唐 樂(lè)， 李 宏， 何麗麗， 牛海文， 羅 琴

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)肺癌的死亡率較以往30年增加了約464.84%[1]。盡管在肺癌研究及診療方面取得了許多進(jìn)展，但仍有較多患者確診時(shí)已處于臨床終末期。大約80%～85%肺癌患者的病理類型為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究NSCLC能明顯改善肺癌患者群體臨床預(yù)后。microRNA(miRNA)是一類能與目標(biāo)基因靶點(diǎn)序列相互結(jié)合，作用類似于siRNA的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，其可抑制目標(biāo)靶基因的表達(dá)[3]。miRNA由高等真核生物基因組編碼，可靶向約60%的基因組基因。研究miRNA對(duì)NSCLC有重要臨床意義[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-19b-3p與包括NSCLC在內(nèi)的多種癌癥相關(guān)，可通過(guò)多種信號(hào)途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用，但其在惡性腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)及作用不一，分子機(jī)制存在爭(zhēng)議[5-6]。

競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，是一種能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RNA的作用元件。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA并且充當(dāng)ceRNA調(diào)控mRNA的表達(dá)[7]。轉(zhuǎn)移相關(guān)性肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是NSCLC中研究最為廣泛的一種癌類lncRNA，其在包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高[8]。例如，MALAT1在缺氧條件下表達(dá)增高并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、分化及血管形成，此效應(yīng)主要由缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介導(dǎo)[9]。最近有研究表明，缺氧誘導(dǎo)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-19b-3p和HIF-1α之間存在靶向關(guān)系，MALAT1可海綿吸附miR-19b-3p，且使HIF-1α呈缺氧時(shí)間依賴性升高[10]。本課題組對(duì)比NSCLC癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，MALAT1在患者癌組織中高表達(dá)，而miR-19b-3p低表達(dá)。然而目前在對(duì)NSCLC的研究中，尚未明確MALAT1/miR-19b-3p/HIF-1α三者之間是否存在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文旨在研究MALAT1是否與miR-19b-3p之間存在海綿吸附作用并調(diào)控HIF-1α/VEGF分子軸參與NSCLC發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及材料

選取2019年1月～2019年12月期間新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科收治的經(jīng)手術(shù)病理確診為NSCLC的肺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本各15例。其中男性9例、女性6例，年齡55～73歲，平均年齡(63.27±5.65)歲；鱗癌4例、腺癌11例；臨床分期Ⅰ期2例、Ⅱ期4例、Ⅲ期7例、Ⅳ期2例(以上臨床標(biāo)本使用均獲知情同意)。人正常支氣管上皮細(xì)胞系16HBE及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549細(xì)胞來(lái)源于普諾賽生物公司；MALAT1、HIF-1α、VEGF引物，miR-19b-3p模擬物(mimic)及其陰性對(duì)照(NC mimic)，MALAT1 siRNA(si-MALAT1)以及陰性對(duì)照(si-NC)由吉瑪基因公司構(gòu)建；Anti-HIF-1α抗體由Abcam公司提供，Anti-VEGF抗體由博奧森公司提供，二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)和山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)購(gòu)自Abcam公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒由全式金生物公司、Transwell小室由Corning公司、凋亡試劑盒由BD公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在完全F-12K培養(yǎng)液，37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)miR-19b-3p mimic組、NC mimic組、si-MALAT1組、si-NC組、空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol從組織或細(xì)胞中提取總RNA，用5X All-In-One RT MasterMix進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，用miRNA熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板在熒光定量PCR儀(ABI 7500 FAST)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。MALAT1、HIF-1α、及VEGF使用GAPDH為內(nèi)參，miR-19b-3p使用U6為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列表Table 1 List of primer sequences

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

按1.2項(xiàng)轉(zhuǎn)染分組，按Western blot法將細(xì)胞提取的總蛋白凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。一抗兔抗HIF-1α抗體、兔抗VEGF抗體孵育過(guò)夜，二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)室溫孵育1 h，ELC化學(xué)發(fā)光顯影。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

