毛萬麗，冉立,2，李杰慧,2，李鳳虎,2，常建英,2，穆珺玉，梅煩，胡麗麗,2，杜燕君,2，田雪,2，秦瑤，殷水水

0 引言

宮頸癌是全球范圍內(nèi)最常見的女性惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌、肺癌及結(jié)直腸癌，也是導(dǎo)致女性惡性腫瘤死亡的4大原因之一，2020年全球約有60.4萬新發(fā)病例和34.2萬死亡病例[1]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy,NACT）有效與否是影響無病生存率（diseasefree survival,DFS）和生存率的一個重要因素，并對患者的預(yù)后生存具有一定的預(yù)測價值[2]。約20%的宮頸癌患者因?qū)熕幬锊幻舾卸鴮?dǎo)致NACT失敗、病情進展和預(yù)后不佳[3]。因此如何預(yù)測NACT的療效、篩選出對化療不敏感的患者以便及時更改或調(diào)整治療方案來改善患者的預(yù)后生存情況具有重要的臨床價值。有研究報道生物標(biāo)志物對預(yù)測NACT的療效具有一定臨床價值[4]，其中黏附分子CD44糖蛋白可變剪接產(chǎn)生的CD44v6的表達與宮頸癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌及食管癌的腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性相關(guān)[5-6]。而EGFR是上皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，可能通過TF/FⅦa/PAR2信號通路影響化療藥物的療效[7]。本研究通過SP法檢測宮頸癌患者接受NACT前腫瘤組織中的CD44v6、EGFR的表達，結(jié)合患者臨床資料進行分析，探討CD44v6、EGFR對宮頸癌NACT療效的臨床預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2015年11月—2017年11月經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理確診為Ⅱ～Ⅲ期患宮頸癌患者53例，所有患者均接受了2周期紫杉醇+鉑類的NACT，均為我科“生物標(biāo)志物預(yù)測宮頸癌放化療敏感的可行性探索及其與預(yù)后相關(guān)性研究（注冊號ChiCTR-ONN-16008893）及紫杉醇聯(lián)合洛鉑或順鉑新輔助化療序貫同步放化療治療局部晚期宮頸癌隨機臨床研究（注冊號ChiCTRIIR-17011559）”入組患者。本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或近親屬均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)兩名以上婦產(chǎn)科副主任醫(yī)師婦科檢查及FIGO分期為Ⅱ～Ⅲ期、且有可測量的腫瘤病灶；（2）入組前均未行放療、化療及手術(shù)治療；（3）卡氏評分≥70分；（4）年齡25～75歲；（5）骨髓造血功能正常（WBC＞4.0×109/L，PLT≥100×109/L，Hb＞70g/L)；（6）肝功能：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALAT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）＜正常值上限（ULN）的1.5倍；總膽紅質(zhì)＜1.5×ULN；腎功能：血清肌酐＜1.5×ULN；（7）無重要器官的功能障礙，無嚴(yán)重的合并癥，如高血壓、糖尿病、冠心病和精神病史；（8）能理解本研究并已簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重肺部或心臟疾病病史、活動性的全身感染、濫用藥物或酒精成癮；（2）肌酐清除率＜30 ml/min；（3）同時接受本研究以外的慢性系統(tǒng)性免疫治療或者激素治療；（4）妊娠（經(jīng)血清或者尿β-HCG檢驗證實）或者泌乳期間；（5）因各種原因未按要求完成化療方案，如紫杉醇過敏、有嚴(yán)重化療反應(yīng)；（6）有體格或精神疾患，無法完全或充分理解本研究可能存在的并發(fā)癥，或無民事行為能力或者限制民事行為能力。

