梁光平， 王 維， 吳嘉霖， 劉 靜， 楊 俊*

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學校 藥學系， 貴州 遵義 563006; 2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學公共實驗中心， 貴州 遵義 563000)

0 引言

珍珠莢蒾果實來源于五?；魄v蒾屬植物珍珠莢蒾(Viburnum foetidum var.Ceanothoides，V.Ceanothoides)的果實，具有清熱解毒、解表、止咳功效，可用于治療頭痛、感冒、咳嗽、瘡毒等[1].莢蒾屬植物在我國約有74種，以我國西南地區(qū)為分布中心[2].據(jù)研究報道，多種莢蒾屬植物的果實具有抗氧化[3,4]、抗炎[5]、降血糖[6]、神經(jīng)保護[4]以及提高谷胱甘肽和促甲狀腺激素的水平[7]等作用，且該屬植物的根、莖、葉等其他部位因含有豐富的萜類成分而具有較好的抗腫瘤活性[2].只是這些化學成分與藥理作用的研究多來源于地中海莢蒾、宜昌莢蒾、南方莢蒾、珊瑚樹、歐洲莢蒾、臭莢蒾等莢蒾屬植物，而來源于同屬植物珍珠莢蒾的研究報道則很少，僅2010年后有個別研究其莖葉化學成分的報道，從中發(fā)現(xiàn)包括萜類[8,9]、木脂素[10]、黃酮[8]、甾體以及有機酸[8]等類型的成分數(shù)量也不超過30種，其中某些成分對A549、HCT、SK-OV-3等腫瘤細胞株表現(xiàn)出抑制作用[8-10].

此外，本課題組前期[11]也采用氣相色譜-質(zhì)譜法分析了珍珠莢蒾地上部分石油醚提取物的揮發(fā)性成分，并從中鑒定了其中的72種，包括40種萜類成分、22種烴類及其衍生物、9種芳香族類成分和1種甾體類成分.隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展，UPLC-ESI-HRMSn技術(shù)已廣泛用于鑒定中藥材、中成藥制劑的化學成分，加之腫瘤一直以來都是亟待攻克的一大難題，且莢蒾屬多種植物的研究都證實具有抗腫瘤作用.為此，本研究采用系統(tǒng)溶劑提取法對珍珠莢蒾果實進行提取，通過腫瘤細胞活性評價篩選活性最好的提取物，借助UPLC-ESI-HRMSn技術(shù)分析其化學成分，為進一步挖掘珍珠莢蒾在抗腫瘤方面的藥用價值提供研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

新鮮珍珠莢蒾成熟果實，于2021年8月委托藥農(nóng)采集于貴州省六盤水市六枝特區(qū)箐口鄉(xiāng)，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W校梁光平副教授鑒定為五福花科珍珠莢蒾Viburnum foetidum var.ceanothoides 的成熟果實，于55 ℃鼓風干燥3天后使用.UPLC-ESI-HRMSn數(shù)據(jù)，由貴州省中科院天然產(chǎn)物化學重點實驗室分析測試與品質(zhì)評價中心提供.

1.1.2 主要儀器

U3000-Q Exactive Focus型超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Fisher公司)；CCL-170B-8型二氧化碳培養(yǎng)箱(Esco儀器)；iMark型酶標儀(Bio-Rad儀器)；RV3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA儀器)；BGZ-246型電熱鼓風干燥箱(上海博訊).石油醚(60-90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等均為市售分析純試劑；CCK8檢測試劑盒(杭州諾揚生物有限公司).HepG2、A549、Hela、MCF-7細胞由武漢云克隆科技股份有限公司提供.

