曹 鑫， 張雅楠， 毛侃敏， 楊 淼， 郝麗萍

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，食品營養(yǎng)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030

汞是一種典型的重金屬食品污染物，2017年《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品中污染物限量》(GB2762-2017)規(guī)定了汞的限量指標(biāo)[1]。據(jù)美國毒物管理委員會(Agency for Toxic Substance and Disease Registry Agency，ATSDR)報(bào)道，汞是僅次于砷和鉛的第3大危險(xiǎn)重金屬[2]。汞有3種不同的化學(xué)形式，分別是元素汞、有機(jī)汞(主要是甲基汞)、無機(jī)汞(主要是氯化汞)[3]，汞可通過呼吸道、消化道和皮膚接觸的方式被機(jī)體攝入導(dǎo)致毒性反應(yīng)[4]。

造成環(huán)境污染的汞的來源主要分為自然排放與人為排放2種，自然排放包括火山活動、土壤釋放、自然風(fēng)化等；人為排放是造成汞污染的主要原因，包括對于汞的使用、物質(zhì)中含有汞雜質(zhì)、廢物處理3大類。煤燃燒、廢物焚化、金屬冶煉、氯堿生產(chǎn)等是目前主要的人為排放類別[5]。無機(jī)汞是毒性最強(qiáng)的汞的化合物形式之一，在一些國家，暴露于過多無機(jī)汞制劑是人體汞中毒的重要原因。無機(jī)汞長期以來被用于藥物、殺菌肥皂和護(hù)膚霜。有些護(hù)膚霜含有高達(dá)6%～10%的氯化汞或氯化亞汞，此外無機(jī)汞也被用于牙粉、蠕蟲藥和止疼藥中[6]。研究顯示，氯化汞由胃腸道吸收進(jìn)入人體可造成腎毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性和血液毒性等[7-10]。

肝臟是主要的代謝與解毒器官。研究顯示，肝臟是汞蓄積的主要場所，汞在肝臟中過量蓄積會改變肝臟的結(jié)構(gòu)和功能[11]。二價(jià)汞離子可以結(jié)合一系列蛋白分子，如酶、谷胱甘肽、微管蛋白、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，這種結(jié)合抑制了這些蛋白分子的正常生理功能，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞發(fā)生炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡等損傷反應(yīng)[12-15]，但具體的毒性機(jī)制需要進(jìn)一步的研究探索。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，而關(guān)于汞造成肝毒性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道較少。對此，本研究基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag，TMT)定量蛋白組學(xué)技術(shù)對氯化汞染毒小鼠的肝臟組織進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并通過生物信息學(xué)方法分析差異表達(dá)蛋白的功能和涉及的分子通路，為氯化汞肝毒性機(jī)制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

氯化汞、氨水、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)、三乙基碳酸氫銨緩沖液(triethyl ammonium bicarbonate buffer，TEAB)購自Sigma公司；丙酮、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trypsin蛋白酶購自PROMEGA公司；蛋白酶抑制劑、蛋白定量BCA試劑盒、10%蛋白電泳預(yù)制膠、三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]溶液、乙腈、甲醇、甲酸、TMT 16Plex購自ThermoFisher Scientific公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒購自南京建成公司。Spectra Max plus384酶標(biāo)儀購自Molecular Devices公司；EPS-300數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自上海天能科技有限公司；Vanquish F高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 480串聯(lián)質(zhì)譜儀購自ThermoFisher Scientific公司；Tanon-3500R全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

6周齡雄性C57BL/6小鼠，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2020-0018；小鼠于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對濕度50%左右，12 h∶12 h晝夜交替。本動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批通過([2020]IACUC號：S2455)。

1.3 肝毒性小鼠模型建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組、低劑量組(1 mg/kg)、中低劑量組(4 mg/kg)、中高劑量組(8 mg/kg)和高劑量組(16 mg/kg)，每組各9只，氯化汞的染毒劑量基于參考文獻(xiàn)[16-17]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。各劑量組給予相應(yīng)劑量氯化汞溶液灌胃，對照組以等體積純水灌胃，灌胃體積為0.1 mL/10 g體重，連續(xù)灌胃28 d，每日1次。小鼠自由進(jìn)食、飲水，每隔3 d監(jiān)測體質(zhì)量變化。染毒28 d后，小鼠稱重并處死，采集血液與肝臟組織，用于后續(xù)檢測。

1.4 血清及肝臟組織生化指標(biāo)檢測

分離血清，采用賴氏法檢測小鼠血清ALT、AST活性；取適量肝臟用0.9%的生理鹽水按照1∶9的質(zhì)量體積比制作肝臟勻漿液，2500 r/min離心10 min，取上清液，用比色法、鉬酸銨法分別檢測肝臟GSH-Px活性、CAT活性，檢測步驟均按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.5 肝臟組織病理學(xué)檢查

