董 倩，王家旺，黃國(guó)強(qiáng)

（1.福建技術(shù)師范學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，福建 福清 350300；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】硅（Silicon，Si）在土壤中的含量高達(dá)26.4%[1]，但主要以不可溶晶態(tài)硅存在，植物并不能吸收，只有少量可溶性單硅酸被植物吸收利用，含量在0.1～0.6 mmol·L-1[2]。硅是大多數(shù)植物生長(zhǎng)發(fā)育的準(zhǔn)必需元素，對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)有益[3]。硅能延緩功能葉早衰[4]，提高光合色素含量和光合能力[5]，促進(jìn)干物質(zhì)累積，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[6-8]。硅還能改變碳、氮和磷代謝相關(guān)基因[9]及激活防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)感病作物產(chǎn)生抗毒物質(zhì)如酚醛類和黃酮類等[10]，以及抑制鎘[11]和鎳[12]等重金屬的吸收累積，提高作物對(duì)病蟲(chóng)害和逆境的抵抗能力[13-15]。金線蓮Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.為蘭科多年生草本珍稀草藥，素有“藥王”的美稱，其主要活性藥效成分是黃酮類和多糖類[16]，具有清除自由基、抗氧化、消炎、增強(qiáng)免疫力等多種藥效[17]。因人為過(guò)度采挖，加之生長(zhǎng)緩慢，金線蓮野生資源已十分匱乏，被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)珍稀植物，現(xiàn)已采用組培擴(kuò)繁、人工大棚或林地仿野生栽植等方式生產(chǎn)金線蓮。因生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量少，金線蓮的市場(chǎng)售價(jià)高，然而人工生產(chǎn)的栽培期短和品種差異導(dǎo)致有效活性成分差異大、含量低等問(wèn)題困擾和阻礙了金線蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，如何通過(guò)改變?cè)耘啻胧┨岣呓鹁€蓮產(chǎn)量和活性成分含量，一直是金線蓮研究的熱點(diǎn)[18,19]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，硅對(duì)鹽脅迫下甘草非藥用部位莖和葉中總黃酮的積累有明顯的促進(jìn)作用，這種促進(jìn)效應(yīng)因硅濃度、脅迫時(shí)間和不同部位而異[20]。于濤等研究發(fā)現(xiàn)，水稻增施硅鈣肥能顯著提高各生育時(shí)期葉片總酚和類黃酮含量，能明顯降低穗頸瘟的病穗率和病情指數(shù)[21]。何永美等發(fā)現(xiàn)，用UV-B輻射水稻兩個(gè)品種后，其葉中硅的含量與總酚和類黃酮含量均呈極顯著正相關(guān)[22]，硅素有助于提高葉中酚類化合物合成關(guān)鍵酶PAL的活性和調(diào)控葉中的酚類化合物代謝[23]。楊開(kāi)興[24]利用沼液施肥可顯著增加金線蓮的葉綠素、總黃酮和多糖含量。栽培期長(zhǎng)短以及不同栽培基質(zhì)均會(huì)影響金線蓮多糖和總氨基酸的累積[25]，林下仿生種植的總黃酮含量顯著高于大棚種植。【本研究切入點(diǎn)】施用硅是否也能提高金線蓮的產(chǎn)量和品質(zhì)，相關(guān)研究目前還未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以福建紅霞金線蓮為材料，利用水培的方式，通過(guò)在培養(yǎng)液中施加不同濃度的硅，研究其對(duì)與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、代謝生理有關(guān)的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的影響，測(cè)定其藥效成分總黃酮和多糖含量的變化，為名貴中藥材金線蓮的提質(zhì)促產(chǎn)提供理論依據(jù)和高效栽培措施。

1 材料與方法

1.1 材料試劑及主要儀器

福建紅霞金線蓮為福建閩鑫種業(yè)有限公司組培的商品瓶苗，硅素供體試劑為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)的Na2SiO3·9H2O，霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（青島海博生物），蘆丁對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：100080-201811），葡萄糖等其他藥品均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)）。