按1.2項(xiàng)轉(zhuǎn)染分組后，按CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞的增殖，各組重復(fù)5孔。每孔加入100 μL 10% CCK-8試劑，1 h后用Bio-Rad xMarkTM酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

按1.2項(xiàng)轉(zhuǎn)染分組后，重懸細(xì)胞過(guò)200目篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液。4℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光及光散射(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm)。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按1.2項(xiàng)轉(zhuǎn)染分組后，吸出細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液及2次PBS洗滌液至離心管內(nèi)(內(nèi)含凋亡或壞死細(xì)胞)，胰酶消化、離心、重懸、過(guò)篩，制備單細(xì)胞懸液。加入5 μL Annexin Ⅴ-PE試劑和10 μL 7-AAD試劑，在4℃條件下使處理后的單細(xì)胞懸液避光10 min。采用LSRFortessa流式細(xì)胞儀在30 min內(nèi)盡快檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率。

1.8 細(xì)胞遷移及侵襲檢測(cè)

按1.2項(xiàng)轉(zhuǎn)染分組后，重懸并調(diào)整細(xì)胞懸液至5×105mL；將基質(zhì)膠包埋在Transwell小室底部中央；取100 μL細(xì)胞懸液接種至無(wú)基質(zhì)膠的Transwell小室(遷移實(shí)驗(yàn))及含有基質(zhì)膠的Transwell小室(侵襲實(shí)驗(yàn))中；在下室加入600 μL完全培養(yǎng)液，各組3個(gè)重復(fù)孔，48 h后棄小室內(nèi)上清并拭去小室上層內(nèi)的細(xì)胞及基質(zhì)膠，甲醛固定小室下層穿膜細(xì)胞，用Giemsa染液染色，取3個(gè)顯微鏡隨機(jī)視野計(jì)數(shù)遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息網(wǎng)站靶向預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)

利用生物信息學(xué)在線網(wǎng)站lncRNASNP2(http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP/)及targetscan(https：//www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)了miR-19b-3p與MALAT1及HIF-1α之間均有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。如圖1。

圖1 miR-19b-3p與MALAT1、HIF-1α靶向結(jié)合預(yù)測(cè)位點(diǎn)Fig.1 Predicted targeted binding sites between MALAT1，HIF-1α and miR-19b-3p

2.2 MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC癌組織及癌旁組織中的差異表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MALAT1在15例NSCLC癌組織中平均相對(duì)表達(dá)量為(2.649±0.724)，對(duì)應(yīng)鄰近癌旁組織中平均相對(duì)表達(dá)量為(1.006±0.484)(P<0.05，圖2A)。miR-19b-3p在15例NSCLC癌組織中平均相對(duì)表達(dá)量為(0.400±0.113)，而在鄰近癌旁組織中平均相對(duì)表達(dá)量為(1.028±0.164)(P<0.05，圖2B)。Pearson相關(guān)性分析顯示MALAT1與miR-19b-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，r=-0.8969(P<0.01，圖2C)。

A：MALAT1的相對(duì)表達(dá)量；B：miR-19b-3p的相對(duì)表達(dá)量；C：MALAT1和miR-19b-3p的相關(guān)性分析圖2 MALAT1和miR-19b-3p在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression levels of MALAT1 and miR-19b-3p in NSCLC tissue and paracancerous tissue

2.3 MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC細(xì)胞系及正常支氣管上皮細(xì)胞系中的差異表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與人正常支氣管上皮細(xì)胞系16HBE相比，MALAT1在人NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549中相對(duì)表達(dá)增加，其中A549平均相對(duì)表達(dá)量較高為(6.815±1.031)(P<0.05，圖3A)，而miR-19b-3p在人NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549中相對(duì)表達(dá)減少，其中A549平均相對(duì)表達(dá)量較低為(0.359±0.076)(P<0.05，圖3B)。綜上，MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中表達(dá)差異顯著。

A：MALAT1的相對(duì)表達(dá)量；B：miR-19b-3p的相對(duì)表達(dá)量；與16HBE細(xì)胞比較，*P<0.05圖3 MALAT1和miR-19b-3p在NSCLC細(xì)胞系及16HBE細(xì)胞系內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression levels of MALAT1 and miR-19b-3p in NSCLC and 16HBE cell lines