以4%多聚甲醛溶液固定小鼠肝臟，經(jīng)石蠟包埋、切片、染色，在顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)、形態(tài)學(xué)變化。

1.6 肝臟蛋白提取及定量

肝臟解凍后于振蕩研磨管中加入適量蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，研磨儀充分研磨。4℃，16000×g離心30 min，取上清進(jìn)行BCA定量測定和SDS-PAGE電泳檢測。

1.7 蛋白酶解及TMT標(biāo)記

分別取對照組及高劑量組小鼠肝臟樣本100 μg，加入TEAB溶液，使TEAB終濃度為100 mmol/L；加入TCEP溶液，使TECP終濃度為100 mmol/L，37℃孵育60 min；加入IAM溶液，使IAM終濃度為40 mmol/L，室溫避光40 min；加入丙酮(丙酮∶樣本=6∶1)，-20℃沉淀4 h；10000×g離心20 min，留取沉淀；用100 μL 100 mmol/L TEAB溶液充分溶解；按照酶∶蛋白=1∶50加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜。取200 μL微離心管，加入5 mg乙腈、100 μg樣本與20 μL TMT 16Plex，室溫孵育2 h；加入5 μL 5%羥胺，室溫放置30 min；真空濃縮儀抽干。

1.8 蛋白鑒定和生物信息學(xué)分析

使用EASY-nLC 1200色譜儀進(jìn)行分離，流動相A：2%乙腈和0.1甲酸溶液，流動相B：80%乙腈和0.1%甲酸溶液。分離之后的樣本用Orbitrap Exploris 480串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，利用UniProt(Universal protein)數(shù)據(jù)庫與Proteome Discoverer 2.4軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。對鑒定的差異蛋白(differentially expressed proteins，DEPs)進(jìn)行GO富集分析、KEGG通路富集分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯化汞對小鼠生理指標(biāo)影響

2.1.1 氯化汞對小鼠體質(zhì)量影響 氯化汞染毒28 d，建立肝毒性小鼠模型，各組小鼠初始體質(zhì)量(第1天)無顯著性差異。隨著氯化汞染毒時(shí)間延長，中高劑量組和高劑量組分別于第13天和第7天較對照組體質(zhì)量明顯降低(均P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.1.2 氯化汞對小鼠肝功能和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響 氯化汞中高劑量組和高劑量組小鼠的血清ALT活性較對照組分別升高了24%和45%，而各組血清AST水平并未出現(xiàn)顯著性差異(圖1A、1B)。與對照組相比，氯化汞中高劑量組和高劑量組小鼠肝臟的GSH-Px活性分別降低14%和19%，CAT活性分別降低25%和27%(圖1C、1D，均P<0.05)。

1：Control；2：HgCl2(1 mg/kg)；3：HgCl2(4 mg/kg)；4：HgCl2(8 mg/kg)；5：HgCl2(16 mg/kg)；A：血清ALT活性；B：血清AST活性；C：肝臟GSH-Px活性；D：肝臟CAT活性；與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖1 氯化汞對小鼠肝功能和肝臟氧化應(yīng)激水平影響Fig.1 Effect of mercury chloride on liver function and hepatic oxidative stress levels of each

2.1.3 氯化汞對小鼠肝組織結(jié)構(gòu)影響 小鼠肝臟病理切片的HE染色結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，氯化汞低劑量組肝臟并無顯著的病理學(xué)變化，中低劑量組有輕微的肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象，中高劑量組和高劑量組則有明顯的脂肪變性及肝細(xì)胞壞死的表現(xiàn)。

圖2 各組小鼠肝臟病理學(xué)表現(xiàn)(蘇木精-伊紅染色，×400)Fig.2 Pathological features of mice liver sample in each group(HE staining，×400)

2.2 氯化汞對小鼠肝毒性影響的生物信息學(xué)分析

2.2.1 氯化汞染毒小鼠肝臟DEPs篩選 取對照組與氯化汞高劑量組小鼠肝臟進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，經(jīng)過搜庫鑒定和波峰分析，獲得同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)豐度，本研究以表達(dá)差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)和P值作為參考標(biāo)準(zhǔn)，以FC<0.83或FC>1.2，P<0.05為DEPs篩選標(biāo)準(zhǔn)。與對照組相比，高劑量組小鼠肝臟共篩選出195個DEPs，其中99個上調(diào)蛋白，96個下調(diào)蛋白。