AUW220D十萬(wàn)分之一電子天平（日本島津），Dualex4植物氮平衡指數(shù)測(cè)量?jī)x（法國(guó)FORCE-A），Lambda35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（PerkinElmer公司），HH-2（雙列）電子數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），KQ-2200超聲波清洗器（上海錦玟儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硅對(duì)金線蓮生長(zhǎng)的影響 瓶苗開(kāi)蓋馴化3 d，洗凈根部用育苗海綿包裹苗根塞入定植籃中，植于增氧水培種植箱中，用10倍稀釋霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液作為基本培養(yǎng)液（pH 5.8）預(yù)培養(yǎng)2 d。每隔1 h用氣泵為處理液定時(shí)充氣15 min，培養(yǎng)溫度（23±2） ℃，光照周期為 14 h·d-1，光照強(qiáng)度為 54 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 硅處理 用 Na2SiO3·9H2O和基本培養(yǎng)液配制含不同硅濃度的處理液（pH 5.8），選取生長(zhǎng)一致的金線蓮進(jìn)行水培處理。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)濃度處理（0、0.175、 0.350、 0.525、 0.700、 0.875 mmol·L-1）， 每個(gè)處理30株，重復(fù)3次。處理液每2 d更換一次，培養(yǎng)條件同上。處理30 d后，測(cè)定與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、代謝生理有關(guān)的相對(duì)生長(zhǎng)率（R，Relative growth rate）、葉綠素含量、氮平衡指數(shù)（Nitrogen balance index，NBI）和過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性，以及與其藥效相關(guān)的總黃酮和多糖含量等各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.2.3 相對(duì)生長(zhǎng)率的測(cè)定 金線蓮生長(zhǎng)緩慢，為避免單株測(cè)量產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，采用測(cè)定處理前后總鮮重（30株）變化的方法，計(jì)算出相對(duì)生長(zhǎng)率（R），以此作為對(duì)比各處理對(duì)金線蓮生長(zhǎng)影響的指標(biāo)。稱量前用吸水紙吸干金線蓮樣品表面水分，用分析天平測(cè)定每處理（30株）的總鮮重。R計(jì)算公式如下：R=（m2-m1）/m1×100%（m1為處理前總鮮重，m2為處理后總鮮重）。

1.2.4 氮素營(yíng)養(yǎng)參數(shù)測(cè)定 每個(gè)處理每次隨機(jī)選6株樣株，重復(fù)3次，測(cè)定其+1葉（頂端第一片完全展開(kāi)葉為+1葉，葉序依次向下遞增）葉脈兩側(cè)中部?jī)牲c(diǎn)氮平衡參數(shù)，參數(shù)包括葉綠素指數(shù)（Chl）、類黃酮指數(shù)（Flav）、花青素指數(shù)（Anth）和氮平衡指數(shù)（NBI）。

1.2.5 葉綠素含量測(cè)定 每個(gè)處理每次隨機(jī)選6株樣株，重復(fù)3次，取+1葉，剪碎后稱得混合樣0.20 g，采用95%乙醇提取葉綠素[26]，利用分光光度計(jì)測(cè)定665 nm、649 nm波長(zhǎng)下的吸光度A665和A649，根據(jù)下列公式分別計(jì)算葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和總?cè)~綠素（Chl）的含量。

1.2.6 過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定 每個(gè)處理每次隨機(jī)選6株樣株，重復(fù)3次，剪取并歸集+1、+2、+3葉，各位葉每次取其鮮葉混合樣0.1 g，利用愈創(chuàng)木酚-比色法[27]測(cè)定各位葉的POD活性。

1.2.7 總黃酮和多糖提取測(cè)定 每個(gè)處理每次隨機(jī)選6株樣株，重復(fù)3次，全草105 ℃殺青30 min后，80 ℃干燥至恒重，粉碎后過(guò)60目篩備用，總黃酮和多糖含量采用張志信等[28]優(yōu)化后的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)用Excel 2013整理和制表繪圖，用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan法進(jìn)行多重比較分析（α=0.05和α=0.01），數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅對(duì)金線蓮生長(zhǎng)的影響