1.3 試劑及儀器

石蠟、甲醛、二甲苯、無水乙醇、H2O2（上海國藥集團）；廣譜二抗、DAB濃縮型試劑盒（上海長島生物技術(shù)有限公司）；蘇木素（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；中性樹脂（北京索萊寶科技有限公司）；CD44v6、EGFR（無錫傲瑞東源生物科技有限公司）；PBS溶液（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科配置）；正置顯微鏡、顯微圖像分析系統(tǒng)（日本NIKON公司）；移液器（美國吉爾森P型移液器公司）；恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司）；石蠟切片機、攤片機（湖北徠克公司）。

1.4 化療方案

紫杉醇175 mg/m2；順鉑 60～80 mg/m2（洛鉑30 mg/m2），靜脈滴注，d1，d21，21天為一周期，共2周期。

1.5 療效評價

近期療效：2周期NACT結(jié)束后，根據(jù)實體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）評價療效分為：完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、病變進展（PD）、病變穩(wěn)定（SD）。完全緩解和部分緩解為臨床有效，定義化療敏感；穩(wěn)定和進展為無效，定義為化療不敏感。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測CD44v6和EGFR的表達

NACT前行宮頸癌組織活檢，采用SP法檢測腫瘤組織中CD44v6、EGFR的表達，檢測過程中，具體準(zhǔn)備及操作步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒操作說明：（1）取石蠟包埋組織切片，脫蠟水化后，切片，置于載玻片上，烘干48 h后待用；（2）抗原熱修復(fù)；（3）滅活內(nèi)源性過氧化物酶；（4）封閉；（5）加入一抗孵育（即用型，無需稀釋）；（6）加入二抗孵育；（7）滴加DAB試劑顯色；（8）蘇木精復(fù)染；（9）將染色后的病理切片置于顯微鏡下觀察，CD44v6定位于細胞膜，EGFR定位于細胞膜/細胞質(zhì)。由病理科?？漆t(yī)生獨立閱片，對照HE染色確定腫瘤細胞區(qū)域，于顯微鏡下觀察，每例觀察兩張切片，每張切片在10×40倍鏡下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，共計數(shù)500個細胞。算出每個視野下陽性細胞所占百分比，將10個視野所得陽性細胞所占百分比取平均值為最終CD44v6、EGFR的表達值。

1.7 診斷效力及預(yù)測價值的評估

根據(jù)CD44v6、EGFR所對應(yīng)的ROC曲線下面積（area under curve,AUC）來評價預(yù)測價值：AUC為0.5～0.7，表示預(yù)測價值較低；AUC為0.7～0.9，表示預(yù)測價值中等；AUC為0.9～1.0，表示預(yù)測價值較高。Cut-off值為約登指數(shù)最大時所對應(yīng)的CD44v6、EGFR表達值。根據(jù)ROC曲線所計算得出Cut-off值，將表達值大于或等于CD44v6、EGFR的Cut-off值的患者記為高表達組，小于CD44v6、EGFR的Cut-off值的患者記為低表達組。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，符合正態(tài)分布的計量資料采用（）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用t檢驗，不符合正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗。采用ROC曲線分析CD44v6、EGFR對NACT療效的預(yù)測價值。ROC行兩指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測的計算方法是將CD44v6和EGFR聯(lián)合預(yù)測的檢驗變量采用Logistic回歸得出綜合值（即真實概率值），狀態(tài)變量仍然為金標(biāo)準(zhǔn)（療效）不變。采用Pearson相關(guān)性檢驗進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床基線資料

53例NACT的患者中，敏感組（CR+PR）為38例，不敏感組（SD+PD）為15例，其中，NACT方案（紫杉醇+鉑類）、絕經(jīng)狀態(tài)、FIGO分期、病理類型、腫瘤是否侵犯陰道、年齡與NACT療效之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），腫瘤大小、腫瘤是否侵犯宮旁與NACT療效之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 53例宮頸癌患者基線資料表 (n(%))Table 1 Baseline characteristics of 53 cervical cancer patients (n(%))