2.2.2 DEPs的GO富集分析 將樣本總蛋白質(zhì)和篩選的DEPs以GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果如圖3所示。GO富集分析主要包括生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)，結(jié)果顯示DEPs參與的BP有糖代謝的負(fù)調(diào)控、天冬氨酸家族氨基酸代謝、行為節(jié)律以及細(xì)胞產(chǎn)熱等；CC方面，DEPs主要富集于免疫球蛋白復(fù)合物；涉及到的MF有激素-激素受體結(jié)合、跨膜受體-酪氨酸激酶結(jié)合、信息素-細(xì)胞膜受體結(jié)合等。參與糖代謝負(fù)調(diào)控的DEPs為主要尿蛋白(major urinary proteins，Mups)家族(Mup2、Mup7、Mup14、Mup17、Mup20、Mup21)、Fam3c(family with sequence similarity 3，member C)蛋白等。

圖3 DEPs GO富集分析結(jié)果(前20位)Fig.3 GO enrichment analysis of DEPs(Top 20)

2.2.3 DEPs的KEGG功能注釋和富集分析 DEPs的KEGG功能注釋及富集分析結(jié)果見圖4。與對照組相比，氯化汞高劑量組小鼠肝臟的DEPs集中在類固醇激素生成、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝、細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)介導(dǎo)的外源化合物代謝、視黃醇代謝、膽汁分泌、化學(xué)致癌作用等信號通路。在本研究中，篩選出多個參與CYP450介導(dǎo)的外源化合物代謝通路的DEPs，包括有CYP2e1、多種谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)亞型(GSTp1、GSTm1、GSTt3、mGST3)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)各亞型(UGT2A3、UGT1a5、UGT2b37)，磺基轉(zhuǎn)移酶5a4(sulfotransferase 5a4，SULT5a4)、羰基還原酶1(carbonyl reductase 1，CBR1)。另外參與AA代謝通路的DEPs有CYP450酶(CYP8b1、CYP2e1、CYP2u1、CYP4v2、CYP4a12a、CYP2c67、CYP7b1、CYP4a12b)以及羰基還原酶1(carbonyl reductase 1，CBR1)。

圖4 DEPs KEGG通路富集結(jié)果(前20位)Fig.4 KEGG pathway enrichment of DEPs(Top 20))

3 討論

本研究給予雄性小鼠氯化汞灌胃處理，結(jié)果顯示氯化汞染毒能夠顯著降低小鼠體重(P<0.05)；中高劑量組(8 mg/kg)與高劑量組(16 mg/kg)染毒明顯增加小鼠血清的ALT活性，而顯著降低小鼠肝臟抗氧化酶GSH-Px與CAT活性(均P<0.05)，且呈劑量依賴性；氯化汞染毒后小鼠肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性、細(xì)胞壞死等現(xiàn)象。本研究結(jié)果提示氯化汞染毒可能通過氧化應(yīng)激途徑導(dǎo)致小鼠的肝臟損傷，與已有研究結(jié)果一致[18-20]。

2003年新型、高效的TMT標(biāo)記技術(shù)被引入到蛋白組學(xué)領(lǐng)域，其特點(diǎn)是提高了檢測蛋白相對表達(dá)水平和蛋白翻譯后修飾的敏感性[21]。本研究通過TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)對小鼠氯化汞肝毒性進(jìn)行DEPs的篩選，共鑒定出195種DEPs，其中99個上調(diào)蛋白，96個下調(diào)蛋白。DEPs的GO功能富集分析顯示，參與糖代謝負(fù)調(diào)控的DEPs主要為表達(dá)水平上調(diào)的Mups蛋白，提示氯化汞染毒后可以增加Mups的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致小鼠肝臟的糖脂異常調(diào)控[22]。DEPs在細(xì)胞組分上富集在免疫球蛋白復(fù)合物，根據(jù)二價(jià)汞離子具有結(jié)合一系列蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，以及外源化合物在肝臟中經(jīng)過Ⅰ相代謝可形成毒性降低或升高的蛋白復(fù)合物，二價(jià)汞離子在代謝過程中有可能形成毒性較強(qiáng)的蛋白復(fù)合物，從而對肝臟造成損傷[23]。

Wang等[24]對無機(jī)汞暴露的清鳉魚進(jìn)行腦組織蛋白組學(xué)分析，結(jié)果顯示汞離子暴露可引起抗氧化物GST、過氧化物還原酶-1(peroxiredoxin-1，Prx-1)的表達(dá)升高。Lee等[25]用氯化汞染毒SD大鼠，腎臟蛋白組學(xué)結(jié)果顯示GST多種亞基的表達(dá)上調(diào)。GST可以催化GSH與氧化物結(jié)合，在細(xì)胞的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，本研究的肝臟蛋白組學(xué)中也檢測到GST蛋白的上調(diào)，以及GSH代謝通路的KEGG富集結(jié)果。有研究表明，在氫氧化物存在的情況下，GST還可以起到谷胱甘肽還原酶的作用，通過增加還原型谷胱甘肽含量以減少ROS引起的細(xì)胞損傷[26]。

