劉 鑫，康建平，林 崗,3 ，繆 凡，葉 翚，饒小珍,3，鐘傳明

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350001；3.福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350117）

0 引言

【研究意義】東星斑（Plectropomus leopardus）又名豹紋鰓棘鱸、花斑刺鰓鱸、七星斑、紅條等，鱸形目（Perciformes）、鰭科（Serranidae）、石斑魚(yú)亞科（Epinephelinae）、鰓棘鱸屬（Plectropomus）[1]。東星斑既可作為觀賞魚(yú)類(lèi)，也可作為高食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)物種[2]。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)通過(guò)處理和再利用大大減少了用水量，并能夠?qū)崿F(xiàn)集約化養(yǎng)殖，減少了處理、收獲和加工的勞動(dòng)力，是魚(yú)類(lèi)室內(nèi)養(yǎng)殖的理想選擇模式[3]。探究循環(huán)水養(yǎng)殖石斑魚(yú)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)鹽及微生物的變化特征具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較多，如健康與患病養(yǎng)殖水體的微生物群落結(jié)構(gòu)差異、生物濾池微生物群落結(jié)構(gòu)以及石斑魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)等[4-6]。養(yǎng)殖水體中的氨氮對(duì)魚(yú)類(lèi)有非常強(qiáng)的毒性，在濃度很低的情況下就能使魚(yú)類(lèi)中毒甚至死亡。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)利用生物膜可以降低水體中的氨氮濃度，從而降低氨氮濃度過(guò)高對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)帶來(lái)的危害[7]?；【?duì)海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖造成巨大威脅，引起海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的病原菌有數(shù)十種之多，許多致病菌可以引起養(yǎng)殖對(duì)象出現(xiàn)皮膚潰爛、爛尾、爛鰭、出血等一系列不良癥狀[8]。弧菌數(shù)量的高峰期也是魚(yú)病的頻繁發(fā)生期，某些弧菌可能受環(huán)境影響而轉(zhuǎn)化為致病弧菌，因此通過(guò)檢測(cè)水體中的弧菌數(shù)量變化可以提前預(yù)報(bào)海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)病害的發(fā)生情況[9]，而目前對(duì)海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中弧菌群落變化的相關(guān)報(bào)道較少。關(guān)于東星斑養(yǎng)殖技術(shù)方面的研究較多[10,11]，但對(duì)其養(yǎng)殖水體的研究較少。福建平潭綜合試驗(yàn)區(qū)東庠鄉(xiāng)位于沿海，具有得天獨(dú)厚的海水養(yǎng)殖條件，適宜東星斑的養(yǎng)殖。【本研究切入點(diǎn)】東星斑循環(huán)水養(yǎng)殖中營(yíng)養(yǎng)鹽、弧菌的變化特征以及RAS系統(tǒng)中對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響的關(guān)鍵單元的調(diào)控作用等都有待更深入的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)東星斑海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)水、養(yǎng)殖池、出水、生物濾池、紫外消毒池水樣的營(yíng)養(yǎng)鹽以及微生物群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，并對(duì)弧菌的數(shù)量變化進(jìn)行分析，探討水體中微生物的功能，以期為海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（圖1）位于福建省平潭綜合試驗(yàn)區(qū)東庠鄉(xiāng)的一家水產(chǎn)公司，其一套循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)由10個(gè)大小規(guī)格一致的八角形養(yǎng)殖池、微濾機(jī)、生物濾池、紫外消毒池等組成，每個(gè)養(yǎng)殖池的占地面積為43 m2，水體體積為56 m3；生物濾池面積為15 m2，水深2 m，可處理水體積為30 m3；供氧系統(tǒng)由純氧機(jī)、羅茨鼓風(fēng)機(jī)等組成。養(yǎng)殖池水體溶氧（DO）控制在（8.6±0.5） mg·L-1，水溫由空氣能控溫系統(tǒng)控制在（26±1） ℃，養(yǎng)殖系統(tǒng)水體每2.5 h循環(huán)一次。2020年9月開(kāi)始養(yǎng)殖東星斑，養(yǎng)殖過(guò)程中投喂東星斑配合飼料（日清丸紅魚(yú)類(lèi)配合飼料），初始養(yǎng)殖密度為20 kg·m-3，平均體重約為300 g·尾-1，魚(yú)的生長(zhǎng)狀況良好。

