吳加香，劉 濤，謝永輝，黃之遠，字淑慧

（1.云南農(nóng)業(yè)大學西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明，650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650201；3.云南省煙草公司昆明市公司，云南 昆明 650051）

0 引言

【研究意義】植物與微生物互作具有促進宿主植物健康生長、營養(yǎng)吸收、提高抗逆性及防病原菌侵害等多種有益功能[1]。植物通過微生物解毒酶（如超氧化物歧化酶，過氧化物酶，過氧化氫酶等）抑制體內(nèi)活性氧，通過促進內(nèi)生菌落定殖使其選擇性地募集有益微生物并幫助植物適應環(huán)境，這是植物與微生物互作的關(guān)鍵[1]?！厩叭搜芯窟M展】與植物地下部分的微生物群落相比，植物地上部的葉際由于受光照、濕度、溫度、養(yǎng)分利用率以及晝夜溫度波動等影響而擁有更具動態(tài)性的微生物群落，這些微生物群落因能進一步影響植物的生長性、抗逆性及減輕病原菌的侵害等功能而受到人們關(guān)注[2]。這其中，外源噴施茉莉酸甲酯（MeJA）通過提高SOD活性、H2O2積累[3]、POD、TP[4]等含量，抑制真菌性病害，減少農(nóng)藥施用量，而得到人們的青睞。植物噴施MeJA不僅通過誘導植物的抗氧化酶活性提高植株抗逆性，還對植物的病原微生物具有直接的抑制效果[5]。例如，MeJA誘導煙草對煙草炭疽病的抗性是通過提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性而實現(xiàn)的[6]，誘導獼猴桃提高SOD、POD等抗氧化酶活性可以產(chǎn)生軟腐病抗性[7]，誘導草莓對灰霉病[8]、小麥對根腐病[9]的抗性等，均說明MeJA可以誘導植物進一步提高抗病性。植物葉片中的SOD、POD、H2O2積累和總酚（TP）含量高低，是衡量植物抗病性及抗逆性的重要指標。【本研究切入點】過去的研究大多都是通過葉片噴施MeJA誘導抗性而降低植物病害，但MeJA噴施對植物葉際有害微生物豐度的影響鮮見報道，以及植物噴施MeJA后，葉片抗氧化酶活性的改變對葉際微生物菌群的影響鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以模式植物煙草為材料，通過外源噴施MeJA，研究其誘導產(chǎn)生的抗氧化酶活性與微生物菌群之間的相關(guān)性，為進一步研究植物抗性機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設(shè)計

供試煙草為紅花大金元；種植土壤購自昆明市斗南花鳥市場，每盆裝入腐殖土4 kg；供試茉莉酸甲酯購自美國Sigma公司，純度為95%，吸取114.6 μL 95%茉莉酸甲酯原液于燒杯中，加入10 mL無水乙醇溶解茉莉酸甲酯原液，待充分溶解后邊攪拌邊加入蒸餾水，定容至1 L，配制為0.5 mmol·L-1的濃度待用。加入10 mL無水乙醇后加蒸餾水，定容至1 L，配制為對照噴施溶液待用。

采用盆栽試驗，試驗設(shè)2個處理：噴施茉莉酸甲酯（MeJA）和噴施含1%乙醇的蒸餾水（CK），每個處理15個重復，共種植30盆。試驗地點位于云南省昆明市盤龍區(qū)云南農(nóng)業(yè)大學教學實驗大棚中。每周澆灌1次營養(yǎng)液，培養(yǎng) 30 d 后噴施茉莉酸甲酯，連續(xù)噴施2 d，噴施的量以葉片不滴水珠為標準，3 d后進行取樣和相關(guān)指標的測量。

1.2 煙草樣品的采集

噴施茉莉酸甲酯3 d后，帶無菌手套，采集倒3葉，去除葉脈，裝入50 mL離心管放入液氮保存，用于酶活性測定。其余每個處理取3個生物學重復樣本，約5～6 g葉片立即放入無菌樣品袋中置于冰上，帶回實驗室， 稱重樣本，放入無菌管中，每克樣本加入10 mL 0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH=8.0），將樣本超聲洗滌1 min，渦旋10 s，此步驟重復2次，洗滌后的煙草葉片再用70%乙醇洗2次，儲存在-80 ℃冰箱用于提取葉際微生物基因組DNA。

1.3 煙草葉片酶活性測定

采用索萊寶試劑盒，采用可見分光光度法測定相關(guān)抗氧化酶活性和總酚含量。

1.4 煙草葉際微生物基因組DNA的提取

采用美國MP公司FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒提取，按試劑盒的試驗步驟進行土壤微生物總DNA的提取，DNA 樣品于-20 ℃保存待用。

1.5 PCR擴增及Illumina高通量測序

在提取樣本 DNA后，按表1中PCR擴增引物進行PCR擴增。

按表2 PCR擴增反應體系擴增后，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結(jié)果用平均數(shù)±標準誤表示，應用SPSS26.0軟件進行方差分析，利用單因素方差（Oneway ANOVA）分析法，使用Duncan多重比較法進行差異顯著分析，使用Origin作圖分析。