對于DEPs的KEGG通路富集分析顯示，氯化汞染毒涉及到肝臟中CYP450介導(dǎo)的代謝通路，這與Biswas等[27]關(guān)于斑馬魚經(jīng)硫化汞暴露后的腦組織蛋白組學(xué)研究結(jié)果一致。CYP450酶是一種膜結(jié)合蛋白，在外源化合物代謝、細(xì)胞代謝方面具有重要作用，各種外源化合物或內(nèi)源性底物可以通過與膜受體結(jié)合誘導(dǎo)或者抑制CYP450酶[28]。Ⅰ相代謝酶將外源化合物轉(zhuǎn)化為具備極性基團(tuán)的中間體，由Ⅱ相代謝酶將中間體與內(nèi)源性結(jié)合劑(如谷胱甘肽)結(jié)合，形成活性降低、極性增加且易被排出的代謝物。CYP450酶在細(xì)胞中充當(dāng)Ⅰ相代謝酶的作用，保護(hù)細(xì)胞免受外源化合物的損害。然而CYP450介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致外源化合物代謝活化為毒性產(chǎn)物。在多種CYP450酶中，CYP2e1在肝毒素的代謝中具有重要作用，某些肝毒性物質(zhì)如對乙酰氨基酚、四氯化碳等可通過CYP2e1的激活，在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成具有毒性的中間代謝物[29]。和其他CYP450酶相比，CYP2e1表現(xiàn)出更高的氧化酶活性，是微粒體ROS的重要來源，研究顯示過表達(dá)CYP2e1的HepG2細(xì)胞ROS產(chǎn)生升高了40%～50%[30]。CYP2e1的誘導(dǎo)因素如二氯甲烷、1-硝基萘、二甲亞砜等能夠抑制CYP2e1的降解，從而使細(xì)胞內(nèi)CYP2e1水平較正常偏高[31]。本研究DEPs的KEGG富集分析結(jié)果顯示氯化汞的染毒影響到小鼠肝臟的CYP450代謝通路上的多種代謝酶，包含多種Ⅰ相代謝酶CYP450和Ⅱ相代謝酶GST、UGT等，表明氯化汞可通過引起小鼠肝臟CYP450介導(dǎo)的代謝通路上的部分代謝酶的表達(dá)量發(fā)生改變，提示氯化汞誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝臟毒性可能是由CYP450介導(dǎo)的外源化合物代謝通路紊亂導(dǎo)致。

AA作為一種多不飽和脂肪酸，主要以磷脂的形式在細(xì)胞膜上存在，在肝臟的正常生理過程中發(fā)揮重要作用。AA主要通過4種酶代謝：環(huán)氧合酶-1/2(cyclooxygenase-1/2，COX-1/2)、脂氧合酶(lipoxygenases，LOX)、CYP450酶、脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)。AA在經(jīng)過上述酶代謝后可形成大量具有生物活性的代謝產(chǎn)物，參與細(xì)胞的糖脂代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等病理過程[32-33]。KEGG富集分析顯示AA代謝通路上的DEPs主要是CYP450酶，均為上調(diào)蛋白，CYP450酶可以參與AA的非酶氧化過程，將AA轉(zhuǎn)化為為ω-1和ω-2羥基化代謝物，提示氯化汞染毒可以通過增強(qiáng)AA的CYP450酶代謝途徑，產(chǎn)生活性代謝物從而導(dǎo)致肝臟糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等毒性反應(yīng)[30]。

另外KEGG富集分析的結(jié)果顯示DEPs富集在視黃醇代謝通路，肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞主要由肝臟星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)組成，該細(xì)胞內(nèi)具有大量含有視黃醇的脂滴，在肝細(xì)胞的損傷刺激下，HSCs可被激活，在形態(tài)學(xué)和生理功能上發(fā)生改變，在HSCs的激活過程中，視黃醇的釋放降解是特征之一[34-35]。視黃醇可對HSCs的DNA合成產(chǎn)生抑制作用從而抑制肝臟的纖維化改變，即氯化汞染毒可能會通過影響HSCs視黃醇代謝導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的損傷[36]。

除上述通路外，生物信息學(xué)分析結(jié)果還顯示氯化汞的毒性作用還與肝臟的類固醇激素生成、膽汁分泌、化學(xué)致癌作用等通路相關(guān)。本研究采用TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)有效篩選了氯化汞染毒小鼠肝臟中的DEPs，并對其進(jìn)行了相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，有助于了解氯化汞肝毒性的生物學(xué)過程和代謝通路，為氯化汞的肝毒性機(jī)制研究提供線索，但氯化汞肝毒性涉及的具體通路尚需進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。