1.2 樣品采集

2021年6月，按照循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，采集養(yǎng)殖池進(jìn)水、養(yǎng)殖池池水、養(yǎng)殖池出水、生物濾池池水、紫外消毒池池水以及經(jīng)過(guò)處理的外源海水（用于循環(huán)系統(tǒng)的補(bǔ)水）樣品，并依次編號(hào)為PTA1～6。樣品保存于500 mL無(wú)菌聚乙烯瓶中，所有樣品采集后立即低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.3 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

依據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分：海水分析》（GB 17378.4—2007）[12]，檢測(cè)水溫、溶氧、鹽度、pH、氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽氮（NO2--N）、硝酸鹽氮（NO3--N）、磷酸鹽（PO43--P）等水質(zhì)指標(biāo)。其中硝酸鹽氮（NO3--N）采用離子色譜法[13]進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4 16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

本試驗(yàn)采用16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域作為目標(biāo)DNA序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為338R（5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇）和 806R（5＇-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇）。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，檢查擴(kuò)增效果，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作由北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.5 序列分析

利用 Trimmomatic（v0.36）、Pear（v0.9.6）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，根據(jù)標(biāo)記序列和擴(kuò)增引物序列從原始數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去標(biāo)記序列和引物序列后利用 Fash（v1.20）、Pear（v0.9.6）進(jìn)行拼接（Merge）處理。Qiime（v1.8.0）對(duì)拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，用Uchime方法去除嵌合體序列。

利用Uparse軟件對(duì)處理后的有效序列以97%的一致性聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元（Operational taxonomic units，OTUs）。用 RDP Classifier（v2.13）等軟件對(duì)OUT代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在各分類(lèi)水平上注釋群落的物種信息。采用Qiime（v1.8.0）軟件計(jì)算α-多樣性指數(shù)和覆蓋度指數(shù)，其中α-多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。用Mother作Rarefaction分析，用R語(yǔ)言工具繪制Veen圖，使用Qiime（v1.8.0）軟件計(jì)算unweighted unifrac距離和構(gòu)建UPGMA樣品聚類(lèi)樹(shù)。運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，分析不同樣品中優(yōu)勢(shì)菌含量顯著性差異（α取0.05）。

1.6 弧菌的數(shù)量變化

弧菌采用硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（Thiosulfate-citrate-bile-salts-sucrose，TCBS）特異性弧菌分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，樣品用無(wú)菌海水稀釋10倍后取0.1 mL均勻涂布在培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h后對(duì)弧菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。運(yùn)用One-way ANOVA檢驗(yàn)不同環(huán)節(jié)樣品中弧菌數(shù)量差異的顯著性，如果差異顯著再進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體理化性質(zhì)分析

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)水體的鹽度、pH、氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽氮（NO2--N）、硝酸鹽氮（NO3--N）、磷酸鹽（PO43--P）等檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各環(huán)節(jié)水體的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽均高于外源海水。養(yǎng)殖池出水經(jīng)過(guò)水處理階段后氨氮、硝酸鹽、磷酸鹽均得到有效降低，養(yǎng)殖池進(jìn)水水質(zhì)完全符合東星斑的養(yǎng)殖要求。

表1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)的水質(zhì)指標(biāo)Table 1 Water quality indicators for functional stages of RAS

2.2 微生物群落多樣性分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果的微生物序列進(jìn)行分析，6個(gè)樣品總計(jì)得到467 241個(gè)原始條帶，平均每個(gè)樣品得到77 874個(gè)原始條帶，經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量、Barcode和引物序列后，6個(gè)樣品總計(jì)得到405 840個(gè)有效條帶，平均每個(gè)樣品得到67 640個(gè)有效條帶。序列的有效覆蓋率全部達(dá)到99%以上，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，能夠很好反映微生物群落的總體狀況。

經(jīng)過(guò)均一化之后，經(jīng)16S rRNA基因序列97%相似性聚類(lèi)，各樣品的微生物豐富度、物種均一度的α-多樣性指標(biāo)結(jié)果如表2所示。采用Chao1指數(shù)對(duì)微生物物種的豐富度進(jìn)行評(píng)估，采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)微生物群落的多樣性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，Chao1指數(shù)從大到小依次是PTA5＞PTA1＞PTA6＞ PTA4＞PTA2＞PTA3，其中 PTA5 的 Chao1指數(shù)最大為2 213.58，PTA3的最小為1 769.79。PTA1的Shannon指數(shù)最大為8.21，PTA2的最小為7.02。

