吳方喜，羅翠琴，王穎姮，謝云杰，羅 曦，朱永生，謝鴻光，蔣家煥，蔡秋華，謝華安，張建福

[1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建 福州 350019；2.閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水稻國(guó)家工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福州（國(guó)家）水稻改良分中心/雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南研究基地/福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/福建省作物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室/福建省水稻分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003]

0 引言

【研究意義】水稻是我國(guó)最主要的糧食作物之一，三分之二以上的人口以稻米為主糧。2019年，我國(guó)大米總消費(fèi)量達(dá)到1.93億t，其中食用大米消費(fèi)量是1.588 0億t[1]，占三大食用糧大米、小麥和玉米總消費(fèi)的59.4%。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，人民對(duì)稻米的品質(zhì)要求越來越高。稻米不僅僅要求要好吃，還要有香味。因此，為了滿足優(yōu)質(zhì)稻米市場(chǎng)的需求，選育高檔優(yōu)質(zhì)香稻是水稻新品種選育的一個(gè)重要方向?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2010年以前，在生產(chǎn)上應(yīng)用面積較大的優(yōu)質(zhì)常規(guī)秈稻主要有廣東系列優(yōu)質(zhì)稻和湖南系列優(yōu)質(zhì)稻。廣東系列優(yōu)質(zhì)稻如粵晶絲苗2號(hào)[2]等品種米質(zhì)好、抗稻瘟病，但是粒型不夠細(xì)長(zhǎng)，多數(shù)不具有香味或香味比較淡。湖南系列優(yōu)質(zhì)稻如玉針香[3]、湘晚秈17號(hào)[4]等品種具有優(yōu)質(zhì)和香味，但是，這些品種的稻瘟病抗性不好，不適合在福建種植。近年來，科研人員利用分子標(biāo)記等技術(shù)選育了抗病兼具香味的水稻新品種[5-6]，但未見新品種耐儲(chǔ)性的研究。【本研究切入點(diǎn)】迄今鮮見涉及優(yōu)質(zhì)、抗病、耐儲(chǔ)兼具香味的常規(guī)稻新品種選育研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本團(tuán)隊(duì)于2010年確立了選育優(yōu)質(zhì)、抗稻瘟病、耐儲(chǔ)藏香稻作為水稻育種的一個(gè)方向。在親本材料選擇上，選用來源于廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的常規(guī)稻粵晶絲苗2號(hào)作為母本，它具有株葉形態(tài)好、高抗稻瘟病、口感好、較耐儲(chǔ)藏的優(yōu)點(diǎn)，但是粒型不夠細(xì)長(zhǎng)，香味比較淡；選用從湖南省水稻研究所引進(jìn)的中間材料H603作為父本，它具有粒形長(zhǎng)、有香味、米質(zhì)優(yōu)良的優(yōu)點(diǎn)，但不抗稻瘟病、不耐儲(chǔ)藏。期望通過雜交重組，綜合雙親的性狀，選育出粒形細(xì)長(zhǎng)、米質(zhì)優(yōu)良、抗稻瘟病、耐儲(chǔ)藏香稻新品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料粵晶絲苗2號(hào)來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，系優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻；H603來源于湖南省水稻研究所，系優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻。

1.2 福香占的選育

2011年春季在海南省三亞市福建省南繁育種基地用粵晶絲苗2號(hào)（廣東優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻）與H603（湖南優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻中間材料）雜交，后代通過系譜法選擇株葉形態(tài)好、粗稈大穗、成熟期葉片轉(zhuǎn)色好的單株，并在福建省沙縣等地進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，結(jié)合室內(nèi)耐儲(chǔ)藏和米質(zhì)鑒定，淘汰感病、不耐儲(chǔ)藏和米質(zhì)差的株系，對(duì)所獲得的優(yōu)良單株連續(xù)多年在福建省沙縣、龍巖和海南省三亞市反復(fù)加代。2015年晚季，編號(hào)為M08單珠表現(xiàn)株葉形態(tài)較好、粗稈大穗、成熟期葉片轉(zhuǎn)色好，定名為福香占（圖1）。

