yǎng)分的吸收，促進其生長發(fā)育，大部分的研究證明了這一點[10,31-32]。此外，AM真菌和土壤養(yǎng)分在促進植物生長方面存在交互作用，一方面，植物的生長需要充足的氮源；另一方面，過量的氮素又會抑制AM真菌和宿主植物的共生，進而影響菌根的有益效應(yīng)[33]。本研究分析高粱的生物量及組織氮磷含量，發(fā)現(xiàn)隨著氮添加量的增加，菌根對植物的有益效應(yīng)由正效應(yīng)（共生關(guān)系）逐漸變?yōu)樨撔?yīng)（寄生關(guān)系），這一點和Jiang等[11]的研究結(jié)果一致。主要是由于高水平氮添加情況下，植物通過根系可以吸收氮素滿足植物生長需求，而不需要額外負擔真菌的營養(yǎng)分配，高氮水平下的低菌根侵染率可以很好地說明這一點。本試驗表明，在低水平氮添加下，接種AM真菌可以提高高粱的氮磷含量及生物量，而在高氮條件下，接種AM真菌高粱組織氮磷含量及生物量不升反降。因此，要充分發(fā)揮AM真菌的菌根效應(yīng)，需首先了解當?shù)氐耐寥鲤B(yǎng)分條件，尤其在全球氮沉降背景加劇的情況下。此外，氮沉降導(dǎo)致高粱生物量降低，一定程度上也是因為高氮水平下，AM真菌和宿主植物處于一種寄生關(guān)系，AM真菌在不需要消耗能量的情況下，參與宿主植物的光合產(chǎn)物分配，最后以根外菌絲、孢子及其次級代謝產(chǎn)物（球囊霉素）的形式存在。研究表明AM真菌孢子以及球囊霉素是土壤碳庫的重要組成部分[34]，AM真菌在土壤高氮水平下，一定程度上減緩了土壤碳的釋放。

終上所述，接種AM真菌顯著增加了高粱的菌根侵染率，隨著氮濃度的增加，高粱菌根侵染率和泡囊侵染率逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌和模擬氮沉降對高粱的菌根生長效應(yīng)（MGR）、菌根氮吸收效應(yīng)（MNR）及菌根磷吸收效應(yīng)（MPR）存在顯著的交互效應(yīng)。未施氮處理（N0）時，接種AM真菌顯著促進了高粱的MGR、MNR以及MPR；但隨著氮梯度的增加，高粱的MGR、MNR以及MPR逐漸由正效應(yīng)轉(zhuǎn)為負效應(yīng)，當模擬氮沉降濃度達到400 mg·kg-1（N2）時，接種AM真菌顯著抑制了高粱的MNR以及MPR；當模擬氮沉降濃度繼續(xù)增加到 500 mg·kg-1（N3）時，高粱的 MGR、MNR以及MPR均受AM真菌抑制。本試驗選用的是單一的AM菌種，不同的AM菌種，尤其是混合菌種對氮的耐受性不盡一致，且本研究所采用的盆栽試驗，與外界大田所處的氮沉降仍會有一定差異，后期需進一步研究。