馬秀奇，張曉娟 ，孫曉敏，陳 喬，張 羽，何開罡，權(quán) 瑩，宋建民

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與培訓(xùn)中心，陜西 漢中723001；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 漢中 723001；4.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000）

0 引言

【研究意義】油菜作為重要的油料作物，是我國乃至世界范圍內(nèi)食用油供給的主要來源。油菜除了油用，還可作為蔬菜、飼料、觀賞作物及蜜源，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國油菜種植面積及分布居油料作物之首[1]。因此，油菜安全生產(chǎn)對(duì)國民經(jīng)濟(jì)意義重大。由真菌-核盤菌引起的菌核病給油菜生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅，引起油菜產(chǎn)量及品質(zhì)大幅度降低[2,3]。我國長(zhǎng)江中下游地區(qū)氣候濕潤(rùn)，加之近些年油菜種植密度增加，加重了該病害的發(fā)生[4]?？寺∮筒丝咕瞬』?，研究油菜抗菌核病分子機(jī)理，對(duì)通過分子設(shè)計(jì)育種途徑選育性狀優(yōu)良的抗病油菜新品種意義重大[5]。【前人研究進(jìn)展】吡咯林-5-羧酸還原酶（Pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR ）是真核生物中重要的一種管家蛋白，催化脯氨酸生物合成的最后一步反應(yīng)，負(fù)責(zé)在細(xì)胞質(zhì)中將脯氨酸、精氨酸、鳥氨酸和谷氨酸中間代謝產(chǎn)物吡咯啉-5-羧酸（Δ1-pyrroline-5-carboxylate，P5C）還原成為脯氨酸，在氨基酸代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)室前期通過大豆菌核病全基因組關(guān)聯(lián)分析得出P5CR基因與菌核病抗性強(qiáng)關(guān)聯(lián)[6]，推測(cè)該基因可能與油菜菌核病抗性有關(guān)。Senthil-Kuma等研究表明鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（δOAT）和脯氨酸脫氫酶（ProDH1和ProDH2）通過調(diào)控P5C代謝誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)進(jìn)而參與非寄主抗性[7]。周婉瑩等對(duì)甘藍(lán)型油菜A10、C09上的P5CR同源基因進(jìn)行克隆及多態(tài)性分析，結(jié)果得出，A10染色體中的P5CR同源基因上的多態(tài)性位點(diǎn)與菌核病抗性沒有顯著關(guān)聯(lián)，C09染色體上P5CR同源基因在感病材料中存在一段A10染色體上P5CR同源基因片段的插入，導(dǎo)致前者ORF改變，進(jìn)而可能造成該基因抗病性喪失。推測(cè)C09染色體中的P5CR同源基因與油菜對(duì)菌核病的抗性相關(guān)[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于P5CR基因與油菜抗菌核病關(guān)系研究報(bào)道較少。甘藍(lán)型油菜A03、C03染色體上的P5CR同源基因與油菜菌核病抗性關(guān)系及抗性相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以對(duì)菌核病具有較好抗性的中油821、滬16油菜以及感病油菜川秦6R及南12R為研究材料，設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)甘藍(lán)型油菜C03、A03染色體上的P5CR同源基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序及表達(dá)研究，分析P5CR基因中的SNP位點(diǎn)及其與油菜菌核病抗性的相關(guān)性，為油菜菌核病抗性基因克隆、油菜抗菌核病機(jī)制揭示及通過分子標(biāo)記輔助育種選育抗病油菜新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用高抗、高感菌核病油菜為試驗(yàn)材料（表1），抗病材料記為R，感病材料記為S。油菜材料于2021年種植于漢中勉縣黃沙鎮(zhèn)試驗(yàn)田（106°7＇91.26″E，33°13＇77.72″N）。大腸桿菌 DH5α（TaKaRa，中國大連）由本實(shí)驗(yàn)室保存。核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）由漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與培訓(xùn)中心惠贈(zèng)。TransStart fast Pfu fly DNA polymerse（全式金公司，北京）、植物總RNA提取試劑盒（莊萌生物，北京）、EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒II（艾科瑞生物，湖南）、CTAB、瓊脂糖、異丙醇、無水乙醇、Goldview核酸染料購自西安沃爾森公司。

