張文靜，張谷芬，王曉艷，張穎，權(quán)會(huì)琴

0 引言

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的70%～90%，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其中50%的患者是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染及其相關(guān)疾病所致[1]。乙型肝炎病毒編碼的X蛋白（HBx）是分子量為17 kda的154個(gè)氨基酸多肽，為多功能病毒調(diào)節(jié)因子，參與病毒的生命周期和HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展[2]。大量數(shù)據(jù)表明，HBx能夠促進(jìn)或抑制細(xì)胞的凋亡，且能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括AP-1、NF-κB、PI3K、CREB及Wnt信號(hào)通路等。然而，HBx相關(guān)肝癌的確切致癌靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不完全明確。

Wnt信號(hào)通路的異常活化在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)。Dickkopf蛋白（DKKs）是Wnt信號(hào)通路的拮抗劑，包含4種分泌蛋白（DKK1、2、3和4）。研究表明[3]DKK4在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平低于癌旁正常組織。

組蛋白去乙?；且环N被廣泛研究的翻譯后組蛋白修飾，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）和組蛋白去乙?；福℉DACs）的相反活性控制。通過去除乙酰基，HDACs逆轉(zhuǎn)染色質(zhì)乙酰化，改變癌基因和腫瘤抑制因子的轉(zhuǎn)錄基因，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷反應(yīng)、血管生成、自噬和其他細(xì)胞過程。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果闡釋了乙型肝炎病毒X蛋白如何通過去乙酰化作用下調(diào)DKK4的表達(dá)，并影響肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，旨在為乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌的進(jìn)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系SMMC7721、HepG2均由唐都醫(yī)院傳染科實(shí)驗(yàn)室保存。腺病毒Ad-HBx由重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；Ad-GFP購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司；siHDAC1由西安擎科澤西生物科技有限公司合成；過表達(dá)DKK4慢病毒購(gòu)自西安擎科澤西生物科技有限公司；DKK4、HDAC1和SIRT1一抗抗體均購(gòu)自Abcam公司（英國(guó)劍橋）。HepG2使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2；SMMC7721使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.2 腺病毒感染

分別用過表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白的重組腺病毒（MOI=110）及陰性對(duì)照腺病毒（MOI=10）感染肝癌細(xì)胞系，培養(yǎng)24 h后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，當(dāng)感染效率高于90%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。加入曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）處理細(xì)胞24 h，濃度分別為2、4、8和16 μmol/L。

1.3 Western blot檢測(cè)

利用蛋白裂解液收取各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合后在沸水中煮10 min，然后使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配制10%的分離膠和濃縮膠，每孔上樣20 μg，蛋白Marker 5 μl。跑膠后轉(zhuǎn)膜2 h，再用奶粉封閉1 h，最后置膜于抗體孵育盒中，與一抗進(jìn)行過夜孵育。次日用1×TBST洗膜5次，再孵育二抗1 h，之后再次用1×TBST洗膜5次。ECL法發(fā)光，并用Image J分析條帶的灰度值，以GAPDH作內(nèi)參。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

將處理后的細(xì)胞按照每孔5 000～1 0000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積200 μl，隨后每孔中加入20 μl的5 mg/ml MTT溶液，37℃孵育4 h。1 000 rpm離心5 min，棄培養(yǎng)基，每孔中加入150μl DMSO，震蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。

1.5 結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/毫升，以每孔1 ml接種于六孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并于24 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。每孔加入1 ml 95%甲醇固定細(xì)胞10 min，后用1%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗干凈后風(fēng)干。加入33%醋酸脫色，充分振蕩后在570 nm處測(cè)定吸收度。

1.6 Transwell小室檢測(cè)

病毒處理48 h后將各組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/毫升重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。每組細(xì)胞取200 μl加入Transwell小室中的上室，下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用棉簽擦去上室膜上表面的細(xì)胞，位于下表面的細(xì)胞用95%無水乙醇固定10 min，1%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗干凈后風(fēng)干，200倍的倒置顯微鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計(jì)量單位用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒HBx下調(diào)DKK4的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：在SMMC7721細(xì)胞中，Ad-GFP和Ad-HBx組中DKK4的相對(duì)表達(dá)量分別為1.1464±0.0315和0.7308±0.0688；在HepG2細(xì)胞中，Ad-GFP和Ad-HBx組中DKK4的相對(duì)表達(dá)量分別為1.6458±0.1794和0.8093±0.0538。與Ad-GFP相比，SMMC7721細(xì)胞中Ad-HBx感染組中DKK4的表達(dá)顯著下降（t=7.764,P=0.0162）。HepG2細(xì)胞中Ad-HBx感染組中DKK4的表達(dá)顯著下降（t=6.313,P=0.0242），見圖1。