1.3 福香占香味基因擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]的引物進(jìn)行Badh2/badh2序列的擴(kuò)增。葉片DNA提取采用CTAB法，用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme）按照試劑說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳，切膠回收后送尚亞生物進(jìn)行測(cè)序，序列拼接和比對(duì)用DNAMAN軟件完成。

1.4 福香占稻瘟病抗性鑒定

將福香占和明恢63水稻種子播種于溫室大棚接種池中，培養(yǎng)至三葉一心備用。播種的同時(shí)將采自福建稻區(qū)的10個(gè)稻瘟病菌生理小種JL8053-2、JL1501-1、JY18058-1、 JY18028-4、 NH18046-2、 NH18048-3、SH17010-3、 SH18067-6、 SH17011-7、 SM17020-1 于26 ℃培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)6 d進(jìn)行活化，轉(zhuǎn)接至米糠培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)5 d；至菌絲長(zhǎng)滿2/3培養(yǎng)皿，將菌絲輕輕刮凈于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行產(chǎn)孢3～5 d。孢子含量調(diào)整至1.5×105個(gè)·mL-1，加入0.02%的TWEEN-20完成孢子懸浮液的制備。通過微型空氣壓縮機(jī)將孢子懸浮液均勻噴灑于葉片表面，7 d后按國(guó)際水稻研究所稻瘟病抗性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病級(jí)別，按全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗感評(píng)定。

1.5 福香占稻瘟病抗性基因分析

1.5.1 基因芯片檢測(cè) 提取福香占水稻葉片DNA，將DNA進(jìn)行質(zhì)量分析、稀釋、變性、全基因組擴(kuò)增、DNA片段化、純化、重懸，再一次變性后與芯片雜交，進(jìn)行單堿基延伸、染色，利用iScan掃描儀進(jìn)行芯片掃描，最后通過genome studio軟件對(duì)掃描生成的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷及分型。

1.5.2 福香占稻瘟病抗性基因擴(kuò)增 以NCBI中Pia、Pita基因?yàn)閰⒖夹蛄?，Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物，利用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme） 進(jìn)行擴(kuò)增，由于Pia和Pita基因編碼區(qū)無法整段序列擴(kuò)增，所以分成兩段擴(kuò)增[8-9]。測(cè)序結(jié)果通過DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)。擴(kuò)增體系及程序見表1～2。

表1 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of primers for PCR amplification

1.6 福香占耐儲(chǔ)藏特性分析

2018年，收獲福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所沙縣夏茂基地種植的福香占、航2號(hào)和?；? 185種子，風(fēng)干后，在40 ℃烘箱干燥2 d以平衡水分和破除休眠。各數(shù)100粒飽滿種子放在小網(wǎng)袋中，掛在恒溫恒濕箱（Binder，德國(guó)）中人工加速老化處理，處理?xiàng)l件為溫度：40 ℃，濕度：80%。在0、7、14、21 、28、35、42 d等7個(gè)時(shí)間段，每天上午9：00，分別取樣進(jìn)行發(fā)芽率測(cè)定。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣后立即將種子放置于2層濾紙培養(yǎng)皿，清水培養(yǎng)，溫度為28 ℃，相對(duì)濕度70%，光照黑暗交替14 h/10 h培養(yǎng)室中培養(yǎng)。設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。10 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤（SD），顯著性分析使用軟件DPS，作圖使用SigmaPlot 10.0。

表2 PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件Table 2 PCR amplification system and reaction conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 福香占的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量表現(xiàn)

2.1.1 福香占的主要農(nóng)藝性狀 福香占主要農(nóng)藝性狀兩年區(qū)試平均表現(xiàn)：群體整齊，株型適中，熟期轉(zhuǎn)色好、每畝有效穗數(shù)14.8萬，株高116.3 cm，穗長(zhǎng)25.1 cm，每穗總粒數(shù)196.0粒，結(jié)實(shí)率81.9%，千粒重25.1 g。

