林 靜，張 揚(yáng)，林建新，盧和頂，陳山虎，廖長見

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省特色旱作物品種選育工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】玉米是我國最大的糧、飼兼用作物，隨著人民生活水平的提高，玉米已經(jīng)不單單作為糧食和飼料，多用途玉米品種的培育日益受到育種家的重視[1]。甜玉米（Zea maysL.saccharataSturt）又稱水果、蔬菜玉米，是玉米屬（Zea maysL.）的一個(gè)亞種[2]。由于甜玉米可溶性糖含量較高，甜味濃郁，并攜帶玉米特有的香味，深受消費(fèi)者喜歡。此外，甜玉米還富含多種維生素、氨基酸、礦物質(zhì)及多種微量元素易于人體吸收，因此具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[3]。我國消費(fèi)群體基數(shù)很大，對(duì)甜玉米的需求量巨大，然而我國甜玉米的育種、栽培和加工、貯藏產(chǎn)業(yè)起步較晚，產(chǎn)業(yè)成熟度不高，因此甜玉米上游產(chǎn)業(yè)鏈，特別是新品種的培育等工作亟待加強(qiáng)[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從品質(zhì)上甜玉米可分為普甜、超甜和加強(qiáng)型甜玉米[7]，其形成的機(jī)制主要是普通玉米籽粒中一個(gè)或幾個(gè)基因發(fā)生突變，造成淀粉合成受阻，從而導(dǎo)致可溶性糖（如蔗糖）的積累。相關(guān)基因有sh1、sh2、su1、bt1、bt2、ae1等[8-9]。這些基因表達(dá)的大多是玉米籽粒淀粉合成途徑中涉及到的酶，包括蔗糖合酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶和顆粒結(jié)核型淀粉合成酶。其中蔗糖合酶（Sucrose synthase，Sus）在植物中可形成同源四聚體，主要負(fù)責(zé)催化蔗糖水解[10-14]，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，也是蔗糖合成淀粉途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)調(diào)控植物不同組織中細(xì)胞壁成分或淀粉合成，與植物生長發(fā)育過程密切相關(guān)。因此，玉米中蔗糖合酶的功能缺失突變體有利于糖分的積累，編碼蔗糖合酶的基因包括Sh1,Sus1和Sus2（Sus3）等[15-17]。Zhu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，糖類含量（蔗糖）與果實(shí)品質(zhì)密切相關(guān)，而Sus活性能直接影響果實(shí)中蔗糖的積累水平。趙云等[19]研究發(fā)現(xiàn)，開花后高溫處理能抑制小麥籽粒的Sus活性，從而影響籽粒中淀粉的累積。【本研究切入點(diǎn)】玉米是一個(gè)具有高異交率的作物，雜種優(yōu)勢在玉米育種被廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)雜交甜玉米育種流程包括親本篩選，配合力測定，田間鑒定及采后品鑒等過程，整個(gè)育種周期長且繁瑣。盡管一些甜玉米調(diào)控基因被廣泛鑒定和克隆，但水溶性糖分含量在雜交后代中超親遺傳作用機(jī)理的研究鮮有報(bào)到。閩雙色6號(hào)是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的超甜雜交玉米品種，其水溶性糖和還原糖含量都優(yōu)于親本，在糖代謝途徑上存在超親優(yōu)勢?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在雙親閩甜系67和閩甜系146的基因型sh2的基礎(chǔ)上，在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)編碼蔗糖合酶的基因進(jìn)行分析，探索閩雙色6號(hào)甜度超親遺傳的部分機(jī)制，旨在為今后超甜玉米的培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的雜交品種閩雙色6號(hào)及其雜交雙親閩甜系67（基因型sh2）和閩甜系146（基因型sh2），均由本課題組在壽山基地進(jìn)行繁殖和保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米蔗糖合酶基因的進(jìn)化樹和結(jié)構(gòu)分析 在Ensembl網(wǎng)站下載玉米參考基因組B73的注釋信息文件和蛋白序列（網(wǎng)站地址：http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index），根據(jù)注釋文件信息篩選蔗糖合酶基因，利用TBtool軟件[20]從B73的蛋白序列文件下載對(duì)應(yīng)蛋白序列。如果該基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，則下載最長轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析。蛋白序列進(jìn)化分析在基迪奧在線分析網(wǎng)站（https://www.omicshare.com/tools/）進(jìn)行，將運(yùn)行后獲得的result.nwk提交至iTOL網(wǎng)站（https://itol.embl.de/）進(jìn)行圖形化處理。玉米蔗糖合酶基因結(jié)構(gòu)信息使用TBtool軟件進(jìn)行繪制。