2.4 過(guò)表達(dá)miR-19b-3p及敲除MALAT1對(duì)A549細(xì)胞中miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，NC mimic組、si-NC組與Control組之間miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因的RNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-19b-3p mimic組細(xì)胞中miR-19b-3p表達(dá)升高，表明轉(zhuǎn)染有效，同時(shí)轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞內(nèi)MALAT1、HIF-1α、VEGF的RNA水平顯著下降(均P<0.05)。si-MALAT1組細(xì)胞中MALAT1表達(dá)降低，同時(shí)轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中的miR-19b-3p水平顯著上升，HIF-1α、VEGF基因的RNA水平均顯著下降(均P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，NC mimic組、si-NC組與Control組之間HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而miR-19b-3p mimic組、si-MALAT1組相對(duì)于其他對(duì)照組中HIF-1α、VEGF水平均顯著下降(均P<0.05)。見(jiàn)圖4。

1：Control；2：NC mimic；3；miR-19b-3p mimic；4；si-NC；5：si-MALAT1；A：轉(zhuǎn)染后miR-19b-3p的RNA相對(duì)表達(dá)量；B：轉(zhuǎn)染后MALAT1的RNA相對(duì)表達(dá)量；C：轉(zhuǎn)染后HIF-1α的RNA相對(duì)表達(dá)量；D：轉(zhuǎn)染后VEGF的RNA相對(duì)表達(dá)量；E：轉(zhuǎn)染后HIF-1α的蛋白相對(duì)表達(dá)量；F：轉(zhuǎn)染后VEGF的蛋白相對(duì)表達(dá)量；G：HIF-1α、VEGF的Western blot圖；*P<0.05圖4 轉(zhuǎn)染miR-19b-3p mimic及si-MALAT1對(duì)A549細(xì)胞miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of transfection of miR-19b-3p mimic and si-MALAT1 on the relative expression levels of miR-19b-3p，MALAT1，HIF-1α and VEGF gene in A549 cells

2.5 過(guò)表達(dá)miR-19b-3p后A549細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、遷移侵襲、凋亡水平變化

如圖5所示，轉(zhuǎn)染miR-19b-3p mimic后，NC mimic組與Control組之間增殖水平、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞遷移侵襲水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而miR-19b-3p mimic組中，轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞的增殖活性下降；G2/M期細(xì)胞比例下降及G0/G1期細(xì)胞比例有所上升；細(xì)胞凋亡率增加；細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)水平明顯下降(均P<0.05)。

1：Control；2：NC mimic；3；miR-19b-3p mimic；A：轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響；B：轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期的影響；C：轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；D：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)變化柱狀圖；E：細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)鏡下圖(標(biāo)尺=50 μm)；*P<0.05圖5 過(guò)表達(dá)miR-19b-3p后A549細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移、侵襲水平變化Fig.5 Changes in A549 cells proliferation，cell cycle，apoptosis，migration and invasion after overexpression of miR-19b-3p