2.1.2 福香占區(qū)試產(chǎn)量表現(xiàn) 2018年初試，平均產(chǎn)量7 897.5 kg·hm-2，比對(duì)照II優(yōu)3301減產(chǎn)13.9%，達(dá)極顯著水平；2019年續(xù)試，平均產(chǎn)量7 662.0 kg·hm-2，比對(duì)照II優(yōu)3301減產(chǎn)19.2%，達(dá)極顯著水平。兩年區(qū)試平均產(chǎn)量7 780.5 kg·hm-2，比對(duì)照II優(yōu)3301減產(chǎn)16.5%（表3）。2019年生產(chǎn)試驗(yàn)平均產(chǎn)量7 209.0 kg·hm-2，比對(duì)照II優(yōu)3301減產(chǎn)7.4 %（表4）。

表3 2018-2019年福香占區(qū)域試驗(yàn)產(chǎn)量Table 3 Yield of Fuxiangzhan at 2018-2019 regional trials in Fujian

表4 2019年福香占生產(chǎn)試驗(yàn)產(chǎn)量Table 4 Yield of Fuxiangzhan at 2019 production trial in Fujian

2.2 福香占的稻米品質(zhì)

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)試驗(yàn)中心報(bào)告，糙米率79.9%，整精米率59.8%，堊白度0.1%，透明度1級(jí)，堿消值7.0級(jí)，膠稠度72 mm，直鏈淀粉含量15.6%，米質(zhì)達(dá)部頒二等優(yōu)質(zhì)食用稻品種品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。福香占分別于2018、2019年在福建省優(yōu)質(zhì)稻食味品質(zhì)鑒評(píng)中獲銀獎(jiǎng)、金獎(jiǎng)。2020年參加第三屆全國(guó)優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)鑒評(píng)獲得金獎(jiǎng)。

2.3 福香占的香味基因分析

Badh2基因有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子（圖2），起始密碼子位于外顯子1，終止密碼子位于外顯子15。從福香占中擴(kuò)增Badh2/badh2基因序列，將獲得的序列進(jìn)行拼接，進(jìn)而與數(shù)據(jù)庫(kù)中日本晴（Nipponbare）中該基因序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明，福香占在第七外顯子處有8 bp堿基缺失（5＇-GATTATGGC）和3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）（圖2）。與香稻蘇玉糯、Basmati385、Basmati370等品種突變位點(diǎn)一致，為badh2-E7位點(diǎn)突變[5]。

2.4 福香占的稻瘟病抗性基因分析

2.4.1 福香占的田間稻瘟病抗性表現(xiàn) 2018年福香占參加福建省中稻區(qū)試，稻瘟病田間抗性鑒定表現(xiàn)抗葉稻瘟（R）和抗穗頸瘟（R），苗期室內(nèi)人工接菌（采自福建省不同稻瘟病區(qū)的菌株3～4種混合）鑒定表現(xiàn)抗稻瘟?。≧）。2019年福香占繼續(xù)參加福建省中稻續(xù)試，田間鑒定表現(xiàn)抗葉稻瘟（R）和中抗穗頸瘟（MR），苗期室內(nèi)人工接菌（采自福建省不同稻瘟病區(qū)的菌株3～4種混合）鑒定表現(xiàn)為抗稻瘟?。≧）；福香占兩年稻瘟病抗性鑒定綜合評(píng)價(jià)為中抗稻瘟?。≧）（表5）。

表5 福香占對(duì)稻瘟病的抗性鑒定結(jié)果Table 5 Certified blast-resistance of Fuxiangzhan

2.4.2 福香占室內(nèi)稻瘟病抗性鑒定 采用噴霧接種稻瘟病菌的方法，分別對(duì)福香占和對(duì)照明恢63接種10個(gè)采自福建省不同地區(qū)的稻瘟病菌生理小種。鑒定結(jié)果表明，福香占對(duì)其中8個(gè)菌株表現(xiàn)為抗病，對(duì)2個(gè)菌株表現(xiàn)為中抗；明恢63對(duì)其中的1個(gè)菌株表現(xiàn)為中抗，對(duì)其余9個(gè)菌株均表現(xiàn)為感病（圖3、表6）。