1.2.2 玉米蔗糖合酶基因的表達(dá)分析 蔗糖合酶基因在不同品系間的表達(dá)分析使用轉(zhuǎn)錄組的方法。RNA文庫制備制備如下，利用帶有Oligo（dT）的磁珠對(duì)mRNA進(jìn)行富集，使用超聲波把mRNA打斷。使用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體以片段化的mRNA為模版合成cDNA第一條鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用RNaseH降解RNA鏈。使用DNA polymerase I酶合成雙鏈cDNA，純化后加接頭，用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物再次使用AMPure XP beads純化形成最終文庫。文庫檢測合格后在Novaseq 6 000測序儀上進(jìn)行。獲得原始數(shù)據(jù)后在諾禾致源公司進(jìn)行流程化分析，獲得FPKM表達(dá)值。

1.2.3 玉米蔗糖合酶的基因序列差異分析 閩甜系67和閩甜系146的玉米蔗糖合酶基因差異分析采用二代測序的方式。文庫制備簡要描述如下樣本基因組DNA提取使用 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[21]， DNA質(zhì) 量 使 用 Nano-drop（Thermo Fisher Scientific, Waltham，MA）進(jìn)行檢測。合格的DNA利用酶隨機(jī)打斷，末端修復(fù)后加A尾，使用 NEB Next?MLtra? DNA Library Prep Kit 庫（NEB，USA）添加Illumina測序接頭，對(duì)300~400 bp的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集，檢測合格后在Nova-seq 6000測序儀上進(jìn)行。用 FASTP 軟件對(duì)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，使用BWA軟件將Raw data比對(duì)到參考玉米基因組B73上，比對(duì)參數(shù)為-k 32 -M；比對(duì)完之后結(jié)果使用軟件Picard標(biāo)記重復(fù)reads統(tǒng)計(jì)標(biāo)記后的reads深度及覆蓋度。使用變異檢測軟件 GATK進(jìn)行群體 SNP和Indel檢測，使用ANNOVAR進(jìn)行功能注釋，提取玉米蔗糖合酶的基因序列之間SNP和Indel差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米蔗糖合酶基因的家族進(jìn)化分析

對(duì)參考基因組B73進(jìn)行全基因組篩選后共發(fā)現(xiàn)18個(gè)注釋的玉米蔗糖合酶基因，對(duì)這些基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示（圖1），這18個(gè)基因可以明顯分為Group I～I(xiàn)II亞家族，分別包含1、6和11個(gè)基因。其中已報(bào)道蔗糖合酶基因Sh1、Sus1和Sus2/3均屬于Group II亞家族，且它們的蛋白序列很相近，暗示3個(gè)基因功能相似，存在功能冗余或累加效應(yīng)。此外，進(jìn)化樹結(jié)果顯示基因Zm0001d029087位于Sh1和Sus2/3之間，與3個(gè)已報(bào)道基因進(jìn)化關(guān)系密切，暗示該基因在蔗糖合成或降解途徑中具有類似功能。

2.2 玉米蔗糖合酶家族基因的結(jié)構(gòu)變異分析

對(duì)玉米蔗糖合酶家族基因的編碼區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2），發(fā)現(xiàn)該家族基因的外顯子數(shù)目為3～15個(gè)，其中Sh1基因外顯子最多，為15個(gè)，Zm00001d020527、Zm00001d014119和Zm00001d050151僅3個(gè)，表明蔗糖合酶家族基因在進(jìn)化過程中經(jīng)歷過劇烈的外顯子增加或缺失變異。此外，3個(gè)已報(bào)道基因Sh1、Sus1和Sus2/3的外顯子分別為15、14和10個(gè)，結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，暗示蔗糖降解過程需要基因的多個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同發(fā)揮作用。Zm00001d002655和Zm00001d035393等多個(gè)基因的外顯子為5個(gè)左右，且結(jié)構(gòu)一致或相似，表明它們之間功能冗余或者相似，但是否在籽粒蔗糖降解中起作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