表2 不同樣品細(xì)菌群落的多樣性Table 2 Microbial community diversity at sampling spots

2.3 微生物群落相似性分析

6個(gè)樣品平均發(fā)現(xiàn)1 448個(gè)OUT，PTA1的OTU數(shù)目最多，有1 663個(gè)；其次是PTA4，有1 588個(gè)；PTA6的OTU數(shù)目相對(duì)較少，只有1 170個(gè)。為了解樣品中細(xì)菌的共有情況，繪制了Veen圖（圖2），由圖2可見(jiàn)，PTA1、PTA2、PTA3、PTA4、PTA5 和 PTA6特有的OUT數(shù)目分別為427、185、170、285、225和294，6組樣品共有的OTU數(shù)目是678種，平均占每個(gè)樣品OUT總數(shù)的46.82%，說(shuō)明6組樣品的相似度較高，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)水體的微生物群落總體上有很大的相似性。

為了了解各個(gè)樣品之間的群落結(jié)構(gòu)差異，對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，用Bray-Curtis距離算法對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)度量多維度標(biāo)定法（Non-metric multi-dimensional Scaling，NMDS）分析，基于OTU水平的NMDS分析如圖3所示，基于此算法下的脅強(qiáng)系數(shù)（Stress）為0.063 0，表明結(jié)果具有較好的擬合度，能夠很好地反映樣品菌群的組成情況。樣品在圖中的距離越遠(yuǎn)，表明樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異越大，圖中PTA1、PTA6與其他樣品距離最遠(yuǎn)，表明PTA1、PTA6菌群群落組成與循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)其他各環(huán)節(jié)菌群群落組成有較大差異，PTA3、PTA4在圖中距離較近，也表明PTA3、PTA4菌群群落組成差異較小。

2.4 微生物群落組成分析

經(jīng)過(guò)物種注釋?zhuān)?個(gè)樣品在門(mén)分類(lèi)水平的微生物群落分布見(jiàn)圖4，6個(gè)樣品中Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Bacteroidota（擬桿菌門(mén)）、Firmicutes（厚壁菌門(mén)）、Actinobacteriota（放線菌門(mén)）、Verrucomicrobiota（疣微菌門(mén)）、Patescibacteria（髕骨細(xì)菌門(mén)）、Fusobacteriota（梭桿菌門(mén)）、Planctomycetota（浮霉菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Bdellovibrionota（蛭弧菌門(mén)）、Cyanobacteria（藍(lán)藻門(mén)）總計(jì)占細(xì)菌OTU總數(shù)的97.10%。6組樣品中含量最多的均是Proteobacteria，在各樣品中占31.79%～59.49%，在PTA2中含量最大，在PTA5中含量最小，其相對(duì)豐度依次為 PTA2＞PTA1＞PTA3＞PTA4＞PTA6＞PTA5；Bacteroidota在各樣品中占21.66%～29.75%，在PTA4中含量最大，在PTA2中含量最小，其相對(duì)豐度依次為PTA4＞PTA5＞PTA1＞PTA6＞PTA3＞PTA2；Firmicutes在各樣品中占3.33%～25.39%，在PTA5中含量最大，在PTA1中含量最小，其相對(duì)豐度依次為PTA5＞PTA4＞PTA6＞PTA3＞PTA2＞PTA1。Firmicutes在養(yǎng)殖池進(jìn)水中含量較少，F(xiàn)usobacteriota主要存在于養(yǎng)殖池出水中。