通過對原始數(shù)據(jù)的篩選、質(zhì)控、去接頭拼接，得到最優(yōu)的序列，并根據(jù)相似度97%的 OTU進行聚類，得到 OTU豐度表，供以后的分析使用。根據(jù)序列97%的相似度，將序列歸并并劃分為多個 OUTs。利用 Mothur計算豐富度指數(shù)ACE以及多樣性指數(shù)Shannon，并進行Alpha多樣性分析；同時進行細菌群落分布、聚類分析和細菌功能預測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對煙草抗氧化酶活性和總酚含量的影響

抗氧化酶活性提高和活性氧的產(chǎn)生是植物抗病早期的反應之一。由圖1可知，與未噴施茉莉酸甲酯相比，噴施茉莉酸甲酯能極顯著增加煙草葉片中的POD、H2O2和SOD活性（P＜0.01）；TP含量無顯著差異（P＞0.05）。由此可知，噴施茉莉酸甲酯可以誘導植物產(chǎn)生抗性。

2.2 茉莉酸甲酯對煙草葉際微生物群落豐富度和多樣性變化的影響

利用Alpha多樣性分析微生物群落的豐富度和多樣性。ACE指數(shù)可反映群落物種豐富度，由圖2-A可知，噴施茉莉酸甲酯顯著降低煙草葉際微生物細菌的豐富度（P＜0.05），極顯著降低煙草葉際微生物真菌的豐富度（P＜0.01）。Shannon指數(shù)可反映群落物種多樣性，由圖2-B可知，噴施茉莉酸甲酯極顯著降低煙草葉際微生物細菌的多樣性（P＜0.01），極顯著提高煙草葉際微生物真菌的多樣性（P＜0.01）。由此可知，噴施茉莉酸甲酯可降低煙草葉際細菌群落的豐富度和多樣性；提高煙草葉際真菌群落的豐富度和多樣性。

2.3 茉莉酸甲酯對煙草葉際微生物群落分類學組成的影響

圖3展示了煙草葉際細菌、真菌在優(yōu)勢菌屬（豐度＞1%）分類學水平的物種分布柱狀圖。如圖3-A所示，噴施茉莉酸甲酯煙草葉際優(yōu)勢真菌菌屬Golovinomyces（高氏白粉菌屬，43.26%）、unclassified_k__Fungi（未分類真菌屬，38.38%）、Cutaneotrichosporon（毛孢子菌屬，8.38%）、Lyophyllum（離褶傘菌屬，4.82%）、Alternaria（鏈格孢屬 ， 1.11%）和Fusarium（鐮刀菌屬1.03%）；未噴施茉莉酸甲酯煙草葉際優(yōu)勢真菌菌屬Golovinomyces（高氏白粉菌屬，93.40%）、unclassified_k__Fungi（未分類真菌屬，4.81%）、Cutaneotrichosporon（毛孢子菌屬，0.11%）、Lyophyllum（離褶傘菌屬，1.41%）。其中噴施茉莉酸甲酯顯著降低煙草葉際上的高氏白粉菌屬，而顯著增加了煙草葉際上的未分類真菌屬，未噴施茉莉酸甲酯的煙草葉際上鏈格孢屬和鐮刀菌屬的豐度低于0.01未展示出。說明在屬水平上葉際真菌群落結(jié)構(gòu)是不穩(wěn)定的，噴施茉莉酸甲酯會影響煙草葉際真菌群落組成。

如圖3B所示，煙草葉際細菌菌屬主要集中在Ralstonia（青枯菌屬，51.64%～52.84%）、Rhodococcus（紅球菌屬，20.81%～29.73%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（伯克霍爾德氏菌-卡巴拉尼亞-帕拉伯克霍爾德氏菌屬，3.08%～3.41%）、Phyllobacterium（葉桿菌屬，2.29%～3.61%）、Zoogloea（動膠菌屬，2.36%～2.49%）、Escherichia-Shigella（埃希-志賀氏屬，0.43%～2.30%）和Candidatus_Competibacter（念珠菌屬，0.89%～1.16%）；其中，青枯菌屬和紅球菌屬為煙草葉際細菌優(yōu)勢菌種。說明在屬水平上葉際細菌群落結(jié)構(gòu)是趨于穩(wěn)定的，噴施茉莉酸甲酯對煙草葉際細菌群落組成的影響較小。

2.4 樣本間主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）可反映樣品間的差異和距離，樣品組成越相似，則反映在PCA圖中的距離越近。由圖4可以看出，真菌群落的PC1軸和PC2軸的主要貢獻之和為99.72%，細菌群落的PC1軸和PC2軸的主要貢獻之和為96.97%；由圖可知，噴施茉莉酸甲酯后，樣品間真菌群落差異較大；而細菌群落細菌群落結(jié)構(gòu)相似。