進(jìn)一步分析這些基因在甜玉米中的潛在作用，利用重測序的方法對(duì)閩甜系67和閩甜系146的基因型與普通玉米品種B73的基因型進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示（表1）在雙親與B73間共發(fā)現(xiàn)40個(gè)有效突變位點(diǎn)，分布在11個(gè)基因上，主要為非同義突變（Nonsynonymous）和移碼突變（Frameshift）2種突變類型，分別有29、9個(gè)突變位點(diǎn)，非移碼缺失突變（No-frameshift）、終止子缺失（Stoploss）和終止子獲得（Stopgain）突變各1個(gè)。其中Sh1（Zm00001d045042）基因在閩甜系67中為正常型，在閩甜系146中為突變型；閩甜系67的Sus1（Zm00001d047253）基因與B73相比存在2個(gè)移碼突變，推測為功能缺失型，閩甜系146與B73的Sus1基因存在2個(gè)非同義突變。此外，Sus2/3基因在雙親間基因型一致，與B73相比均為突變型。綜上結(jié)果表明，已報(bào)道的3個(gè)蔗糖合酶基因在 閩甜系67和閩甜系146的基因型分別為Sh1sus1sus2/3和sh1Sus1sus2/3，部分蔗糖合酶基因功能的缺失突變構(gòu)成甜玉米閩甜系67和閩甜系146的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)為閩雙色6號(hào)的超甜特性提供了遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，兩親本中Zm00001d029087的基因型與B73一致，推測均為正常型，表明其可能在維持玉米正常代謝過程中起著關(guān)鍵作用。

表1 雙親與B73的基因型對(duì)比分析Table 1 Comparison on genotypes between parents and B73

2.3 玉米蔗糖合酶基因家族在籽粒中的表達(dá)分析

基因型差異是遺傳變異的基礎(chǔ)，是否發(fā)揮功能仍需在基因表達(dá)層面上進(jìn)行分析，因此為進(jìn)一步確認(rèn)蔗糖合酶基因家族在籽粒中的作用，對(duì)這些基因在3個(gè)品系籽粒中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖3），18個(gè)基因中有4個(gè)基因在籽粒中表達(dá)，分別是Sh1、Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087，表明蔗糖合酶基因家族在籽粒糖降解途徑中可能由這4個(gè)基因發(fā)揮功能。此外，結(jié)果顯示，Sh1和Sus1基因、Sus2/3與Zm0001d029087基因表達(dá)模式均相近，提示Zm0001d029087與Sus2/3在 功 能 上 類 似，Zm0001d029087是一個(gè)新的影響甜玉米甜度的基因。此外，從表達(dá)量上分析，Sh1的表達(dá)量在3個(gè)材料中均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087，提示Sh1在蔗糖降解過程中起主要作用。綜上結(jié)果推測閩雙色6號(hào)及其雙親的甜質(zhì)特性主要由Sh1、Sus1，Sus2/3和Zm0001d029087調(diào)控，Zm0001d029087在糖代謝中的調(diào)控功能需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 玉米蔗糖合酶家族主要基因的表達(dá)差異分析

進(jìn)一步分析超甜玉米閩雙色6號(hào)形成中的潛在分子機(jī)制，對(duì)閩雙色6號(hào)及其親本籽粒中的蔗糖合酶基因表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖4-A）Sh1的表達(dá)在閩雙色6號(hào)中顯著高于雙親，在雙親間的表達(dá)無顯著差異；閩雙色6號(hào)的Su1基因表達(dá)量顯著低于閩甜系146，高于閩甜系67（圖4-B）；此外，Sus2/3和Zm0001d029087基因在閩雙色6號(hào)中的表達(dá)顯著低于其在雙親中的表達(dá)（圖4-C、D）。閩雙色6號(hào)中4個(gè)主要蔗糖合酶基因的表達(dá)與雙親間存在顯著差異，其中Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087在閩雙色6號(hào)籽粒中表達(dá)量較低，提示它們有利于籽粒中蔗糖的積累。此外，Sh1在閩雙色6號(hào)中表達(dá)量最高，但其基因型為Sh1/sh1雜合類型，sh1屬于缺陷基因型，編碼的酶無蔗糖降解活性，理論上Sh1/sh1基因型的表達(dá)產(chǎn)物蔗糖合酶中有一半無活性，即sh1基因的表達(dá)屬于無效表達(dá)。綜上結(jié)果，從整體表達(dá)量上分析，閩雙色6號(hào)4個(gè)基因的有效表達(dá)量比雙親顯著降低，從而比親本更有利于蔗糖的積累。