表1 油菜樣品的編號(hào)、品種名稱和表現(xiàn)型Table 1 Codes, variety names, and phenotypes of B.napus samples

1.2 油菜基因組DNA提取及檢測(cè)

采集供試油菜材料幼嫩葉片。采取改良CTAB法[9]提取油菜基因組DNA。通過1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA完整性。

1.3 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥P5CR基因（AT5G14800）蛋白序列，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）中的Blast軟件，在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源基因比對(duì)（比對(duì)指標(biāo)為序列覆蓋度達(dá)90%以上，同源性大于80%，e-value小于1e-5）。針對(duì)甘藍(lán)型油菜C03及A03染色體上P5CR同源基因設(shè)計(jì)特異引物（表2）。引物由西安沃爾森科技有限公司合成。

表2 甘藍(lán)型油菜C03及A03染色體上P5CR同源基因引物序列信息Table 2 Primer sequence of P5CR on chromosomes C03 and A03 of B.napus

PCR反應(yīng)體系共25 μL，其中TransStart fast Pfu fly DNA polymerse 0.5 μL， 5×TransStrat Fast Pfu Fly buffer 5 μL， 2.5 mmol·L-1dNTP 2 μL， 50 ng·μL-1DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 17 μL。PCR 預(yù)變性采取 94℃ 4 min，接著94 ℃變性1 min，然后58 ℃退火30 s，最后72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸7 min后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后膠回收目標(biāo)產(chǎn)物，并與PMD19-T載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化體系涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含IPTG 200 mg·L-1，XGal 20 mg·L-1） 37 ℃ 倒 置 培 養(yǎng) 過 夜 ， 進(jìn) 行 菌 落PCR鑒定，將陽性克隆送測(cè)序。

1.4 序列分析

高抗、高感菌核病油菜材料P5CR同源基因測(cè)序結(jié)果通過DNASTAR Lasergene中的Megalign軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析抗、感材料之間的多態(tài)性位點(diǎn)。同時(shí)，從NCBI網(wǎng)站中甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫中下載甘藍(lán)型油菜C03及A03染色體上P5CR基因的參考序列，與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多重序列比對(duì)。利用DNAMAN軟件將P5CR基因翻譯成蛋白序列，并對(duì)抗、感油菜材料中P5CR基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 核盤菌培養(yǎng)、接種及樣品采集

將核盤菌菌核置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上22 ℃暗培養(yǎng)4 d。接著，將邊緣的菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。2 d后，菌絲體直徑約為6 mm，用于接種試驗(yàn)。于油菜初花期，采集抗菌核病油菜材料中油821及感病材料南12R相同部位相同大小的葉片，通過葉片離體接種法對(duì)其進(jìn)行核盤菌接種[10]。分別采集接種前（即接種0 h）及接種后6 h、12 h、24 h及48 h抗、感菌核病油菜葉片，迅速放入液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)。

1.6 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取采用植物總RNA試劑盒提?。ㄌ崛〔襟E參照試劑盒說明書），通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，采用Nanodrop核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度。采取Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒II進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用ddH2O將合成的cDNA稀釋10倍，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 qPCR檢測(cè)P5CR基因表達(dá)

根據(jù)A03及C03上P5CR同源基因序列分別設(shè)計(jì)特異引物，通過定量PCR分析A03及C03染色體上P5CR基因在抗、感菌核病油菜材料接種前及接種后6 h、12 h、24 h、48 h的表達(dá)量。本研究中的內(nèi)參基因?yàn)閁bc21。P5CR基因及內(nèi)參引物序列信息見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜A03及C03染色體上P5CR同源基因的擴(kuò)增

將擬南芥P5CR基因在甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，共得到4個(gè)P5CR同源基因，分別位于A10、C09、C03及A03染色體上（基因序列號(hào)分別為106 372 121、106 416 421、106 417 090、106 431 715）。課題組前期已對(duì)A10、C09染色體上P5CR同源基因進(jìn)行了克隆[8]，本研究對(duì)A03及C03染色體上P5CR基因進(jìn)行克隆及序列分析。

在抗、感菌核病油菜材料中，利用引物P5CRA03F1/P5CRA03R1對(duì)A03染色體上的P5CR同源基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條2000 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期條帶大小（1977 bp）相符（圖1A）。接著，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆及測(cè)序。