表6 福香占和明恢63的抗性鑒定Table 6 Blast-resistance of Fuxiangzhan and Minghui 63

2.4.3 福香占稻瘟病抗性基因分析 結(jié)合GSR40K水稻高密度全基因組SNP芯片對(duì)福香占中可能的稻瘟病抗性功能基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明福香占中可能含Pia、Pi2、Pita和Pib等4個(gè)已克隆的稻瘟病抗性基因。以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Pia、Pi2、Pita、Pib的基因序列作為參考序列，根據(jù)同源克隆的方法分別擴(kuò)增福香占中Pia、Pi2、Pita和Pib這4個(gè)R基因的編碼區(qū)。測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果表明福香占中的Pi2和Pib編碼區(qū)和響應(yīng)的氨基酸序列與NCBI中的參考序列相同；而福香占中的Pita和Pia編碼區(qū)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列各有4個(gè)堿基的差異，分別造成了3個(gè)和4個(gè)氨基酸的差異，分別命名為PitaFXZ和PiaFXZ（圖4）。

2.5 福香占的耐儲(chǔ)藏特性分析

收獲后的福香占、航2號(hào)、?；?185種子風(fēng)干后置于42 ℃烘箱干燥2 d以平衡水分和破除休眠，室溫下自然老化（CK）和人工老化（溫度40 ℃，濕度80%）不同階段進(jìn)行發(fā)芽率比較（圖5A）。3個(gè)品種起始發(fā)芽率一致，3個(gè)品種自然老化0～42 d發(fā)芽率差異不顯著（P＜0.05）。人工老化7 d和14 d，3個(gè)品種發(fā)芽率無顯著變化（圖5B-C），至21 d，人工老化處理的3個(gè)品種分別發(fā)生不同程度的發(fā)芽率下降，航2號(hào)下降最多，發(fā)芽率為77.83%，?；?185發(fā)芽率最高為88.94%，福香占居中，發(fā)芽率為83.00%；至28 d，航2號(hào)和?；?185發(fā)芽率下降到分別為57.00和56.67%，福香占發(fā)芽率為77.67%；至35 d，航2號(hào)發(fā)芽率僅有18.00%，?；?185發(fā)芽率35.56%，福香占為74.33%；至42 d，航2號(hào)已經(jīng)基本不發(fā)芽（3.67%），?；?185發(fā)芽率僅12.33%，而福香占發(fā)芽率仍然高達(dá)61.67%（圖5B-C）。上述結(jié)果表明，在人工老化后第28天開始，對(duì)照航2號(hào)和福恢7185種子活力急劇下降，而福香占仍然具有較強(qiáng)的種子活力，耐儲(chǔ)藏性較好。

3 討論

3.1 福香占的優(yōu)質(zhì)性

隨著人民生活水平的提高，人民不僅要求吃飽，還要求吃好，長(zhǎng)粒香型高檔優(yōu)質(zhì)米更受歡迎。根據(jù)此目標(biāo)，我們選擇了無香味、小粒型、綜合性狀好的粵晶絲苗2號(hào)和有香味、長(zhǎng)粒型高檔優(yōu)質(zhì)稻中間材料H603作為雙親，期望選育出長(zhǎng)粒香型高檔優(yōu)質(zhì)稻?；浘Ыz苗2號(hào)是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所于2006年育成的優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻，并通過廣東省品種審定委員會(huì)審定[7]。該品種在廣東早季米質(zhì)達(dá)國(guó)標(biāo)和省標(biāo)優(yōu)質(zhì)2級(jí)，整精米率63.6%，堊白粒率4%，堊白度0.2%，長(zhǎng)寬比3.4，千粒重21.2 g，直鏈淀粉16.1%，膠稠度74.2 mm。來自湖南的H603粒形長(zhǎng)且千粒重大，有香味，米質(zhì)優(yōu)良。通過雜交選育的福香占綜合了雙親的優(yōu)質(zhì)性。福香占米質(zhì)化驗(yàn)結(jié)果：整精米率59.8%，堊白度0.1%，透明度1級(jí)，堿消值7.0級(jí)，膠稠度72 mm，直鏈淀粉含量15.6%。福香占粒長(zhǎng)達(dá)到7.4 mm，長(zhǎng)寬比3.8，屬于細(xì)長(zhǎng)粒型。福香占千粒重25.1 g，比粵晶絲苗2號(hào)大18.4%。該品種分別于2018、2019年在福建省優(yōu)質(zhì)稻活動(dòng)中獲得銀獎(jiǎng)、金獎(jiǎng)，于2020年獲得第三屆全國(guó)優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)鑒評(píng)秈稻組金獎(jiǎng)。因此，福香占在優(yōu)質(zhì)方面達(dá)到了選育出長(zhǎng)粒香型高檔優(yōu)質(zhì)稻的預(yù)期目標(biāo)。