1.2 實驗方法

1.2.1 珍珠莢蒾果實提取物的制備

參照文獻[12]的系統(tǒng)溶劑萃取法，取烘干后的珍珠莢蒾果實30 g于圓底燒瓶，依次采用石油醚(60-90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑回流提取3次，每次溶劑用量200 mL，每次提取時間依次為3.0 h、2.5 h、2.5 h，各溶劑三次提取完畢后，合并相應(yīng)的提取液，減壓濃縮回收溶劑，干燥得石油醚提取物(PE，1.83 g)、二氯甲烷提取物(DE，1.06 g)、乙酸乙酯提取物(EE，0.85 g)、正丁醇提取物(NE，1.33 g)，備用.剩余藥渣加水煎煮三次，每次用水200 mL，每次提取2.5 h，合并提取物，減壓濃縮，干燥得水提取物(WE，1.27 g)，備用.

1.2.2 細胞活性測試

珍珠莢蒾果實5種提取物設(shè)置20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、240 μg/mL、320 μg/mL等濃度梯度，按文獻[13]采用CCK8法評價5種提取物對HepG2、A549、MCF-7、Hela細胞作用48 h的體外抑制作用.

1.2.3 UPLC-ESI-HRMSn鑒定提取物的化學成分

(1)供試液制備

取珍珠莢蒾果實二氯甲烷提取物3.7 mg，加入二氯甲烷2 mL溶解完全，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為供試液.

(2)液相條件

ACE Ultracore2.5 SuperC18色譜柱(100×2.1 mm).其余條件與文獻[14]相同，即流速：0.3 mL/min；梯度洗脫，0～2 min為5%乙腈(0.1%甲酸)-95%水(0.1%甲酸)，2～47 min為95%乙腈(0.1%甲酸)-5%水(0.1%甲酸)，47～50 min為5%乙腈(0.1%甲酸)-95%水(0.1%甲酸).柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL.

(3)質(zhì)譜條件

離子源：HESI-II.質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置按文獻[14]的條件執(zhí)行，即正負離子同時采集，掃描100-1 500 Da的質(zhì)量范圍；噴霧電壓：正離子3.0 kV；負離子2.5 kV；離子傳輸管溫度：320 ℃.

(4)數(shù)據(jù)處理

采用優(yōu)化的UPLC-ESI-HRMSn檢測條件采集得到珍珠莢蒾二氯甲烷提取物的數(shù)據(jù)后，采用賽默飛世爾公司的compound discoverer 3.0軟件進行分析，結(jié)合軟件內(nèi)的在線數(shù)據(jù)庫、mZcloud或mzVault值以及查閱相關(guān)文獻數(shù)據(jù)進行化學成分的推測和鑒定.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果

從表1的測試結(jié)果可知，珍珠莢蒾果實5種提取物對HepG2、A549、Hela、MCF-7細胞均具有不同程度的抑制作用.在5種提取物中，DE提取物對HepG2、A549、Hela、MCF-7細胞的抑制作用均優(yōu)于其他4種提取物的活性，尤以對Hela細胞的抑制作用最好，IC50達到了116.8±5.35 μg/mL.因此，本研究采用UPLC-ESI-HRMSn技術(shù)對DE提取物進行成分分析.

表1 珍珠莢蒾果實5種提取物對4種細胞的抑制作用(n=3)

2.2 UPLC-ESI-HRMSn分析珍珠莢蒾二氯甲烷提取物的化學成分

2.2.1 分析鑒定結(jié)果

根據(jù)上述UPLC-ESI-HRMSn的數(shù)據(jù)采集和文獻報道的相關(guān)數(shù)據(jù)進行綜合分析，從珍珠莢蒾果實的二氯甲烷提取物中鑒定出39種成分，其中包括有機酸12種，萜類10種，苯丙素5種，黃酮4種，香豆素3種以及5種其他化合物.除熊果酸、原兒茶酸已被報道于珍珠莢蒾莖葉外[8]，其他成分均首次從珍珠莢蒾全株植物中被檢測到，這進一步豐富了珍珠莢蒾化學成分的研究內(nèi)容.珍珠莢蒾果實二氯甲烷提取物的正負總離子流圖見圖1所示.化合物保留時間、相對分子質(zhì)量、準分子離子峰、二級質(zhì)譜碎片、mzCloud和mzVault最佳匹配值等信息見表2所示.

