王梓合，李锃亮，方許哲，朱瑾,2

0 引言

鼻咽癌具有明確的地理分布特點，在東亞和東南亞尤為常見，是一種起源于鼻咽黏膜的惡性腫瘤。過去研究證實，表觀遺傳改變，尤其是DNA甲基化改變在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用，使用去甲基化劑恢復(fù)多種鼻咽癌相關(guān)基因（如ZNF671、ZNF750、UCHL1、SHISA3、ARNTL、NFAT1、RIP3等）的表達(dá)后，均可在體內(nèi)外抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[1-7]，此外，多種鼻咽癌相關(guān)基因（如TIPE3、LATS2、RAB37等）因啟動子高甲基化而在鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá)，相比于甲基化水平低的患者，高甲基化水平的鼻咽癌患者的預(yù)后更差[8-10]。DNA甲基化在鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移中具體的作用機(jī)制尚未闡明。近期有文獻(xiàn)報道[4-6]，DNA甲基化可能通過作用于多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而影響鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本文擬總結(jié)此類研究進(jìn)展，為進(jìn)一步探究DNA甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中具體的作用機(jī)制提供思路，并討論其在鼻咽癌治療中的應(yīng)用前景。

1 DNA甲基化與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移

DNA甲基化研究是目前機(jī)體細(xì)胞表觀遺傳學(xué)研究的一大熱點。DNA甲基化基本發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,DNMT），包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的催化作用，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine,SAM）作為甲基供體共價結(jié)合到需要甲基化的部位，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），通常抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)其表達(dá)。有研究顯示，全基因組DNA低甲基化與抑癌基因啟動子DNA高甲基化是癌細(xì)胞的一個關(guān)鍵特征[11]：一方面基因組整體甲基化水平降低可能導(dǎo)致原癌基因（如Ras、Myc、HOX11等）表達(dá)增加，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[12]；另一方面抑癌基因啟動子高甲基化會抑制抑癌基因（如RASSF1、CDKN2A等）的表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、抗凋亡能力增強(qiáng)，信號通路異常激活以及促進(jìn)血管生成[13-14]，使癌細(xì)胞的存活率大大增加[15]，且增強(qiáng)其侵襲與轉(zhuǎn)移能力。DNA甲基化與諸多實體腫瘤（如結(jié)直腸癌、胃癌、甲狀腺癌及頭頸部鱗癌包括鼻咽癌）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在胃癌中DNA甲基化可通過作用于PI3K/AKT信號通路進(jìn)而影響癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[16]，DNA甲基化還可能通過TGF-β信號通路與Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移[17]。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化可能通過Wnt/β-catenin、PI3K/AKT及MAPK等信號通路影響鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4,6,18-20]。

2 DNA甲基化影響鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路

鼻咽癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移與癌基因異常表達(dá)、腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞黏附降低等因素有關(guān)，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，目前研究較多的有Wnt、MAPK、PI3K、JAK/STAT、TGF-β等信號通路，初步闡明了DNA甲基化影響鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin信號通路也稱經(jīng)典Wnt信號通路，是一種高度保守的信號通路，參與人體的多種生理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、浸潤和組織穩(wěn)態(tài)[21-23]。相關(guān)研究證實Wnt/β-catenin信號通路的失調(diào)參與了部分實體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[24-28]，其中也包括鼻咽癌。轉(zhuǎn)錄因子β-catenin的調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致了早期癌變的發(fā)生[29-32]。Wnt/β-catenin信號通路可以概括為Wnt蛋白與其FZD受體以及LRP-5/6受體結(jié)合，誘導(dǎo)胞質(zhì)中的蓬亂蛋白（DVL），導(dǎo)致復(fù)合物（AXIN、GSK3β、CK1、APC）和受體聚集，進(jìn)而使細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白濃度升高遷移到細(xì)胞核中積聚，在細(xì)胞核中，β-catenin蛋白與T細(xì)胞因子（TCF）和淋巴增強(qiáng)因子（LEF）相互作用，誘導(dǎo)Wnt靶基因c-Myc、Cyclin D1和CDKN1A的表達(dá)[33]。Wnt/β-catenin信號通路不僅通過自身介導(dǎo)的信號通路促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，還與其他信號協(xié)同通路直接或間接誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[34]，且涉及多個關(guān)鍵蛋白，如鈣黏素（Cadherin）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、內(nèi)皮素（ET）和基質(zhì)金屬蛋白（MMP）等。在鼻咽癌細(xì)胞中，SOX1與SEPT9_v2的過表達(dá)均可以降低β-catenin的表達(dá)，同時下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的下游靶點Cyclin D1和c-Myc，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而抑制鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。甲基化特異性PCR檢測鼻咽癌組織與細(xì)胞系中SOX1與SEPT9_v2啟動子甲基化狀態(tài)后發(fā)現(xiàn)，兩者在鼻咽癌細(xì)胞中的低表達(dá)與其啟動子高甲基化密切相關(guān)[18,20]。此外，ZNF154在鼻咽癌組織與細(xì)胞系中的表達(dá)經(jīng)常由于其啟動子高甲基化而下調(diào)，并且ZNF154在體外與體內(nèi)均可抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，可能與ZNF154下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，使Wnt/β-catenin信號通路失活，以此抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)[35]。DACT2作為Wnt通路的拮抗劑，可降低鼻咽癌細(xì)胞中活性β-catenin及其下游基因的表達(dá)，并且抑制β-catenin/LEF復(fù)合體的活性，同時DACT2過表達(dá)還會導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞中的MMP下調(diào)。Zhang等[36]通過RT-PCR檢測證實了鼻咽癌組織中DACT2較正常組織低表達(dá)，通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）檢測鼻咽癌組織與正常組織中DACT2啟動子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)DACT2低表達(dá)與其啟動子高甲基化密切相關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)TET1可以導(dǎo)致Wnt拮抗劑（DACT2、SFRP2）啟動子去甲基化，恢復(fù)其在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)，以此發(fā)揮抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用[19]。盡管相關(guān)的研究仍然比較缺乏，但上述研究初步闡明了DNA甲基化通過Wnt/β-catenin信號通路影響鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制，鼻咽癌相關(guān)基因可因其啟動子高甲基化而表達(dá)下調(diào)，而這些基因可以作用于Wnt/β-catenin信號通路的各個階段，使其失活或下調(diào)其靶基因的表達(dá)，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。這些研究揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路中可能存在潛在的鼻咽癌治療靶點，并為后續(xù)的研究提供方向。