由圖1可見(jiàn)，各處理相對(duì)生長(zhǎng)率均比對(duì)照高，相對(duì)生長(zhǎng)率（R）總體呈先升后降的趨勢(shì)，各處理均顯著高于對(duì)照（P＜0.01）。0.175和 0.700 mmol·L-1的硅處理效果最佳，R值顯著高于對(duì)照和其他處理（P＜0.05），對(duì)金線蓮的生長(zhǎng)促進(jìn)作用更強(qiáng)；而高濃度0.875 mmol·L-1的硅對(duì)金線蓮的促生作用最弱，但依然顯著好于對(duì)照（P＜0.01）。

2.2 硅對(duì)金線蓮葉片葉綠素含量的影響

從圖2可以看出，處理對(duì)葉綠素a含量的影響大，其含量呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)；對(duì)葉綠素b影響不明顯；葉綠素總含量的變化趨勢(shì)和葉綠素a相似，各處理組均高于對(duì)照。葉綠素總含量在0.525 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)最大值，較對(duì)照高33.66%（P＜0.01）；處理濃度增大到 0.700 mmol·L-1時(shí)含量不增反降，但依然高于對(duì)照（P＜0.01）；處理濃度增大到0.875 mmol·L-1時(shí)，總含量依然高于對(duì)照值，但差異不顯著。由此可見(jiàn)，0.525 mmol·L-1的硅對(duì)金線蓮的光合生長(zhǎng)更有益，0.875 mmol·L-1的硅則無(wú)明顯益處。

2.3 硅對(duì)金線蓮氮素營(yíng)養(yǎng)的影響

NBI反映作物早期氮素營(yíng)養(yǎng)狀況和長(zhǎng)勢(shì)，可快速測(cè)定并預(yù)測(cè)其產(chǎn)量。結(jié)果表明，硅處理后金線蓮+1葉的NBI和Chl指數(shù)值均呈先增后減的趨勢(shì)（見(jiàn)表1），而Flav值的變化則相反。在0.175 mmol·L-1處理后，Chl值較對(duì)照高11.71%（P＜0.01），NBI值較對(duì)照高18.43%（P＜0.05），F(xiàn)lav值較對(duì)照低，但差異不顯著。當(dāng)處理濃度為0.525 mmol·L-1時(shí)，NBI和Chl值最大，分別較對(duì)照高66.87%和24.70%，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；Flav值較對(duì)照低22.73%（P＜0.01）。當(dāng)濃度≥0.700 mmol·L-1時(shí)，NBI和Chl值均顯著低于對(duì)照值（P＜0.05）；Flav值則顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。硅對(duì)Anth值無(wú)影響。由此可見(jiàn)，金線蓮對(duì)低濃度（0.175mmol·L-1）硅處理即可快速響應(yīng)，當(dāng)處理濃度為0.525 mmol·L-1時(shí)，金線蓮的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況達(dá)到最佳，氮素營(yíng)養(yǎng)吸收利用好，極大地促進(jìn)葉綠素的合成；但濃度增大后（≥0.700 mmol·L-1），金線蓮的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況出現(xiàn)異常變化，可能偏向次生代謝物質(zhì)的累積，促進(jìn)了總黃酮等其他成分的合成和累積。

表1 不同濃度硅處理對(duì)金線蓮氮平衡指數(shù)的影響Table 1 Effect of silicon application at varied concentrations on NBI of A.roxburghii

2.4 硅對(duì)金線蓮葉片POD酶活性的影響

圖3可見(jiàn)，測(cè)定金線蓮POD酶活的最佳反應(yīng)時(shí)段應(yīng)控制在120 s內(nèi)。POD酶在植物體內(nèi)普遍存在且活性較高的一種抗氧化保護(hù)酶類，它可以清除植物體內(nèi)的過(guò)氧化氫，對(duì)環(huán)境因子變化十分敏感，測(cè)定其活性可反映植物體內(nèi)的代謝變化，是研究植物生理變化非常重要的指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)表2），對(duì)照組+1葉的POD酶活分別較+2葉和+3葉高68.87%和31.78%，表明新葉的抗氧化生理活性高于老葉。各處理組+1、+2和+3葉POD酶活較對(duì)照均有提高，表明硅處理增強(qiáng)了金線蓮的抗氧化能力。POD酶活隨處理濃度的增大呈現(xiàn)出雙峰態(tài)勢(shì)，在處理濃度為 0.175 mmol·L-1和 0.700 mmol·L-1時(shí)，各葉酶活均處于較高峰值，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），各葉值大小均為+1＞+3＞+2 葉。0.175 mmol·L-1處理組+1葉、+2葉和+3葉中POD酶活分別比對(duì)照高179.41%、231.13%和191.97%， 對(duì)其各葉抗氧化能力影響的大小為+2＞+3＞+1 葉。0.700 mmol·L-1處理組+1、+2和+3葉中POD酶活性分別比對(duì)照高179.80%、210.60%和155.30%，抗氧化能力影響大小是+2葉＞+1葉＞+3葉?？梢?jiàn)，硅處理對(duì)+2葉的抗氧化能力影響大。