2.2 TSA處理后DKK4的不同表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：Ad-HBx組以及不同濃度梯度的TSA（分別為2、4、8和16 μmol/L）處理Ad-HBx的肝癌細(xì)胞系后，相對(duì)表達(dá)量分別為0.2522±0.1142、0.6843±0.0053、1.4061±0.1828、1.0786±0.3131和0.0805±0.0339。與Ad-HBx組相比，隨著TSA升高，DKK4的表達(dá)上調(diào)，在濃度為4 μmol/L時(shí)達(dá)到最高值，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.569,P=0.0170），見圖2。

2.3 HBx上調(diào)組蛋白去乙?；窰DAC1和SIRT1的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：Ad-GFP組、Ad-HBx處理組和TSA處理組，HDAC1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.4096±0.0178、1.5051±0.0838和0.7057±0.0125，Ad-HBx組與Ad-GFP組相比，HDAC1表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.07,P=0.0030），TSA處理后，HDAC1的表達(dá)顯著下調(diào)（t=13.34,P=0.0056）。三組細(xì)胞中SIRT1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.1560±0.1418、1.2018±0.1665和0.5781±0.0493，與Ad-GFP組相比，Ad-HBx組中SIRT1的表達(dá)升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.761,P=0.0212），TSA處理后，SIRT1的表達(dá)顯著下降（t=5.077,P=0.0367），見圖3。

2.4 抑制HDAC1后DKK4的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：Ad-GFP組、Ad-HBx組和加入siHDAC1處理后DKK4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.7313±0.0565、0.2679±0.0685和0.7135±0.0787，其中，與Ad-HBx組相比，抑制HDAC1后，DKK4的表達(dá)顯著上調(diào)（t=6.039,P=0.0263），見圖4。

2.5 DKK4和HDAC1對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖和遷移能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Ad-GFP組相比，Ad-HBx組細(xì)胞增殖顯著增加（t=5.580,P=0.0051）；與Ad-HBx組相比，si-HDAC1+Ad-HBx組、Lenti-DKK4+Ad-HBx組和si-HDAC1+Lenti-DKK4+Ad-HBx組細(xì)胞增殖顯著下降（t=5.495,P=0.0053;t=6.292,P=0.0033;t=5.348,P=0.0059）。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Ad-GFP組相比，Ad-HBx組細(xì)胞增殖顯著增加（t=12.81,P=0.0002）；si-HDAC1+Ad-HBx組、Lenti-DKK4+Ad-HBx組和si-HDAC1+Lenti-DKK4+Ad-HBx組細(xì)胞增殖顯著下降（t=12.21,P=0.0003;t=14.34,P=0.0001;t=9.628,P=0.0007）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Ad-GFP組相比，Ad-HBx組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)顯著增加（t=4.726,P=0.0420）；與Ad-HBx組相比，si-HDAC1+Ad-HBx組、Lenti-DKK4+Ad-HBx組和si-HDAC1 +Lenti-DKK4+Ad-HBx組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)顯著下降（t=6.205,P=0.0250;t=6.568,P=0.0224;t=6.296,P=0.0243），見圖5。