2.2 PI3K/AKT信號通路

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸活性和磷脂酰肌醇激酶活性，當(dāng)接收到酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號后，PI3K調(diào)節(jié)亞基的p85聚集到細(xì)胞膜周圍，蛋白激酶B（AKT）在丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1和2（PDK1和PDK2）的介導(dǎo)下由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜并被激活[37]。在正常細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路受到抑癌基因PTEN的嚴(yán)格調(diào)控，而在腫瘤細(xì)胞中，異常激活的PI3K/AKT信號通路可以誘導(dǎo)PTEN泛素化及降解，加速腫瘤的發(fā)展[38]。該信號通路主要與細(xì)胞運動以及血管生成有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路在多種實體腫瘤中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活與運動[39-40]，且該信號通路在鼻咽癌中過度表達(dá)與激活[15]，并通過下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低細(xì)胞之間以及細(xì)胞與間質(zhì)之間的黏附性，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[41]。同Wnt/β-catenin信號通路類似，PI3K/AKT信號通路也可以激活MMP、誘導(dǎo)EMT，以此促進(jìn)鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[42]。Chen等[43]發(fā)現(xiàn)CHL1在鼻咽癌細(xì)胞系與組織中由于其啟動子高甲基化而表達(dá)下調(diào)，在功能研究中，CHL1在鼻咽癌細(xì)胞中的過表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞運動，并且CHL1還可以通過上調(diào)上皮標(biāo)志物和下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物，誘導(dǎo)間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET），同時抑制EMT，以此來抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，CHL1通過與整合素β1和Merlin的相互作用，導(dǎo)致下游PI3K/AKT信號通路的失活，從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用。鼻咽癌組織與細(xì)胞系中Fibulin-3的表達(dá)與磷酸化AKT的活性負(fù)相關(guān)，過表達(dá)Fibulin-3可以抑制磷酸化AKT的活性，進(jìn)而使PI3K/AKT信號通路失活，以此來抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[44]。Fibulin-3經(jīng)常在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)下調(diào)，可能是由于其啟動子高甲基化導(dǎo)致的。綜上，DNA甲基化可以通過PI3K/AKT信號通路影響鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移，但仍然需要更多的證據(jù)支持。