3 討論

MALAT1最早發(fā)現(xiàn)于對(duì)NSCLC的研究，在其細(xì)胞及組織中高度表達(dá)，被視為NSCLC預(yù)后標(biāo)志物[11]?，F(xiàn)有研究證實(shí)MALAT1與肺、乳腺、結(jié)腸、膀胱、肝臟和胰腺等多種實(shí)體惡性腫瘤顯著相關(guān)，被認(rèn)為是促癌類的lncRNA[12-13]。既往有研究發(fā)現(xiàn)MALAT1與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)通路似乎密切相關(guān)[14-15]。然而MALAT1參與NSCLC的具體分子機(jī)制卻不明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是不具備編碼蛋白質(zhì)功能的長(zhǎng)核糖核苷酸鏈(>200 nt)RNA，但其通過(guò)不同機(jī)制對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物活動(dòng)起到多重調(diào)節(jié)作用[16]。lncRNA的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一是充當(dāng)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA(ceRNA)通過(guò)海綿吸附miRNA來(lái)調(diào)節(jié)后者生物學(xué)功能[17]。在一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)[18]，MALAT1可以被HIF-1α和HIF-2α轉(zhuǎn)錄激活，并與miR-3064-5p相互靶向結(jié)合促進(jìn)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移。在另外一項(xiàng)缺氧處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞研究中，敲低MALAT1可提高細(xì)胞中miR-19b-3p水平，并抑制HIF-1α的表達(dá)以及細(xì)胞的凋亡、自噬和炎癥反應(yīng)，HIF-1α的過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)MALAT1敲低的影響[10]，這與本研究結(jié)果一致。本研究在NSCLC患者外周血高通量測(cè)序及NSCLC患者癌組織及NSCLC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)MALAT1表達(dá)量升高，而miR-19b-3p表達(dá)量顯著減少；生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)MALAT1與miR-19b-3p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，以上提示MALAT1或許充當(dāng)miR-19b-3p的ceRNA影響后者的生物學(xué)效應(yīng)；本研究通過(guò)在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-19b-3p及敲除MALAT1亦驗(yàn)證了此海綿機(jī)制的可能性。同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-19b-3p mimic后的A549細(xì)胞內(nèi)MALAT1、HIF1α、VEGF下調(diào)顯著，并且A549細(xì)胞的增殖能力、分裂能力、遷移及侵襲能力均有所下降，凋亡率增加。本研究結(jié)果提示MALAT1可通過(guò)海綿吸附miR-19b-3p，調(diào)節(jié)下游HIF-1α/VEGF分子軸來(lái)影響NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能。

miRNA調(diào)節(jié)內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，與真核細(xì)胞分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA作為腫瘤抑制因子或癌基因在NSCLC中異常表達(dá)[19]。miR-19b-3p是從miR-19b前體的3′端臂加工而成，其表達(dá)異常參與多種疾病病理生理過(guò)程。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p可靶向PTEN抑制人髓核細(xì)胞凋亡緩解椎間盤(pán)的退行性變。Su等[21]通過(guò)RNA測(cè)序篩選和qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p可作為急性心力衰竭的新型預(yù)后生物標(biāo)志物。另外，miR-19b-3p表達(dá)異常參與多種惡性腫瘤疾病，例如食管癌[22]、胃癌、肺癌[23]、乳腺癌和淋巴瘤[24]等。在一項(xiàng)乳腺癌的研究中，miR-19b-3p通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并可逆轉(zhuǎn)塞卡替尼耐藥性[6]。Zhang等[25]采用高通量miR測(cè)序方法和qRT-PCR證實(shí)miR-19b-3p在3種胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。Wei等[5]發(fā)現(xiàn)，miR-19b-3p負(fù)調(diào)節(jié)NRP1抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，過(guò)表達(dá)NRP1可逆轉(zhuǎn)miR-19b-3p的負(fù)向調(diào)控作用。本研究生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，miR-19b-3p可通過(guò)靶向HIF-1α其3′-UTR下調(diào)HIF-1α的表達(dá)；細(xì)胞功能研究表明，miR-19b-3p通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)HIF-1α、VEGF抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、遷移和侵襲并促進(jìn)凋亡。然而在一項(xiàng)既往肺腺癌細(xì)胞的研究中[26]，miR-19b-3p靶向GNG7在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)升高，促進(jìn)了肺腺癌的進(jìn)展。這項(xiàng)研究與本研究結(jié)果不完全一致，miR-19b-3p在NSCLC中是否具有雙重作用，是否存在臨床組織樣本及細(xì)胞異質(zhì)性，其具體機(jī)制仍需要更多的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p在NSCLC中表達(dá)下調(diào)，MALAT1作為ceRNA，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-19b-3p表達(dá)，從而促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)HIF-1α/VEGF分子軸表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-19b-3p可抑制A549細(xì)胞增殖、分裂、遷移、侵襲能力，促進(jìn)凋亡。因病例組織標(biāo)本數(shù)量相對(duì)較少，體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞種類單一，本研究仍存在不足。因此，對(duì)miR-19b-3p參與NSCLC疾病的具體分子機(jī)制尚需未來(lái)進(jìn)一步研究。