2.2 CD44v6與EGFR在宮頸癌組織中的表達情況

CD44v6陽性主要定位于腫瘤細胞的胞膜，以出現(xiàn)完整的棕黃色著色為陽性著色。EGFR主要著色于腫瘤細胞的胞膜或胞質(zhì)，以腫瘤細胞膜上或胞質(zhì)中出現(xiàn)完整的棕褐色著色為陽性著色，見圖1。

在53例患者中，CD44v6、EGFR表達的平均值分別為75.75%、63.36%，中位值皆為80.00%，CD44v6表達為0～100%，EGFR表達為0～90.00%。

2.3 CD44v6、EGFR的表達與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

53例宮頸癌患者中，腫瘤侵犯宮旁的患者較未侵犯宮旁的患者CD44v6表達升高（P＜0.05）。腫瘤直徑≥4 cm的患者EGFR表達值高于＜4 cm的患者（P＜0.05），見表2。

表2 CD44v6、EGFR的表達與53例宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系Table 2 Correlation of CD44v6 and EGFR expression with clinical features of 53 cervical cancer patients

2.4 CD44v6、EGFR的表達與NACT敏感度的關(guān)系

敏感組CD44v6的表達值顯著低于不敏感組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CD44v6的表達在療效為CR、PR、SD的患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；EGFR在NACT敏感組與不敏感組間及療效為CR、PR、SD的患者中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 CD44v6、EGFR的表達與NACT敏感度的關(guān)系Table 3 Correlation of CD44v6 and EGFR expression with sensitivity of NACT

2.5 CD44v6、EGFR的表達對NACT療效的預(yù)測價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，CD44v6的表達對NACT的療效有中等預(yù)測價值（AUC=0.740,P＜0.0 5），其敏感度為6 6.7 0%，特異性為68.40%，Cut-off值為87.50；EGFR的表達對宮頸癌NACT的療效無明顯的預(yù)測價值（AUC=0.449,P＞0.05），CD44v6聯(lián)合EGFR對NACT的療效無預(yù)測價值（AUC=0.224,P＜0.05），見圖2，表4。

表4 CD44v6、EGFR對NACT療效的預(yù)測價值Table 4 Predictive value of CD44v6 and EGFR in the efficacy of NACT

2.6 CD44v6、EGFR的表達與NACT療效的關(guān)系

結(jié)果顯示，在NACT中，CD44v6的表達高低與化療敏感度及療效有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在NACT中，CD44v6低表達組患者的CR率高于高表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

2.7 CD44v6與EGFR的相關(guān)性

宮頸癌患者腫瘤組織中CD44v6與EGFR表達呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.34，P＜0.05，見圖3。

3 討論

目前，全球每年宮頸癌的新發(fā)病例約50萬，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%以上在發(fā)展中國家。有研究[8]顯示早期宮頸癌對NACT的反應(yīng)是一個重要的預(yù)后因素并有助于決定下一步局部治療方案，即放療或手術(shù)。在一項納入了490例宮頸癌患者的薈萃分析中指出，NACT的短期療效與DFS顯著相關(guān)，并且有效者的生存率明顯高于無效者[2]。同時，另一項研究顯示，對NACT的反應(yīng)，包括臨床反應(yīng)和病理反應(yīng)，與局部晚期宮頸癌（locally advanced cervical cancer,LACC）患者的預(yù)后具有相關(guān)性[9]。雖然有較多的研究為NACT提供了有力的證據(jù)，但因部分患者對NACT的療效欠佳，進而耽誤或延長治療時間，降低生活質(zhì)量甚至限制后續(xù)治療方式的選擇，從而致使NACT在臨床實際應(yīng)用中受到一定的限制，因此，臨床上迫切地需要可以預(yù)測NACT療效的方法以，便篩選出這部分不敏感的患者。目前，除了傳統(tǒng)的以鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SccAg）、癌抗原125（cancerantigen125,CA125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）作為宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物外，又新發(fā)現(xiàn)了幾種可預(yù)測抗腫瘤治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，如CD44v6、EGFR分子靶點及預(yù)測輻射敏感度的環(huán)氧合酶2（COX-2）、抑癌基因CHFR、DNA解旋酶WRN、缺氧誘導(dǎo)因子1α亞基（HIF-1α）等。