2.3 MAPK信號通路

MAPK信號通路是調(diào)控多種細(xì)胞過程的關(guān)鍵信號通路，包括增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。MAPK通路包括三個主要的激酶：MAPK、MAPK激酶和MAPK激酶激酶，來激活和磷酸化下游蛋白。Ras/Raf/MAPK（MEK）/ERK通路是MAPK信號通路中最重要的信號級聯(lián)，與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)降解和腫瘤血管生成有關(guān)，在腫瘤增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重大作用[45]?，F(xiàn)有研究表明，在卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中均可以檢測到ERK通路的過度激活[46-49]。Zhang等[4]在鼻咽癌細(xì)胞與組織中發(fā)現(xiàn)，SHISA3經(jīng)常由于啟動子高甲基化而表達(dá)下調(diào)，而SHISA3在體內(nèi)外均可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，SHISA3的過表達(dá)抑制了磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、磷酸化MEK的活化和Ras-GTP的活性，導(dǎo)致MAPK信號通路的失活，因此抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。此外RERG過表達(dá)可抑制ERK和NF-κB信號通路及其下游的效應(yīng)分子，進(jìn)而下調(diào)MMPs和促血管生成細(xì)胞因子，以此來抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[50]。RERG在鼻咽癌細(xì)胞和組織中由于啟動子高甲基化而表達(dá)下調(diào)，使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑恢復(fù)其表達(dá)后，RERG可在體內(nèi)外抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。分泌型金屬蛋白酶ADAMTS8抑制表皮生長因子受體（EGFR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且降低磷酸化MEK和ERK的水平，通過破壞肌動蛋白應(yīng)激纖維組織抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，Choi等[51]發(fā)現(xiàn)ADAMTS8在正常組織中廣泛表達(dá)，但在常見癌細(xì)胞系（包括鼻咽癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌和結(jié)腸癌）中經(jīng)常因啟動子高甲基化而表達(dá)下調(diào)，應(yīng)用去甲基化劑處理后可恢復(fù)ADAMTS8的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移。目前這些研究初步揭示了DNA甲基化如何通過MAPK信號通路影響鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移，可以為后續(xù)進(jìn)一步研究該通路中更多的分子靶點提供思路。

3 其他可能的相關(guān)信號通路

除了上述已經(jīng)明確了的DNA甲基化影響鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移具體的信號通路，還有許多相關(guān)信號通路可能參與其中。前期的一項鼻咽癌全基因組測序研究中，研究者采用了甲基化DNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP）技術(shù)對鼻咽癌細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤以及正常鼻咽上皮細(xì)胞的甲基化基因進(jìn)行了分析，結(jié)果觀察到了廣泛的、全基因組的CpG甲基化。進(jìn)一步采用京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）進(jìn)行通路分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中Wnt、TGF-β、Hedgehog和MAPK等關(guān)鍵信號通路被DNA甲基化破壞[52]。如前文所述，已有研究證實DNA甲基化可通過Wnt和MAPK通路影響鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，然而，尚未有研究證明DNA甲基化可通過TGF-β和Hedgehog通路影響鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。此外，尚有諸多鼻咽癌的相關(guān)基因也可以通過去甲基化劑恢復(fù)其表達(dá)進(jìn)而抑制鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，但這一過程中涉及的具體信號通路仍未明確，如HOPX和NFAT1可能通過靶向EMT抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[6,53]，F(xiàn)ibulin-2通過抑制血管生成進(jìn)而抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[54]，CLDN11通過干擾微管蛋白聚合發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用[55]，ZNF582可以通過下調(diào)細(xì)胞黏附分子Nectin-3和上調(diào)細(xì)胞黏附分子NRXN3抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[56]。而這些可以為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)，未來可以進(jìn)一步探尋上述基因究竟是作用于何種信號通路進(jìn)而影響鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，并明確其在各個信號通路中具體的作用靶點。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，DNA甲基化通過多種信號通路作用于諸如細(xì)胞運動、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管生成等各個環(huán)節(jié)，最終影響鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。目前早期鼻咽癌依靠放療能取得滿意的療效，然而一旦腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不論是聯(lián)合放化療還是手術(shù)治療，均難以有效改善患者的預(yù)后。DNA甲基化是一種可以逆轉(zhuǎn)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，盡管存在一定的局限性，但上述研究初步闡明了鼻咽癌相關(guān)基因DNA甲基化影響鼻咽癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移具體信號通路的分子機(jī)制，有助于通過進(jìn)一步研究構(gòu)建信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)，并探尋各個通路潛在的治療靶點。早在1970年左右，歐美國家就開始使用去甲基化劑5-氮雜胞苷（azacitidine AZA）和5-氮雜-2-脫氧胞苷（decitabine DAC）進(jìn)行治療血液系統(tǒng)腫瘤與實體腫瘤的臨床試驗，結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用AZA和DAC治療急性髓系白血病（AML）是有效的，但是對于其他實體腫瘤并沒有顯著作用[57]。2004年研究人員調(diào)整了去甲基化劑的劑量以降低其毒性和提高效率之后，其被批準(zhǔn)用于臨床治療骨髓異常增生綜合征（MDS）[58]。盡管去甲基化劑尚未應(yīng)用于鼻咽癌的臨床治療，但我們希望上述研究可以為相關(guān)靶向藥物的研發(fā)指明方向，從而有效控制腫瘤轉(zhuǎn)移，延長患者的生存時間，改善患者的預(yù)后。