圖1 珍珠莢蒾果實二氯甲烷提取物總離子流圖

表2 珍珠莢蒾果實化學成分UPLC-ESI-HRMSn的鑒別分析結(jié)果

續(xù)表2

2.2.2 化學成分的質(zhì)譜分析

(1)有機酸類化合物

由于12種化合物均含有羧基或酚羥基，因此把它們歸為有機酸類化合物.它們分別是右旋奎寧酸(1)、曲酸(2)、原兒茶酸(3)、羥基酪醇(4)、扁桃酸(5)、原兒茶醛(6)、對羥基安息香醛(7)、苯甲酸(8)、花椒油素(9)、壬二酸(10)、水楊酸(11)、紫膠桐酸(12).分析它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，化合物1的準分子離子峰為m/z191.055 1[M-H]-，丟失一分子H2O形成碎片離子m/z173.043 9，該離子繼續(xù)丟失-COOH和-OH后形成m/z111.043 8的碎片離子；化合物2的準分子離子峰為m/z143.033 6[M+H]-，依次丟失H2O、-CH2OH、-CO分別形成碎片離子m/z125.023 2、m/z97.028 7、m/z69.034 2；化合物3的準分子離子峰為m/z153.018 2[M-H]-，丟失-CO2后形成碎片離子m/z109.028 2，這與文獻[15]報道原兒茶酸MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物4的準分子離子峰為m/z153.054 5[M-H]-，連續(xù)丟失-CH2OH、-CH2后形成碎片離子m/z123.043 6、m/z109.028 2；化合物5的準分子離子峰為m/z151.039 0[M-H]-，依次丟失-OH、-CO、-CH2OH后分別形成碎片離子m/z136.015 5、m/z107.048 9、m/z77.038 2；化合物6的準分子離子峰為m/z137.023 1[M-H]-，準分子離子峰丟失-CO形成碎片離子m/z109.028 2，準分子離子峰丟失-H2O形成碎片離子m/z119.012 5；化合物7的準分子離子峰為m/z121.028 3[M-H]-，丟失-H、-CO分別形成碎片離子m/z120.020 3、m/z93.033 3；化合物8的準分子離子峰為m/z123.044 2[M+H]+，丟失-OH、-CO分別形成碎片離子m/z105.044 9、m/z77.039 1；化合物9的準分子離子峰為m/z197.080 7[M+H]+，依次丟失-H2O、-OCH3、-CH3形成碎片離子m/z179.069 9、m/z151.038 8、m/z137.059 5，隨后再丟失-CO、-OCH3形成碎片離子m/z95.049 4，丟失-OH形成碎片離子m/z79.054 7；化合物10的準分子離子峰為m/z187.096 7[M-H]-，依次丟失-COOH、-OH、-CO形成碎片離子m/z143.096 9、m/z125.096 0和m/z97.064 5；化合物11的準分子離子峰為m/z137.023 2[M-H]-，丟失-COOH形成基準離子m/z93.033 2；化合物12的準分子離子峰為m/z303.217 4[M-H]-，丟失-COOH、-H2O分別形成碎片離子m/z257.211 9、m/z239.201 1，同時，準分子離子峰從分子中部的鄰二羥基處裂解分別形成碎片離子m/z171.138 0、m/z129.090 9，m/z171.138 0的碎片離子繼續(xù)丟失-CO、-COOH后形成碎片離子m/z99.080 4，m/z129.090 9的碎片離子再丟失-CO和-COOH后形成碎片離子m/z85.064 5.