表2 不同濃度硅處理對(duì)金線蓮不同葉位葉片POD酶活的影響Table 2 Effect of silicon application at varied concentrations on peroxidase activity in differently located leaves on an A.roxburghii plant

2.5 硅對(duì)金線蓮多糖的影響

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖4）計(jì)算各處理樣品中的多糖含量（以葡萄糖計(jì)）（見(jiàn)圖5）。當(dāng)硅濃度為0.175～0.525 mmol·L-1時(shí)，金線蓮多糖含量呈下降趨勢(shì)，顯著低于對(duì)照值（P＜0.05、0.01）；當(dāng)處理濃度增大到0.700 mmol·L-1時(shí)，多糖含量達(dá)到最高水平，是對(duì)照的2倍以上（P＜0.05、0.01）；繼續(xù)增大到0.875 mmol·L-1時(shí)，多糖含量反而下降，但依然比對(duì)照高41.94%，差異顯著（P＜0.05、0.01）。由此可見(jiàn)，高濃度硅能提高金線蓮的多糖含量，0.700 mmol·L-1硅處理對(duì)多糖累積效果最佳。

2.6 硅對(duì)金線蓮總黃酮的影響

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖6）計(jì)算各處理樣品中的總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）（見(jiàn)圖7）。硅處理對(duì)金線蓮總黃酮含量的影響變化與多糖較為相似。0.175～0.525 mmol·L-1處理時(shí)，金線蓮的總黃酮含量也呈下降趨勢(shì)，顯著低于對(duì)照（P＜0.05）；濃度增大到0.700 mmol·L-1時(shí)，金線蓮的總黃酮含量達(dá)到最高，比對(duì)照高71.45%（P＜0.01）；繼續(xù)增大處理濃度到0.875 mmol·L-1時(shí)，總黃酮含量反而大幅下降，且低于對(duì)照，但差異不顯著。由此可見(jiàn)，0.700 mmol·L-1硅處理最益于提高金線蓮總黃酮含量，高濃度（≥0.875 mmol·L-1）處理反而會(huì)降低。