在屬分類(lèi)水平上（見(jiàn)圖5），各樣品中主要含Pseudoalteromonas（假 交 替 單 胞 菌 屬 ）、Photobacterium（發(fā)光桿菌屬）、Vibrio（弧菌屬）、Lactobacillus（乳 桿 菌 屬 ）。Pseudoalteromonas在各樣品中占0.98%～14.10%，在PTA2中含量最大，在PTA6中含量最小，其相對(duì)豐度依次為PTA2＞PTA4＞PTA3＞PTA5＞PTA1＞PTA6；Photobacterium在各樣品中占0.64%～9.07%，在PTA2中含量最大，在PTA6中含量最小，其相對(duì)豐度依次為PTA2＞PTA3＞PTA5＞PTA4＞PTA1＞PTA6；Vibrio在各樣品中占0.81%～5.30%，在PTA3中含量最大，在PTA6中含量最小，其相對(duì)豐度依次為PTA3＞PTA4＞PTA2＞PTA1＞PTA5＞PTA6；Lactobacillus在各樣品中占0.04%～8.98%，在PTA5中含量最大，在PTA2中含量最小，其相對(duì)豐度依次為PTA5＞PTA4＞PTA6＞PTA3＞PTA1＞PTA2。除此外，各樣品中還含有較多的未培養(yǎng)或未分類(lèi)的細(xì)菌類(lèi)群。

Photobacterium和Vibrio含量較多，分別占Vibrionaceae（弧菌科）總量的59.51%、40.48%，其中Vibrio主要包含Vibrio ponticus、Vibrio marisflavi（黃?；【?、Vibrio harveyi（哈維氏弧菌）、Vibrio penaeicida（殺對(duì)蝦弧菌）以及少量的Vibrio vulnificus（創(chuàng)傷弧菌），分別占Vibrio總量的 66.17%、1.26%、0.90%、0.30%、0.02%。Vibrio ponticus數(shù)量在養(yǎng)殖池出水樣品中最高，占Vibrio總量的75.86%，在紫外消毒池樣品中為62.75%。

為了了解各樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬，統(tǒng)計(jì)了各個(gè)樣品中含量大于1%的菌屬（如表3）。從表中數(shù)據(jù)可知，不同環(huán)節(jié)水體樣品中優(yōu)勢(shì)菌種類(lèi)、數(shù)量有所差異，各樣品中優(yōu)勢(shì)菌的含量存在明顯差異。包括未分類(lèi)或未培養(yǎng)的菌屬，各樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量共有29種。一些菌屬只在某一環(huán)節(jié)水體樣品中為優(yōu)勢(shì)菌屬，如Acinetobacter（不動(dòng)桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）是PTA5中的優(yōu)勢(shì)菌屬；Aquimarina（海水桿菌屬）、Sva0996_marine_group是PTA1中的優(yōu)勢(shì)菌屬；Cetobacterium（鯨桿菌屬）是PTA3中的優(yōu)勢(shì)菌屬；Nautella、Roseovarius（玫瑰變色菌屬）、Rubidimonas、Sulfitobacter（亞硫酸桿菌屬）是PTA2中的優(yōu)勢(shì)菌屬。還有一些菌屬在各個(gè)環(huán)節(jié)水體樣品中均為優(yōu)勢(shì)菌屬，如Clostridium_sensu_stricto_1（艱難梭菌屬）、Photobacterium、Pseudoalteromonas、Ruegeria（魯杰氏菌屬）、Thalassotalea（深海桿菌屬）、Vibrio和一些未分類(lèi)或未鑒定的菌屬。其中，Clostridium_sensu_stricto_1、Vibrio含量從 PTA1至PTA5呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，均在PTA3中含量較高，分別為7.20%、5.30%；在PTA5中含量較低，分別為1.07%、2.88%。

表3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)中優(yōu)勢(shì)菌的分布情況（屬水平）Table 3 Distribution of dominant bacteria at stages of RAS at genus level

在屬分類(lèi)水平上，選取所有樣品豐度排序前17的菌群構(gòu)建豐度熱圖，進(jìn)行聚類(lèi)分析，并對(duì)不同樣品中各菌群的含量作顯著性分析（P＜0.05），結(jié)果如圖6所示，可見(jiàn)樣品的主要差異菌屬為Pseudoalteromonas、Ruegeria、Cetobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1、Lactobacillus、Candidatus_Actinomarina；Actibacter、Polaribacter、Thalassobius、Thalassotalea、Bacillus、Prevotella相對(duì)差異較小。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果可以明顯看出，樣品被分為兩組，PTA1、PTA2及PTA3為一組，PTA4、PTA5及PTA6為一組。