CD44作為腫瘤干細胞（CSCs）的表面標(biāo)志物，其表達影響著腫瘤啟動、自我更新、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性等關(guān)鍵的CSC相關(guān)特性[10-13]。其中含有外顯子v6的CD44v6異構(gòu)體主要參與異質(zhì)性黏附，是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的促進因素，表達CD44v6的腫瘤細胞更易發(fā)生脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移[10,14-15]。Hara等[16]通過CD44v6的表達與食管鱗癌化療療效分析得出，與CD44v6低表達組的患者相比，CD44v6高表達組的pT/pN分期更晚，對NACT的療效更差（應(yīng)答率為53.5%vs.77.8%，P=0.025）。在一項關(guān)于CD44v6表達與胃癌預(yù)后的meta分析顯示，CD44v6的表達與遠處轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤、TNM分期及胃癌的進展呈正相關(guān)，且CD44v6過表達的患者預(yù)后較差[17]。

同樣，CD44v6與宮頸癌的預(yù)后及NACT的療效也具有一定的相關(guān)性，Ayhan等[18]通過對88例宮頸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6高表達與腫瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。Costa等[6]通過對21例Ⅰb和Ⅱa期宮頸癌患者的研究指出，CD44v6低表達是預(yù)測患者對NACT敏感度的重要指標(biāo)，可作為制定治療方案的一個參考因素，如果化療前CD44v6表達較高，預(yù)示著宮頸癌患者對以鉑類為基礎(chǔ)的化療不敏感，應(yīng)及時更改治療方案。在本研究中，敏感組CD44v6的表達值顯著低于不敏感組，且CD44v6的表達在療效為CR、PR、SD的患者中存在顯著的差異（P＜0.05），這與Pereira等[19]提出的CD44v6陽性的細胞對順鉑的敏感度較CD44v6陰性低的結(jié)果相一致。因此，宮頸癌患者NACT的療效與CD44v6的表達可能具有密切的關(guān)系，CD44v6高表達患者在選擇以鉑類為主的NACT時應(yīng)更加慎重。同時CD44v6對宮頸癌以鉑類為基礎(chǔ)的NACT療效預(yù)測的ROC曲線分析結(jié)果表示，CD44v6對預(yù)測宮頸癌NACT的療效有重要的價值（AUC=0.740,P＜0.05），這提示CD44v6表達對預(yù)測宮頸癌NACT療效有臨床意義。但是，目前CD44v6與NACT的療效相關(guān)聯(lián)的具體作用機制尚不十分清楚，Safa等[20]指出，CD44v6通過與透明質(zhì)酸、淋巴系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)之間的特殊作用獲得增強細胞浸潤、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力，CD44v6陽性細胞可能更易與ECM牢固結(jié)合，利于浸潤轉(zhuǎn)移，這可能是CD44v6導(dǎo)致這類腫瘤細胞對化療藥物的敏感度降低以及化療療效降低的原因。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一種跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，是原癌基因C-erbB-1的表達產(chǎn)物。EGFR在宮頸組織中的表達水平可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能作為宮頸癌惡性程度判斷和預(yù)后的重要指標(biāo)[21]。本研究中，EGFR的表達與宮頸癌腫瘤大小相關(guān)（P＜0.05），EGFR表達越高，宮頸癌腫塊越大，這與陳永發(fā)等[22]提出的宮頸癌腫塊＞4 cm時EGFR陽性表達率高于腫塊≤4 cm相符。同時，Hugo等[7]指出侵襲性越強的宮頸癌CASKI細胞系中EGFR的表達水平越高，故EGFR可能通過這種高侵襲性來促進鉑類化療耐藥，從而影響化療療效。因此，EGFR的表達可能會影響化療療效，但本研究中EGFR對預(yù)測NACT的療效無顯著影響，可能是由于本研究樣本量少所致。單一指標(biāo)預(yù)測價值可能較為局限，雙指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測可能會提高預(yù)測效能，提高特異度和靈敏度。目前已有研究報道CD44v6、EGFR在肺鱗癌及宮頸癌中的陽性表達率具有一定相關(guān)性，聯(lián)合檢測CD44v6、EGFR表達可作為宮頸癌早期診斷、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后的判斷性指標(biāo)[23]，這與本研究中CD44v6與EGFR的表達具有正相關(guān)性一致。但本研究中聯(lián)合檢測并未提高預(yù)測價值，這可能與樣本量少有關(guān)。因此，EGFR和CD44v6可能通過協(xié)同作用影響宮頸癌對紫杉醇+鉑類NACT的療效。