3 討論

單子葉植物大都屬高硅累積植物（喜硅植物），其葉片的硅含量顯著高于雙子葉植物[29]，施硅對(duì)其生長(zhǎng)有利；金線蓮也是單子葉植物，試驗(yàn)表明適宜濃度的硅對(duì)金線蓮的生長(zhǎng)也有益，但金線蓮是否也屬于高硅累積植物，還需通過(guò)測(cè)定其體內(nèi)硅的含量來(lái)確定。濃度處理對(duì)比發(fā)現(xiàn)，0.175～0.700 mmol·L-1處理較 0.875 mmol·L-1處理對(duì)鮮重增長(zhǎng)效果更好，總?cè)~綠素含量呈先升后降趨勢(shì)，以及氮素營(yíng)養(yǎng)吸收利用（NBI）也表現(xiàn)出低促高抑現(xiàn)象，硅對(duì)這三者的影響表現(xiàn)出一致性，表明低濃度硅較高濃度硅對(duì)金線蓮生長(zhǎng)更有益。已有研究認(rèn)為低濃度硅會(huì)提高植物對(duì)N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn等元素的吸收利用，而高濃度硅會(huì)抑制磷、鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)離子的吸收和利用[30]。0.525 mmol·L-1濃度硅處理后，總?cè)~綠素含量、Chl值和NBI值均達(dá)最高值，表明該處理的金線蓮對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)吸收利用最好，能促進(jìn)葉綠素合成并提高含量。已有研究發(fā)現(xiàn)，適量硅可促進(jìn)植物氮素營(yíng)養(yǎng)吸收、氨基酸（如L-谷氨酸）合成和原葉綠素酸酯及葉綠素的形成，能顯著提高水稻、甘蔗和番茄的葉綠素總含量[31]，還能使葉綠體片層結(jié)構(gòu)和基粒增多，提高光合同化能力和增加物質(zhì)累積[32]。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硅對(duì)金線蓮葉綠素總含量和NBI指數(shù)的影響變化趨勢(shì)是一致的，符合李振海等[33]關(guān)于利用氮平衡指數(shù)建模估測(cè)葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具有較好精度的論斷，可通過(guò)測(cè)定NBI指數(shù)實(shí)現(xiàn)葉綠素含量的快速及無(wú)損監(jiān)測(cè)和估算。棉花葉片NBI值和Chl值的變化與葉片全氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[34]，NBI、Chl可作為作物氮素營(yíng)養(yǎng)狀況變化的快速診斷指標(biāo)。因此，在金線蓮栽培生產(chǎn)中，是否也可通過(guò)測(cè)定NBI和Chl值早期判斷其氮素營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)狀態(tài)值得進(jìn)一步研究和探討。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，金線蓮+1葉中的POD酶活性分別均較+2葉和+3葉的高，這可能與+1葉正處于發(fā)育成熟初期有關(guān)，因?yàn)镻OD也是木質(zhì)素單體合成的關(guān)鍵酶，其活性在開(kāi)始成熟或老化組織中活性較高，POD活性的增強(qiáng)亦可作為植物細(xì)胞和組織逐步成熟或衰老的一種生理指示。0.175 mmol·L-1的硅處理時(shí)，金線蓮氮代謝及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，增強(qiáng)POD酶活性有利于清除體內(nèi)過(guò)多的自由基；另一個(gè)峰值出現(xiàn)在0.700 mmol·L-1處理， POD酶活性提高可能與酚類（類黃酮）和多糖等次生代謝物質(zhì)的合成有關(guān)，因?yàn)镻OD不僅是植物酶促防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，作為代謝調(diào)節(jié)因子還參與酚類（類黃酮）物質(zhì)及植保素的合成。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，硅素營(yíng)養(yǎng)與水稻葉片酚類化合物代謝存在密切聯(lián)系；水稻在缺硅條件下，葉中的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia-lyase，PAL）活性和酚類化合物含量均極顯著下降[35]，而PAL正是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝的酶，是酚類化合物代謝的關(guān)鍵酶和限速酶；硅素能在水稻葉上大量沉積，有助于提高葉片酚類化合物合成關(guān)鍵酶PAL的活性，以及調(diào)節(jié)4一香豆酸輔酶A連接酶（4CL）的活性及其編碼基因的表達(dá)，促進(jìn)水稻葉酚類化合物的合成[23]。試驗(yàn)結(jié)果也表明，0.700 mmol·L-1濃度處理能顯著增加金線蓮的總黃酮和多糖含量，且0.700 mmol·L-1的濃度優(yōu)于 0.875 mmol·L-1。

綜上所述，施用適量的硅對(duì)金線蓮水培是有益的。硅濃度為0.525 mmol·L-1時(shí)促進(jìn)金線蓮氮素營(yíng)養(yǎng)吸收利用和光合機(jī)能，相對(duì)生長(zhǎng)率最高，適用于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)；0.700 mmol·L-1硅處理使金線蓮總黃酮和多糖含量最高，對(duì)提高其藥用品質(zhì)有益。今后，可進(jìn)一步研究在金線蓮不同栽培模式下進(jìn)行硅處理和延長(zhǎng)處理時(shí)間，對(duì)其不同器官中藥效成分累積的影響，以及施硅對(duì)其抗病抗逆性的影響等方面開(kāi)展研究，為金線蓮的提質(zhì)促產(chǎn)提供切實(shí)有效的栽培技術(shù)措施和科學(xué)的理論依據(jù)。