(2)萜類化合物

由于鑒定出的10種化合物的結(jié)構(gòu)均符合異戊二烯法則，因此把它們歸為萜類化合物.它們分別是京尼平苷酸(13)、脫落酸(14)、皂皮酸(15)、熊果酸(16)、路路通酸(17)、積雪草酸(18)、甘草次酸(19)、刺囊酸(20)、熊果酮酸(21)、齊墩果酮酸(22).分析它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，化合物13的準分子離子峰為m/z373.113 6[M-H]-，丟失一分子glc和一個OH后形成碎片離子m/z193.049 5，繼續(xù)丟失-OH、-COO分別形成碎片離子m/z179.055 6和m/z136.015 1，碎片離子m/z193.049 5的倍半萜母核斷裂形成m/z113.023 0、m/z101.023 1、m/z89.023 0等碎片離子；化合物14的準分子離子峰為m/z263.127 6[M-H]-，丟失-COO、-OH形成的碎片離子m/z219.138 2、m/z204.114 7與文獻[15]報道脫落酸MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物15的準分子離子峰為m/z487.341 1[M+H]-，二級碎片離子m/z451.319 0、m/z187.147 7、m/z175.147 5、m/z119.085 5與文獻[15]報道皂皮酸MS/MS裂解規(guī)律一致，同時，準分子離子峰依次丟失-OH、-CO后也分別形成碎片離子m/z469.330 8、m/z441.335 8；化合物16的準分子離子峰為m/z457.255 2[M+H]-，二級碎片離子m/z411.359 8、m/z203.179 3、m/z189.163 4、m/z163.147 7、m/z121.101 1、m/z107.085 6與文獻[15]報道熊果酸MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物17的準分子離子峰為m/z455.2395[M+H]-，丟失-H2O形成碎片離子m/z437.3407，其他二級碎片離子m/z409.346 4、m/z205.158 6、m/z119.085 5、m/z107.085 7與文獻[15]報道路路通酸MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物18的準分子離子峰為m/z487.343 1[M-H]-，連續(xù)丟失-COO、-OH后形成碎片離子m/z423.326 5，繼續(xù)丟失2個-OH和-CH3后分別形成m/z409.310 5、m/z393.315 0、m/z377.285 6；化合物19的準分子離子峰為m/z471.346 5[M+H]-，二級碎片離子m/z425.340 2、189.163 5、119.085 4、107.085 7與文獻[15]報道甘草次酸MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物20的準分子離子峰為m/z471.347 2[M-H]-，繼續(xù)丟失3個-OH、-CO、-CH3形成碎片離子m/z423.325 6、m/z393.315 0、m/z377.283 1；化合物21的準分子離子峰為m/z455.351 4[M+H]-，繼續(xù)丟失-OH形成碎片離子m/z437.340 6，其他二級碎片離子m/z409.344 9、m/z205.158 2、m/z175.147 9、m/z121.101 2、m/z107.085 7與文獻[15]報道熊果酮酸MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物22的準分子離子峰為m/z455.351 0[M+H]-，繼續(xù)丟失-OH形成碎片離子m/z437.340 9，其他二級碎片離子m/z409.347 2、m/z203.179 2、m/z177.163 2、m/z107.085 8、m/z95.085 9與文獻[15]報道齊墩果酮酸MS/MS裂解規(guī)律一致.