利用引物P5CRC03F2/P5CRC03R2對(duì)抗、感菌核病油菜材料C03染色體上P5CR同源基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為大小介于1 200～2 000 bp的特異性條帶（圖1B），與本研究預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大?。? 889 bp）相符。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆測(cè)序。

2.2 抗、感菌核病油菜P5CR基因多態(tài)性分析

抗、感菌核病油菜材料A03染色體上P5CR基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序、序列分析得出，該基因全長(zhǎng)1 526 bp，有6個(gè)內(nèi)含子，7個(gè)外顯子。該基因在抗、感菌核病油菜材料中共存在15個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別位于A03染色體上P5CR同源基因的21、34、70、130、153、234、235、580、631、736、766、803、841、1 546及1 574位。其中，234位在感病油菜材料中為C、在抗病油菜材料中為A，235位在感病油菜中為C，與參考基因序列一致，在抗病油菜中突變?yōu)門。推測(cè)這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與油菜菌核病抗性相關(guān)（圖2）。

抗、感菌核病油菜材料C03染色體上P5CR基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序、序列分析得出，該基因全長(zhǎng)1 457 bp，有6個(gè)內(nèi)含子，7個(gè)外顯子。抗、感材料中該基因共存在7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別位于該基因的 564、579、636、671、673、676、679 位。其中3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與材料的抗、感性狀相關(guān)（圖3），即抗病材料中該基因564、636及679位由C突變?yōu)門，推測(cè)這三個(gè)位點(diǎn)與油菜抗病性相關(guān)。

A03染色體上P5CR基因編碼蛋白序列分析得出，該基因編碼蛋白質(zhì)含276個(gè)氨基酸。在抗、感菌核病油菜中存在多態(tài)性的位點(diǎn)234及235均位于該基因第一個(gè)內(nèi)含子中，不引起編碼氨基酸序列改變?？埂⒏芯瞬∮筒瞬牧螩03染色體上P5CR基因編碼蛋白序列分析得出，該基因編碼蛋白質(zhì)含144個(gè)氨基酸。分析抗、感材料中可能與油菜菌核病抗性相關(guān)的位點(diǎn)得出，抗性材料的P5CR基因564位SNP為同義突變，不引起編碼氨基酸改變，其余兩個(gè)SNP位點(diǎn)（636及679位）位于內(nèi)含子中，不編碼蛋白質(zhì)。

2.3 qPCR分析抗、感菌核病油菜中P5CR基因表達(dá)

為進(jìn)一步分析P5CR基因是否參與油菜對(duì)菌核病的抗性，通過qPCR分析A03及C03染色體上P5CR基因在抗、感菌核病油菜材料中接種核盤菌前及接種后不同時(shí)間的表達(dá)。結(jié)果顯示，A03上的P5CR基因在接種前后的抗、感菌核病油菜材料中表達(dá)模式不同?？共∮筒瞬牧现?，A03上的P5CR基因在接種前后變化明顯，在接種后24 h該基因的表達(dá)量最高，達(dá)到未接種時(shí)的2倍多。感病材料中，A03上的P5CR基因在接種前后表達(dá)量差異不大（圖4A）。C03染色體上的P5CR基因在接種前后抗、感菌核病油菜材料中同樣存在不同的表達(dá)模式，其在抗病材料中接種后24 h表達(dá)量最高，為未接種時(shí)的3倍多。感病材料中，C03染色體上的P5CR基因在接種后6 h、12 h表達(dá)量相對(duì)于未接種時(shí)略有所提高（圖4B）。綜上，A03及C03染色體上的P5CR基因在抗病材料接種后24 h表達(dá)量顯著升高，說明該基因可能參與了油菜對(duì)菌核病的抗性。感病材料中，C03染色體上的P5CR基因雖然在接種后6 h、12 h表達(dá)量相對(duì)于未接種時(shí)略有所提高，但整體變化不大，導(dǎo)致其對(duì)菌核病未能表現(xiàn)出較好的抗性。