2.5 屬水平的優(yōu)勢菌群與氧化酶活性相關(guān)性分析結(jié)果

為了解抗氧化酶活性與葉際微生物群落的關(guān)系，對葉際中的優(yōu)勢菌群（屬水平）和煙草氧化酶活性進行相關(guān)分析（表3）。結(jié)果表明，高氏白粉菌屬與SOD和H2O2活性顯著負相關(guān)（P＜0.05）；青枯菌屬與POD活性顯著正相關(guān)（P＜0.05）；伯克霍爾德氏菌-卡巴拉尼亞-帕拉伯克霍爾德氏菌屬與POD活性極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。而其他菌屬與氧化酶活性的相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同處理氧化酶活性與屬水平的優(yōu)勢菌群豐度Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis on oxidase activity and abundance of dominant flora at genus level under varied treatments

3 討論與結(jié)論

在植物的生長過程中，植物的健康狀況和抗病能力與防御酶活性密切相關(guān)[10]。茉莉酸甲酯在植物的生長發(fā)育和植物應激防御反應中發(fā)揮重要作用，外源噴施MeJA可作為重要逆境脅迫信號物質(zhì)，誘導植物產(chǎn)生一系列免疫響應，如激發(fā)植物抗逆蛋白和相關(guān)防御基因的表達[11]。以往的研究表明，茉莉酸甲酯可提高植物超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫（H2O2）、植物總酚（TP）積累[12,13]，增強植物的抗逆性，從而有效抵御病原菌的侵入。在本研究中，噴施茉莉酸甲酯極顯著提高煙草葉片中超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性和過氧化氫的積累。結(jié)果表明，噴施茉莉酸甲酯可以提高植物的防御酶活性，誘導植物啟動抗性，增強植物對環(huán)境脅迫的耐受性，也會誘導植物對病原微生物產(chǎn)生抗性，同時植物內(nèi)環(huán)境的變化也會影響植物的生長發(fā)育，改變植物葉際或內(nèi)生優(yōu)勢菌群[14]。

關(guān)于植物與微生物關(guān)系的建立，前人使用了共生關(guān)系來描述，兩者之間是一種長期的生態(tài)相互作用，可以從互惠到寄生[15]。微生物群落與作物生長發(fā)育的關(guān)系是微生物生態(tài)學和作物病害防治研究的重要課題[1]。植物的健康狀況與植物葉際微生物群落多樣性有關(guān)[16]。定殖在葉片的微生物可以改善生態(tài)系統(tǒng)（如有毒污染物的植物修復[17]和對植物生長有利的重要元素循環(huán)[18]）或有助于植物降低病原體的侵染[19]，這些微生物被認為是植物益生菌[20]。在以往關(guān)于植物益生菌的研究中，前人通過施用生物菌肥從而降低病原體感染植物，提高葉際微生物群落的豐富度和多樣性，降低植物的病害指數(shù)，促進植物生長。本結(jié)果表明，與未噴施茉莉酸甲酯的煙草相比，噴施茉莉酸甲酯的煙草葉際細菌豐富度和多樣性顯著降低，葉際真菌豐富度顯著降低，但多樣性極顯著升高；且微生物群落組成表明，噴施茉莉酸甲酯后煙草葉片的高氏白粉菌屬顯著降低，可降低煙草白粉病的發(fā)病情況。同時，噴施茉莉酸甲酯主要是影響煙草葉際的真菌群落組成，在減少高氏白粉菌屬的同時，增加了另外2種有害真菌屬，可能是由于植物葉際對微生物生長的可用資源有限[21,22]，所以在降低白粉菌屬后其他劣勢菌屬得以生長，且可能茉莉酸甲酯對鏈格孢屬和鐮刀菌屬無抑制作用。主成分分析也表明茉莉酸甲酯對真菌群落的組成影響較大，對細菌群落組成影響極小，細菌群落相對穩(wěn)定。葉際優(yōu)勢菌屬與抗氧化酶活性相關(guān)性分析表明，高氏白粉菌屬與超氧化物歧化酶活性和過氧化氫積累呈顯著負相關(guān)關(guān)系，青枯菌與超氧化物歧化酶活性呈顯著正相關(guān)系，但抗氧化酶活性與微生物群落之間的相互影響機制尚不清楚，亟待進一步研究。

茉莉酸甲酯可以提高植物抗氧化酶活性，誘導植物防御啟動；減少植物葉際的有害微生物，促進植物的生長發(fā)育。未來的研究還可以將茉莉酸甲酯作為一種重要的植物抗病誘導劑，誘導不同植物對細菌、真菌、卵菌和病毒等其他植物病原體，對其誘導的潛在作用和相關(guān)機制進行深入探究。這種研究將有助于我們理解誘導植物抗病性的機制及其在農(nóng)業(yè)中的應用，以增強植物抵抗各種病原體的感染。