(3)黃酮類化合物

鑒定出的4種黃酮分別是桑黃素(23)、芹菜素(24)、香葉木素(25)、異鼠李素(26).分析它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，化合物23的準分子離子峰為m/z301.035 1[M-H]-，丟失-CO形成碎片離子m/z273.040 4，繼續(xù)丟失-H2O形成碎片離子m/z255.198 9，碎片離子m/z255.198 9骨架斷裂形成碎片離子m/z151.002 5，碎片離子m/z273.040 4黃酮骨架含氧環(huán)開裂后形成類似查爾酮結(jié)構(gòu)的碎片離子m/z229.050 8，該查爾酮離子碎片繼續(xù)斷裂形成碎片離子m/z121.028 2，其中m/z229.050 8和m/z151.002 5離子碎片與文獻[15]報道桑黃素MS/MS裂解規(guī)律基本一致；化合物24的準分子離子峰m為/z269.045 3[M-H]-，丟失-CO形成碎片離子m/z241.050 4，繼續(xù)丟失-OH形成碎片離子m/z225.054 8，碎片離子m/z151.002 4和m/z107.033 2與文獻[15]報道芹菜素MS/MS裂解規(guī)律基本一致；化合物25的準分子離子峰為m/z299.055 8[M-H]-，依次丟失-CH3、-CO和2個-OH分別形成碎片離子m/z284.032 3、m/z256.037 2、m/z227.034 3，其他的碎片離子m/z151.002 6和m/z107.012 5均為黃酮和黃酮醇類化合物常見碎片離子，此與化合物23、24的裂解規(guī)律一致；化合物26的準分子離子峰為m/z315.050 7[M-H]-，依次丟失-CH3、-CO、-OH分別形成碎片離子m/z300.027 1、m/z271.024 2、m/z255.029 0，其他碎片離子m/z151.002 5、m/z107.012 5均與化合物23、24、25經(jīng)過相同裂解規(guī)律形成，且這些離子碎片與文獻[15]報道異鼠李素的基本一致.

(4)苯丙素類化合物

由于鑒定出的5種化合物均具有C6-C3結(jié)構(gòu)單元，因此把它們歸為苯丙素類化合物.它們分別是咖啡酸(27)、對羥基肉桂酸(28)、阿魏酸(29)、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷(30)、松柏醛(31).分析它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，化合物27的準分子離子峰為m/z179.034 1[M-H]-，丟失-CO2形成基準離子m/z135.043 9，繼續(xù)丟失-CH2和2個-OH形成離子碎片m/z107.048 6、m/z91.053 9；化合物28的準分子離子峰為m/z163.039 0[M-H]-，脫-CO2形成基準離子m/z119.049 0，繼續(xù)丟失1個-CH2和1個-OH形成離子碎片m/z91.053 9；化合物29的準分子離子為m/z193.049 8[M-H]-，依次丟失-CH3、-OH、-CO、-OH后分別形成碎片離子m/z178.026 3、m/z161.023 3、m/z134.036 1、m/z121.028 0；化合物30的準分子離子峰為m/z519.187 2[M-H]-，丟失一份子葡萄糖形成碎片離子m/z357.133 9，該碎片離子裂解為2分子C6-C3單元后，繼續(xù)丟失-OCH3、-OH分別形成碎片離子m/z151.038 9和m/z136.015 4，這與文獻[15]報道(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物31的準分子離子峰為m/z179.070 2[M+H]-，丟失-CH3、-OCH3、-CO分別形成碎片離子m/z161.059 3、m/z146.961 1、m/z133.064 6，碎片離子m/z146.961 1繼續(xù)丟失-CH2、-OH后形成基準離子m/z105.070 1，再連續(xù)丟失2個CH2后形成苯環(huán)碎片離子m/z79.054 7.

(5)香豆素類化合物

由于鑒定出的3種化合物均具有苯駢α-吡喃酮母核，因此把它們歸為香豆素類化合物.它們分別是秦皮乙素(32)、香豆素(33)和7-羥基香豆素(34).分析它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，化合物32的準分子離子峰為m/z177.018 4[M-H]-，二級質(zhì)譜碎片離子m/z149.023 4、m/z133.028 3、m/z121.028 2、m/z105.033 3、m/z93.033 2與文獻[24]報道秦皮乙素MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物33的準分子離子峰為m/z147.043 9[M+H]-，二級質(zhì)譜碎片離子m/z119.049 3、m/z91.054 7與文獻[15]報道香豆素MS/MS裂解規(guī)律一致；化合物34的準分子離子峰為m/z161.023 4[M-H]-，丟失-CO形成碎片離子m/z133.028 3，再依次丟失-O、-CH2、-OH分別形成碎片離子m/z117.033 3、m/z105.033 4、m/z89.038 2.