2.5 弧菌數(shù)量變化分析

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)水體樣品中弧菌的數(shù)量如圖7所示，水中的弧菌數(shù)量PTA3＞PTA2＞PTA4＞PTA5＞PTA1。外源海水樣品中弧菌數(shù)量很低接近零，循環(huán)系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)樣品中PTA3的弧菌數(shù)量最高，PTA1的弧菌數(shù)量最低。PTA1與PTA3的弧菌數(shù)量具有顯著性差異（P＜0.05），PTA3與PTA5弧菌數(shù)量有顯著性差異（P＜0.05），弧菌數(shù)量從PTA1到PTA5總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，從PTA1到PTA3，弧菌數(shù)量出現(xiàn)顯著升高，增幅為516.67%，從PTA3到PTA5，弧菌數(shù)量發(fā)生明顯降低，降幅為80.68%?？梢钥闯鏊w中的弧菌數(shù)量經(jīng)過(guò)養(yǎng)殖池會(huì)急劇增加，而凈化處理可以明顯降低弧菌數(shù)量。

3 討論

海水循環(huán)水養(yǎng)殖模式的構(gòu)建是為了解決傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式直接將養(yǎng)殖尾水排入附近環(huán)境水體中而引起的環(huán)境問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)“零污染”的目的。本研究中，海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)能夠很好地維持水體鹽度的穩(wěn)定，使循環(huán)水體環(huán)境指標(biāo)保持在適宜的范圍，為養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物提供基本的養(yǎng)殖條件。氨氮對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒害作用主要?dú)w因于其所包含的非離子氨（NH3-N），NH3-N能夠影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、滲透壓平衡、代謝活動(dòng)等，當(dāng)池塘中所含的氨氮總量多于消散量時(shí)，池塘中氨氮的含量會(huì)隨著時(shí)間的推移而不斷積累，到達(dá)一定程度時(shí)就會(huì)對(duì)魚(yú)體造成危害[14]。養(yǎng)殖池出水經(jīng)過(guò)生物濾池處理后，氨氮和硝酸鹽氮的濃度有所降低，亞硝酸鹽氮的濃度有所升高，其濃度升高可能是養(yǎng)殖池出水中氨氮濃度較大，硝化過(guò)程中生成NO2-的速率更快[15]，同時(shí)，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中含有的Nitrosomonas（亞硝化單胞菌屬）、Nitrospira（硝化螺菌屬）等氨氧化菌可將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮[16]。氨氧化菌的最佳生長(zhǎng)溫度為22～27 ℃，最佳pH值為7.8～8.3，與本研究中的水體條件非常接近[17]。除此之外，本研究中還發(fā)現(xiàn)了少量的Candidatus，其屬于厭氧氨氧化菌[5]，在氨氮轉(zhuǎn)化方面也發(fā)揮了一定作用。各樣品中含量較為豐富的菌屬有Pseudoalteromonas和Photobacterium，其中Pseudoalteromonas在生物濾池水體中含量較高（8.06%），Pseudoalteromonas中一些菌株具有拮抗弧菌和去除氨氮的作用，在pH為7-8時(shí)，其具有較強(qiáng)的抗弧菌及脫氮能力，應(yīng)用于養(yǎng)殖中能夠顯著降低水體中的氨氮濃度[18]。Photobacterium在生物濾池池水樣品中含量較高，Photobacterium被證明具有去除水體總氮的能力，但是一定濃度的銨鹽濃度會(huì)完全抑制Photobacterium的亞硝酸鹽還原作用[19]。除此之外，Bacteroides（擬桿菌屬）在生物濾池中含量較高，是生物濾池中的優(yōu)勢(shì)菌屬，Bacteroides為厭氧菌，對(duì)去除水體中的氮磷發(fā)揮著重要作用，其參與含氮物質(zhì)的利用等多種過(guò)程[20]。Firmicutes（厚壁菌門(mén)）的含量從養(yǎng)殖池進(jìn)水到紫外消毒池池水樣品中含量呈升高趨勢(shì)，在紫外消毒池池水樣品中的占比最大，F(xiàn)irmicutes能分泌多種消化酶和抗生素，也能直接利用水中硝酸鹽和亞硝酸鹽從而凈化水質(zhì)[21]。紫外消毒池池水樣品中磷酸鹽的含量明顯高于養(yǎng)殖池進(jìn)水樣品，在紫外消毒池中，Acinetobacter為優(yōu)勢(shì)菌屬，Acinetobacter能夠超量攝取廢水中的磷，使胞內(nèi)磷的含量占到10%-30%，此類(lèi)能夠過(guò)量攝取磷的功能性細(xì)菌被廣泛應(yīng)用于生物除磷[22]。本研究中，生物濾池水體中氨氮、硝酸鹽氮以及磷酸鹽含量的降低明顯，與各種菌群的去氮除磷作用相關(guān)。該循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)通過(guò)微濾機(jī)、硝化作用和曝氣等有效途徑可以顯著降低養(yǎng)殖池出水中的氨氮濃度，使養(yǎng)殖池中水體中氨氮濃度降低至對(duì)魚(yú)體無(wú)害水平，防止了氨氮的積累和對(duì)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的毒害作用。同時(shí)，該系統(tǒng)能夠有效去除養(yǎng)殖池出水中的磷酸鹽，為維持養(yǎng)殖池中磷酸鹽在一個(gè)較低水平發(fā)揮了較大作用。同時(shí)，在海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)運(yùn)行中如何更加有效實(shí)現(xiàn)亞硝酸到硝酸鹽的轉(zhuǎn)化以及降低水體中磷酸鹽的含量還有待更深入的研究。