3 討論

蔗糖合酶是植物中廣泛存在的一種糖基轉(zhuǎn)移酶[22]，能夠催化蔗糖的分解及合成，是蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑所必需的關(guān)鍵酶之一[23]。已知蔗糖合酶在淀粉合成、植株抗逆和植株生長等方面起著重要的作用[24]。在自然界中，大部分基因突變對(duì)植物的生存是不利的，例如蔗糖合酶基因突變直接影響其合成功能，進(jìn)一步影響植株正常的生長發(fā)育。在植物進(jìn)化過程中，為了應(yīng)對(duì)不利情況的發(fā)生或者減輕突變后引起的不利影響，植物基因組中往往存在多個(gè)功能類似的基因，這些同類基因功能互補(bǔ)或功能累加。比如玉米中已報(bào)道蔗糖合酶Sh1和Sus1，單個(gè)基因突變形成甜玉米，多個(gè)基因突變則可能形成超甜玉米，說明基因間存在功能累加效應(yīng)。此外，在本試驗(yàn)構(gòu)建的后代群體里發(fā)現(xiàn)，即使已報(bào)道的3個(gè)蔗糖合酶基因均發(fā)生突變，籽粒中仍會(huì)有淀粉形成，說明除了這3個(gè)基因外，仍存在未知基因行使蔗糖合酶類似的功能。本研究以B73的全序列為參考，在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)同類基因有18個(gè)，其中Sh1,Sus1和Sus2/3在進(jìn)化樹上分類非常相近，說明3者功能相同或相似，這與已報(bào)道結(jié)果一致[25]。Zm0001d029087與Sh1,Sus1和Sus2/3均進(jìn)化關(guān)系密切，暗示著它們功能相同或類似。本研究中基因表達(dá)分析顯示，18個(gè)基因中只有Zm0001d029087,Sh1,Sus1和Sus2/3在籽粒中有表達(dá)，且Zm0001d029087與Sus2/3表達(dá)模式相近，暗示Zm0001d029087在籽粒中具有蔗糖合酶的功能。

作物雜種優(yōu)勢是指兩個(gè)親本產(chǎn)生的F1后代在生活力、生長勢、抗病性、產(chǎn)量及品質(zhì)等方面優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。雜種優(yōu)勢在水稻和玉米等作物中均有廣泛應(yīng)用，利用方式主要以雜交種為主，目前我國現(xiàn)有甜玉米品種基本上均屬于雜交種，但玉米雜種優(yōu)勢的相關(guān)遺傳機(jī)理仍不明確。本研究中閩雙色6號(hào)水溶性總含糖量表現(xiàn)出超親優(yōu)勢。為進(jìn)一步探究這種優(yōu)勢的機(jī)理，首先對(duì)其雙親基因型進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)雙親種在已報(bào)道的3個(gè)蔗糖合酶基因Sh1、Sus1和Sus2/3中均有2個(gè)基因發(fā)生突變，說明這些突變基因是甜玉米形成的遺傳基礎(chǔ)。此外，閩雙色6號(hào)是雜交種，其Sh1和Sus1的基因型均為雜合類型。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，閩雙色6號(hào)的Sh1基因表達(dá)量顯著高于雙親，考慮到其中一部分是無功能的sh1類型，不能正確反映表達(dá)量與甜度間的相關(guān)性，后續(xù)需要分別對(duì)兩種類型Sh1的表達(dá)量進(jìn)行定量和區(qū)分。無功能基因表達(dá)或翻譯后，可能會(huì)與正?；蛐彤a(chǎn)生競爭，從而抑制正常基因的表達(dá)或功能發(fā)揮。此外，閩雙色6號(hào)Sus1的表達(dá)顯著低于親本閩甜系146中正?；蛐蚐us1的表達(dá)，說明單從Sus1基因的表達(dá)上分析，閩雙色6號(hào)的基因型有利于糖分的積累。

4 結(jié)論

本研究以閩雙色6號(hào)及其雙親為研究材料，通過重測序、轉(zhuǎn)錄組及生信分析對(duì)蔗糖合酶基因家族進(jìn)行遺傳和表達(dá)分析，解析雜種優(yōu)勢在超甜玉米形成中的遺傳機(jī)理和基礎(chǔ)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的蔗糖合酶基因Zm0001d029087，該基因可能參與蔗糖降解過程；此外，超甜玉米閩雙色6號(hào)更甜的特性主要是由于Sh1、Sus1、Sus2/3和Zm0001d029087的表達(dá)顯著降低導(dǎo)致蔗糖的積累。研究結(jié)果為雜種優(yōu)勢在超甜玉米的培育和利用提供了實(shí)例證據(jù)，并初步解析了相關(guān)形成機(jī)理。