(6)其它化合物

除上述鑒定的化合物，還檢測到去甲升麻素(35)、對甲氧基苯甲醛(36)、5,7-二羥基色原酮(37)、蘇木素(38)、5-羥基-四氫萘酮(39)等5種其他化合物.分析它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，化合物35的準分子離子峰為m/z293.099 2[M+H]-，準分子離子峰丟失-OH形成碎片離子m/z275.087 9，繼續(xù)丟失異戊烯形成碎片離子m/z205.965 5；化合物36的準分子離子峰為m/z137.059 6[M+H]-，準分子離子峰丟失-CH3、-CO分別形成碎片離子m/z122.036 2、m/z94.041 7，準分子離子峰丟失-CO、-OCH3形成碎片離子m/z109.064 9、m/z79.054 7；化合物37的準分子離子峰為m/z177.018 4[M-H]-，依次丟失-O、-CO、-CH3O分別形成碎片離子m/z162.031 6、m/z133.028 3、m/z91.01 7；化合物38的準分子離子峰為m/z301.071 4[M+H]-，丟失-OH形成碎片離子m/z285.039 6，該碎片離子從吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)斷開后分別形成碎片離子m/z165.018 3、m/z121.028 1，m/z165.018 3繼續(xù)丟失2個CH2后形成碎片離子m/z137.023 2，m/z121.028 1繼續(xù)丟失3個OH后形成碎片離子m/z77.038 3；化合物39的準分子離子峰為m/z163.074 9[M+H]-，連續(xù)丟失-CO、-OH形成碎片離子m/z135.080 2、m/z121.064 7，再連續(xù)丟失3個-CH2形成m/z107.085 7、m/z93.070 3、m/z79.054 7等碎片離子.

2.2.3 鑒定成分與提取物細胞活性的關(guān)系

本研究采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水等5種溶劑依次對珍珠莢蒾果實進行提取時，由于石油醚在天然藥物的提取中主要用于脫脂，珍珠莢蒾果實中存在的多種脂溶性成分此時從藥材組織中解離被提取出，當用二氯甲烷提取時，大部分中等極性和中小極性的成分被提取出，這些成分通常都具有多種藥理作用.繼續(xù)采用乙酸乙酯、正丁醇、水進行提取時，由于最有可能具有抗腫瘤作用的中等極性和中小極性成分已被大量提取出，導致在乙酸乙酯、正丁醇、水提取時獲得的主要是中大極性和水溶性成分，而這些提取物中可能含有的抗腫瘤作用成分受無效成分含量較高后，對腫瘤細胞的抑制作用下降，這在表1的細胞活性測試結(jié)果中得以體現(xiàn).

與此同時，大量文獻報道熊果酸[30-33]、積雪草酸[34]、甘草次酸[35]、芹菜素[36]、異鼠李素[37-39]等三萜、黃酮類化學成分對本研究選取的A549、HepG2、Hela、MCF-7腫瘤細胞以及其他多種腫瘤細胞均具有抑制作用，刺囊酸[40]、路路通酸[41]對MCF-7細胞具有抑制作用，阿魏酸對A549細胞具有抑制作用[42]，秦皮乙素[43,44]對肺、胃、肝、胰腺、腸、乳腺等多器官惡性腫瘤均有治療作用.然而，右旋奎寧酸、原兒茶醛、花椒油素等多種有機酸類化合物和去甲升麻素、蘇木素等其他類成分對腫瘤的抑制作用尚未見直接的研究報道.雖有報道水楊酸衍生物具有抗乳腺癌的作用，但其相關(guān)研究成果也尚有爭議[45]，這也進一步支撐表1的活性測試結(jié)果.據(jù)此可初步判斷珍珠莢蒾果實二氯甲烷提取物的抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)可能是熊果酸、芹菜素、秦皮乙素、阿魏酸等多種成分產(chǎn)生的協(xié)同作用.

3 結(jié)論

根據(jù)體外抗腫瘤活性，珍珠莢蒾果實抗腫瘤活性部位為二氯甲烷提取物，提取物中含有的三萜、黃酮、苯丙素類成分可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但還需通過深入研究進行驗證.