弧菌是海水養(yǎng)殖中非常重要的一類(lèi)有害菌群，弧菌數(shù)量變化可以用來(lái)監(jiān)測(cè)水體中有害菌群的變化規(guī)律，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)做出指導(dǎo)。海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)對(duì)弧菌的處理效果是判斷系統(tǒng)有效性的重要因素，防止弧菌的過(guò)度增殖是防控魚(yú)類(lèi)疾病的重要措施。石斑魚(yú)所感染的細(xì)菌性病原大部分屬于弧菌，包括創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌等[23]。在本次研究中，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中弧菌數(shù)量與外源海水中弧菌數(shù)量具有顯著差異，同時(shí)弧菌數(shù)量在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中出現(xiàn)規(guī)律性變化，經(jīng)過(guò)養(yǎng)殖池，弧菌呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)凈化處理，弧菌呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，測(cè)序結(jié)果中弧菌的變化趨勢(shì)與鑒別培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果相同。養(yǎng)殖池出水樣品中弧菌數(shù)量最大，是因?yàn)轲B(yǎng)殖池有飼料等有機(jī)質(zhì)的輸入，會(huì)導(dǎo)致碎屑、浮游生物及微生物的增加，另外，水體中沉積物中生物的密度和有利的環(huán)境條件有助于弧菌的增加和維持[24]。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中弧菌屬物種主要為Vibrio ponticus，其為海水養(yǎng)殖中的常見(jiàn)致病弧菌，能導(dǎo)致大黃魚(yú)出現(xiàn)爛鰓病[25]，也可引起日本鱸魚(yú)出現(xiàn)體表潰爛癥狀[26]。

弧菌數(shù)量的下降與多種因素有關(guān)，其中包括弧菌拮抗菌的抑制作用。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中紫外消毒處理對(duì)弧菌的去除率較高[27,28]，本試驗(yàn)中經(jīng)過(guò)紫外消毒池后的進(jìn)水樣品中仍含有一定數(shù)量的弧菌，與紫外消毒處理的強(qiáng)度和作用時(shí)間等有關(guān)，對(duì)于弧菌的控制還與其他拮抗菌的作用有關(guān)。在生物濾池中含有豐富的Pseudoalteromonas，其對(duì)多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原弧菌具有拮抗作用[29]。本研究中養(yǎng)殖池進(jìn)水樣品、養(yǎng)殖池池水樣品中的Lactobacillus數(shù)量很低（0.08%、0.04%），從養(yǎng)殖池出水到紫外消毒池，其數(shù)量逐漸增大，在紫外消毒池池水樣品中的數(shù)量達(dá)到最大（8.98%），數(shù)量明顯升高。Lactobacillus是水產(chǎn)飼料中常用的益生菌，其對(duì)水體中的有害病原菌具有一定的抑制作用[30]，與弧菌具有拮抗作用[31]。本試驗(yàn)中Lactobacillus數(shù)量在生物濾池以及紫外消毒池中含量較高，其與生物濾池及外源海水中Lactobacillus含量較高相關(guān)，對(duì)于外源海水中Lactobacillus含量較高的現(xiàn)象有待進(jìn)一步的探究。生物濾池中弧菌的減少與其拮抗菌屬有關(guān)，生物濾池中含有豐富 的Allobaculum、Clostridium_sensu_stricto_1、Faecalibacterium、Prevotella、Ruegeria等益生菌屬，其中Ruegeria屬于變形菌門(mén)、α變形菌綱，Ruegeria中的某些物種經(jīng)常在海水海洋生物表面分離得到，有的物種具有抗菌活性[32]，Allobaculum屬于支原體科，是生物體內(nèi)具有保護(hù)性作用的微生物[33]。本研究中發(fā)現(xiàn)的一些菌屬在水體微生物方面沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，但是在其他生物體中發(fā)揮著重要作用，如Faecalibacterium主要存在于人的腸道中，并對(duì)基因表達(dá)、炎癥、分化和凋亡起著重要的作用[34]，Prevotella可以通過(guò)促進(jìn)糖原的儲(chǔ)存從而改善葡萄糖代謝[35]，這些菌屬可能在對(duì)降低弧菌數(shù)量方面可能發(fā)揮重要作用，這有待進(jìn)一步探討。本研究中弧菌的數(shù)量變化可以說(shuō)明，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)可以顯著降低養(yǎng)殖池出水中的弧菌數(shù)量，從而降低弧菌引起魚(yú)類(lèi)疾病的機(jī)率。