3.2 福香占的抗稻瘟病性

福香占對(duì)稻瘟病的抗性主要來源于粵晶絲苗2號(hào)?；浘Ыz苗2號(hào)在2004-2005年廣東區(qū)域中表現(xiàn)高抗稻瘟病，中B、中C群和總抗性頻率分別為97.37%、94.12%、96.43%，病圃鑒定穗瘟1級(jí)，葉瘟1級(jí)。何秀英對(duì)粵晶絲苗2號(hào)的研究表明，粵晶絲苗2號(hào)除了含有位于2、6和12號(hào)染色體上的Pib、Pi2/Pi9和Pita/Pita-2的3個(gè)已知抗病基因，還有位于8號(hào)染色體的新隱性抗病基因pi55（t）[10]。福香占在兩年福建省區(qū)試中表現(xiàn)高抗葉瘟和中抗穗瘟；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所在苗期室內(nèi)接種表明，對(duì)10個(gè)采自福建省不同地區(qū)的稻瘟病菌生理小種中8個(gè)具有抗性，抗譜率達(dá)到80%。通過基因芯片分析表明，福香占中可能含Pia、Pi2、Pita和Pib等4個(gè)已克隆的稻瘟病抗性基因。測(cè)序結(jié)果表明，Pi2和Pib基因與NCBI中的參考序列完全相同；而Pita和Pia在編碼區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列各有4個(gè)堿基的差異，分別造成了3個(gè)和4個(gè)氨基酸的差異，分別命名為PitaFXZ和PiaFXZ。因此，福香占遺傳了粵晶絲苗2號(hào)的稻瘟病抗性。

3.3 福香占的耐儲(chǔ)藏性

福香占的耐儲(chǔ)藏性主要來源于粵晶絲苗2號(hào)。在選育福香占之前，通過耐儲(chǔ)藏性鑒定發(fā)現(xiàn)，粵晶絲苗2號(hào)在人工老化35 d的發(fā)芽率仍在50%以上，耐儲(chǔ)藏性比較好。我們?cè)诨浘Ыz苗2號(hào)和H603雜交后，通過對(duì)后代的每一代進(jìn)行耐儲(chǔ)藏鑒定，每世代淘汰不耐儲(chǔ)藏的材料。因此，選育的福香占耐儲(chǔ)藏性比較強(qiáng)。通過人工老化試驗(yàn)表明，福香占在人工老化35 d的條件下，發(fā)芽率為74.33%；在人工老化42 d的條件下，福香占發(fā)芽率仍然高達(dá)61.67%。

4 結(jié)論

福香占在2018-2019年福建省中稻區(qū)試、續(xù)試和生產(chǎn)試驗(yàn)表現(xiàn)較好，福香占米質(zhì)達(dá)部頒二等優(yōu)質(zhì)食用稻品種品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，中抗稻瘟病，較耐儲(chǔ)藏，具有香味，屬于高檔香型優(yōu)質(zhì)稻，適宜在福建作中稻種植。