初治時腫瘤大小、腫瘤侵犯范圍及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者療效的重要因素[24]，這與本研究中腫瘤未侵犯宮旁的患者NACT的療效優(yōu)于腫瘤侵及宮旁的結(jié)果一致。但本研究中腫瘤直徑越大的患者NACT療效越好，與部分研究的結(jié)果不同。其中鄒婷婷等[4]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑是影響宮頸癌患者NACT療效的影響因素，且腫瘤直徑≥5 cm的患者療效相對差，但該研究還指出，全身炎性反應(yīng)指標(biāo)（中性粒細胞-淋巴細胞比、單核細胞-淋巴細胞比）、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮頸肌層浸潤的發(fā)生率等均可影響化療療效。我們分析造成本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果不完全一致的原因有以下幾點：首先，本研究未將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、全身炎性反應(yīng)指標(biāo)等因素納入分析；其次，本研究病例數(shù)偏少，影響統(tǒng)計學(xué)結(jié)果；第三，目前更多的研究強調(diào)腫瘤大小與患者生存預(yù)后的關(guān)系，對于腫瘤大小與NACT療效的研究相對較少。但是，值得注意的是腫瘤的化療敏感度與腫瘤細胞的生長分?jǐn)?shù)即腫瘤細胞群體中處于增殖階段（S期+G2期）的細胞比例相關(guān)，生長分?jǐn)?shù)越大，腫瘤生長越迅速，目前大多數(shù)抗癌藥物是針對處于分裂期的細胞，因此，生長分?jǐn)?shù)高的腫瘤對于化學(xué)治療特別敏感[25]。大腫塊（直徑＞4 cm）的腫瘤處于分裂期的細胞可能更多，這可能是促使腫瘤直徑＞4 cm的宮頸癌患者從NACT中獲益更多的原因之一。因此，目前仍需進一步證實NACT療效與腫瘤大小的關(guān)系。

綜上，本研究通過檢測53例宮頸癌患者腫瘤組織中的CD44v6與EGFR的表達，分析CD44v6與EGFR表達對NACT療效的預(yù)測價值，初步得出結(jié)論，腫瘤組織中CD44v6的表達可能對預(yù)測NACT療效有一定的價值，CD44v6越高，NACT的療效越低，且CD44v6在不同分期的宮頸癌中存在表達差異。EGFR的表達可能與宮頸癌的大小有關(guān)，EGFR與CD44v6的表達具有正相關(guān)關(guān)系，因此，EGFR與CD44v6聯(lián)合檢測可能作為宮頸癌患者化療前預(yù)測療效的一項指標(biāo)，從而指導(dǎo)臨床用藥，提高患者生存質(zhì)量及預(yù)后，但仍需擴大樣本量進一步證實。本結(jié)果對明確CD44v6對NACT療效的預(yù)測價值有積極意義，同時將有助于制定更加有效的個體化治療方案，提升患者療效。但是，由于本研究的病例數(shù)較少，未來可在獲取更大樣本數(shù)的前提下，進行更深入的研究分析，以期為宮頸癌患者的個體化和綜合治療做出客觀有益的指導(dǎo)。