3 討論

眾所周知，乙肝病毒感染是肝癌的主要危險(xiǎn)因素。HBx定位于細(xì)胞質(zhì)，參與了包括Wnt/β-catenin在內(nèi)的多種與肝細(xì)胞癌發(fā)生、侵襲、遷移和復(fù)發(fā)有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4]。現(xiàn)有研究表明，HBx通過表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)促癌基因及抑癌基因的表達(dá)。Fan等[5]證明了HBx促使RelA與EZH2、TET2和DNMT3L形成復(fù)合物，從而引起DNA去甲基化誘導(dǎo)EpCAM的表達(dá)。HBx通過募集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A到NQO1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，引起其高甲基化，進(jìn)而沉默其表達(dá)[6]。此外，HBx還可誘導(dǎo)具有抑癌活性的基因啟動(dòng)子甲基化，如負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期的p16INK4A基因、E-鈣粘蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）基因、SFRP1、SFRP5等[7]。另一方面，HBx還可以通過誘導(dǎo)某些腫瘤抑制相關(guān)基因的組蛋白去乙?；瘉泶龠M(jìn)HBV誘導(dǎo)的HCC發(fā)病。例如，HBx介導(dǎo)的CDH1和IGFBP-3基因的抑制涉及轉(zhuǎn)錄因子mSin3A/HDAC1復(fù)合物和Sp1/HDAC1復(fù)合物向相應(yīng)基因的啟動(dòng)子募集[8]。HBx通過HDAC1抑制cccDNA的表觀沉默[9]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBx可以通過上調(diào)HDAC1、SIRT1引起DKK4的去乙?；M(jìn)而導(dǎo)致其表達(dá)下降。

Dickkopf被認(rèn)為是Wnt信號(hào)通路的拮抗劑，其家族包括4個(gè)分泌蛋白（DKK1～4）。DKK4對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響尚不完全清楚，在不同腫瘤中DKK4作用不盡相同[10]。大腸癌組織中DKK4的表達(dá)高于正常組織，且可以增強(qiáng)大腸癌的轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成能力。DKK4可能是典型Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游基因。DKK4通過激活Wnt/PCP非經(jīng)典通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲力[11]。而在肝癌中，已有報(bào)道證明DKK4在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平低于癌旁正常組織，DKK4的過表達(dá)降低了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。相反，shRNA對(duì)DKK4的敲除促進(jìn)了細(xì)胞增殖，恢復(fù)了細(xì)胞的侵襲性[12]。我們的實(shí)驗(yàn)也證明了，乙型肝炎病毒X蛋白能下調(diào)DKK4的表達(dá)，過表達(dá)DKK4后能夠抑制肝癌細(xì)胞系的增殖和遷移能力。

我們進(jìn)一步深入研究了HBx下調(diào)DKK4表達(dá)的分子機(jī)制。DNA甲基化和組蛋白修飾都可能導(dǎo)致染色體重塑，從而影響區(qū)域編碼基因和非編碼RNA（ncRNAs）的表達(dá)，這是表觀遺傳變化最為清楚的機(jī)制之一。在HBV相關(guān)性肝癌中，許多病毒因子和受干擾的宿主因子有可能改變肝細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)，其中HBx被認(rèn)為是最重要的因素。既往研究表明DKK4在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)下降，但與甲基化無關(guān)[3]。另一方面，有報(bào)道稱TCF7L1能夠招募CTBP和HDAC1來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中DKK4基因的表達(dá)[13]。組蛋白去乙?；谀[瘤進(jìn)展中占據(jù)非常重要的作用，其中HDACs通過去乙?；l(fā)揮作用，與腫瘤晚期疾病和不良預(yù)后相關(guān)。例如，HDAC1、2和3的高表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)[14]，HDCA1在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中有雙重作用。在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）前期，HDAC1拮抗了致癌基因PML-RAR的活性，但是在白血病期，卻有利于APL細(xì)胞的增長(zhǎng)[15]。SIRT1調(diào)節(jié)DDR的多個(gè)步驟，包括損傷感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)和凋亡，SIRT1與多種DDR蛋白相互作用并脫乙酰化，包括Ku70、NBS1、APE1、XPA、PARP-1、TopBP1和KAP1。SIRT1拮抗p53乙酰化并促進(jìn)DNA損傷后癌細(xì)胞的存活。SIRT1促進(jìn)肝癌的發(fā)生，并且和c-Myc的表達(dá)相關(guān)。有研究表明[16]，RNA結(jié)合蛋白R(shí)PS3在核糖體外通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控SIRT1表達(dá)促進(jìn)肝癌的發(fā)生，并提出RPS3/SIRT1通路可作為HCC的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究為乙肝相關(guān)性肝癌的進(jìn)展提供了理論依據(jù)，但HBx是否招募HDAC1在DKK4啟動(dòng)區(qū)，或者HBx與HDAC1結(jié)合后再募集在DKK4啟動(dòng)子區(qū)尚需開展深入研究。