在門(mén)分類(lèi)水平上，各水樣的菌群組成有明顯區(qū)別，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中含量明顯較多的兩種細(xì)菌門(mén)類(lèi)為Proteobacteria、Bacteroidota。其中Bacteroidota在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各個(gè)環(huán)節(jié)的數(shù)量沒(méi)有明顯變化，但數(shù)量均較大（21.66%～29.75%），其數(shù)量與外源海水中的Bacteroidota數(shù)量（24.53%）接近，說(shuō)明此門(mén)類(lèi)可能是海水水體中數(shù)量較為穩(wěn)定的菌群，具體有待進(jìn)一步論證。Proteobacteria在整個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中為最優(yōu)勢(shì)菌群，這與其他研究者的結(jié)論一致[4-6]，其在養(yǎng)殖池中的數(shù)量最高，與養(yǎng)殖池中的蛋白質(zhì)和有機(jī)物的含量較高有關(guān)，而Actinobacteriota在養(yǎng)殖池池水樣品、養(yǎng)殖池出水樣品以及生物濾池池水樣品中的數(shù)量較小，在養(yǎng)殖池進(jìn)水樣品（7.84%）和紫外消毒池池水樣品（7.05%）中的數(shù)量較大，與Actinobacteriota不易在蛋白質(zhì)、有機(jī)質(zhì)含量較高的環(huán)境中生長(zhǎng)有關(guān)[36]。在屬分類(lèi)水平上，生物濾池池水樣品中還含有較多的Cryomorphaceae，其包含4個(gè)海洋起源的屬，處于黃桿菌科和擬桿菌科之間，與Flavobacteriaceae（黃桿菌屬，屬于弧菌科）具有很大的相似性[37]，黃桿菌屬中的柱狀黃桿菌、鰓部黃桿菌等是引發(fā)淡水魚(yú)類(lèi)疾病的重要物種[38]。循環(huán)系統(tǒng)中Cryomorphaceae數(shù)量較高，可能會(huì)成為不利于實(shí)際魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的環(huán)境因素之一。除此外，本研究中各樣品中均含有Clostridium_sensu_stricto_1，其數(shù)量在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各環(huán)節(jié)中呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律性變化，這可能與水體中蛋白質(zhì)的濃度有關(guān)，相關(guān)研究表明其在生物體內(nèi)的結(jié)腸部位的濃度隨著日糧中的蛋白質(zhì)濃度的增加而降低[39]。本研究中各類(lèi)菌群與循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)鹽之間的相互作用還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)東星斑循環(huán)水養(yǎng)殖水體的理化因子以及微生物群落組成分析，揭示了循環(huán)水系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)微生物組成特征，說(shuō)明了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)可以有效降低養(yǎng)殖池出水中氨氮、硝酸鹽氮以及磷酸鹽的濃度以及降低弧菌數(shù)量，提高生物濾池中假交替單胞屬、乳桿菌屬、Allobaculum屬等菌屬豐度可以更好地維持循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的運(yùn)行，保障養(yǎng)殖效果。