3 討論

油菜是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物。油菜菌核病是世界范圍內(nèi)尤其是溫帶地區(qū)普遍發(fā)生的一種嚴(yán)重的油菜病害。我國的東南沿海地區(qū)及長(zhǎng)江流域，該病的田間發(fā)病率較高，導(dǎo)致油菜產(chǎn)量降低10%～30%，甚至高達(dá)80%，給油菜生產(chǎn)造成很大損失[11]。近年來，由于油菜機(jī)械化高密度種植，該病有不斷加重的趨勢(shì)?？寺∮筒丝咕瞬』?，開發(fā)抗病基因分子標(biāo)記，通過分子標(biāo)記輔助育種方式選育抗病油菜新品種是防治油菜菌核病最根本有效的途徑。

P5CR是脯氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶。脯氨酸作為一種抗?jié)B透脅迫調(diào)節(jié)劑，在植物滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，脯氨酸的積累是植物對(duì)各種脅迫（包括鹽和滲透脅迫）的普遍反應(yīng)，脯氨酸累積量與植物的脅迫耐受能力呈正相關(guān)[12,13]。首個(gè)P5CR基因在大豆中被克隆到，該基因全長(zhǎng)1.2 kb，編碼蛋白為單體蛋白[14]。之后相繼在擬南芥、水稻、黑麥草、木薯等植物中分離到P5CR基因[15-18]。付莉莉等（2016）克隆了木薯中P5CR基因，對(duì)該基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析表明，P5CR基因表達(dá)受脅迫調(diào)控。P5CR基因還響應(yīng)低溫、鹽和ABA等脅迫條件[19]。在低溫脅迫條件下，AtP5CR的表達(dá)量顯著提高[20]。擬南芥中，P5CR基因表達(dá)受鹽脅迫調(diào)控[21]。Cao等（2015）克隆了黑麥草（Lolium perenneL.）P5CR基因，其全長(zhǎng)1 047 bp，受鹽、PEG、低溫和ABA處理誘導(dǎo)[15]。

目前，關(guān)于P5CR基因與植物抗病性的研究報(bào)道較少。甘藍(lán)型油菜基因組中共有4個(gè)P5CR同源基因，課題組前期克隆了C09、A10上P5CR同源基因。本研究對(duì)C03、A03染色體上的P5CR同源基因進(jìn)行克隆測(cè)序及多態(tài)性分析，研究得出甘藍(lán)型油菜C03染色體上P5CR同源基因全長(zhǎng)1 457 bp，抗、感油菜材料中，C03染色體上P5CR同源基因共存在7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（564、636及679位）推測(cè)與油菜抗病性相關(guān)。A03染色體上的P5CR同源基因全長(zhǎng)1 526 bp，其在抗、感菌核病油菜材料中共存在15個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中，234、235位2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)推測(cè)與油菜菌核病抗性相關(guān)。進(jìn)一步，P5CR基因編碼蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分析顯示，抗性材料中C03染色體上P5CR基因564位SNP為同義突變，不引起編碼氨基酸改變，其余兩個(gè)SNP位點(diǎn)（636及679位）位于內(nèi)含子中。A03上與菌核病抗性相關(guān)的兩個(gè)位點(diǎn)234、235位均位于內(nèi)含子中。通過qPCR分析A03、C03染色體上P5CR在抗、感油菜接種前及接種后不同時(shí)間的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在抗病材料中，A03及C03染色體上的P5CR基因在接種后24 h表達(dá)量均明顯提高，說明A03、C03染色體上的P5CR基因均可能與油菜菌核病抗性相關(guān)。結(jié)合基因測(cè)序及定量PCR結(jié)果，本研究得出P5CR基因可能是通過基因表達(dá)水平的變化參與油菜抗菌核病反應(yīng)。下一步，研究將擴(kuò)大樣本量，篩選出更多的高抗、高感菌核病油菜材料，對(duì)P5CR基因進(jìn)行克隆及測(cè)序，從而進(jìn)一步驗(yàn)證抗、感菌核病油菜材料中P5CR基因上的多態(tài)性位點(diǎn)與油菜菌核病抗性相關(guān)性。同時(shí)，研究將通過轉(zhuǎn)基因、RNA干擾等實(shí)驗(yàn)對(duì)P5CR基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

本研究為揭示油菜抗菌核病分子機(jī)理、油菜抗菌核病分子標(biāo)記開發(fā)及油菜抗病新品種選育奠定基礎(chǔ)。