廖思晨， 田 露， 王旭陽， 龔國利

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們開始重視生物安全及防控治理等問題.目前，化學(xué)品的廣泛使用不僅會破壞微生物的生態(tài)平衡，還會導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)、污染地下水和人類健康風(fēng)險(xiǎn).因此，迫切需要開發(fā)新的環(huán)境友好型產(chǎn)品來替代化學(xué)藥品，以防控各種有害生物[1].

微生物脂肽是一種新型生物活性分子，主要由芽孢桿菌生產(chǎn)的分子量為700-2 000 Da的天然小分子肽.它們大多能與細(xì)胞膜互相作用，表現(xiàn)出抗菌和細(xì)胞抑制活性，具有抗微生物、抗腫瘤、表面活性強(qiáng)、易降解、不易誘發(fā)耐藥性、對低pH環(huán)境和高溫耐受性好等功能和特性.因此，脂肽化合物在植物生物防治、化妝品、制藥、食品、飼料和洗滌劑等領(lǐng)域受到高度關(guān)注[2].在農(nóng)業(yè)上可用于生物防治，具有定殖、促生長及拮抗作用，可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲取抗性，啟動免疫反應(yīng).此外，它還可以用作抗生素、飼料添加劑、乳化劑和發(fā)泡劑等[3-5].Kumar等[6]研究了解淀粉芽孢桿菌RHNK22產(chǎn)生的化合物Iturin A，該化合物對農(nóng)業(yè)害蟲之一斜紋夜蛾(Spodopteralitura)具有很強(qiáng)的抑制作用.Wafa等[7]報(bào)道了由假單胞菌屬細(xì)菌(Pseudomonassp.)和伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp)產(chǎn)生的微生物脂肽，可以作為殺蟲劑、除草劑、殺蟲劑和殺菌劑的佐劑，能夠安全的應(yīng)用到生物農(nóng)藥中.

由于脂肽天然安全和優(yōu)異的抗菌性能，市場對其需求不斷激增，新型脂肽化合物的發(fā)現(xiàn)數(shù)量也呈指數(shù)增長，在生物安全范疇具有一定的研究價(jià)值和應(yīng)用前景.本研究旨在從特殊環(huán)境堿蓬中分離具有防治致病菌潛力的脂肽wxy-b3菌株，為其進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 植物樣品

植物堿蓬組織取自于陜西省榆林市鹽堿地.

1.1.2 指示菌

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumsambucinum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和蘋果腐爛病菌(Cytosporamandshurica).凍存菌種保藏于-80 ℃冰箱中.

1.1.3 主要試劑

磷酸氫二鈉、半胱氨酸、乙酸、甘露醇、氯仿(天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)，氯化鉀、茚三酮(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，胰蛋白胨、牛肉浸膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司).

1.1.4 主要儀器

THZ-98A恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，BIS-910凝膠成像儀(北京東勝創(chuàng)新生物有限公司)，DYY-11電泳儀(北京市六一儀器廠)，UV-5200紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿蓬內(nèi)生菌的分離

將新鮮堿蓬的根、莖、葉以75%酒精沖洗，放入5% NaClO溶液中表面消毒5 min，隨后在Na2S2O3溶液中浸泡中和3 min，使用無菌水沖洗2-3次，并以最后一次作為沖洗對照.稱取1 g左右消毒后的堿蓬組織，加入5 mL無菌水在研缽內(nèi)研磨均勻.再吸取100 μL的上清液均勻涂布于不同鹽(NaCl)濃度(0%、3%、5%、10%)的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h.挑取不同顏色、形態(tài)的菌落于相應(yīng)鹽濃度的細(xì)菌培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)至獲得單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于甘油凍存管中，-80 ℃凍存.

1.2.2 堿蓬內(nèi)生菌的抑菌活性

(1)內(nèi)生菌菌株的發(fā)酵上清液制備：挑取內(nèi)生菌菌株的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 rpm離心10 min后取上清液作為樣品使用.

(2)牛津杯法[8]測定內(nèi)生菌對細(xì)菌的抑菌活性：接種5%的細(xì)菌指示菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為108CFU/mL (OD600 nm=0.5).待培養(yǎng)皿中水瓊脂稍凝固后放入無菌牛津杯，使指示菌液與冷卻至約45 ℃的LB固體培養(yǎng)基以3%的比例混合，倒在水瓊脂上.凝固后，吸取100 mL樣品，37 ℃培養(yǎng)18 h后察看有無抑菌圈.

(3)濾紙片法[9]測定內(nèi)生菌對真菌的抑菌活性：用無菌棉簽蘸取孢子及菌絲，輕輕按壓至改良的馬丁固體平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至平板中心長出直徑約1.5～2 cm的菌落.將直徑約1 cm的無菌濾紙片浸入發(fā)酵上清液中，稍干后將濾紙片放入菌落周圍.30 ℃培養(yǎng)2～3 d觀察是否形成抑菌圈.

1.2.3 脂肽合成基因的擴(kuò)增

根據(jù)芽孢桿菌脂肽家族的生物合成基因簇，在生物工程(上海)有限公司合成Surfacins，F(xiàn)engycins，Iturins引物，序列見表1所示.參照侯華[10]的改進(jìn)方案進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃復(fù)性60 s；72 ℃延伸90 s；循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min.

表1 部分脂肽基因的引物

1.2.4 薄層色譜層析(TLC)

內(nèi)生菌菌株的發(fā)酵上清液制備方法同1.2.2.配制10 mL配比為氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶水=65∶30∶4∶4的溶液，靜置分層取下層清液作為展開劑[11].而后在距離TLC板底部約1 cm處畫一條直線，在直線上等間隔點(diǎn)四個(gè)點(diǎn)用毛細(xì)玻璃管吸取樣品點(diǎn)樣，干燥后點(diǎn)樣2～3次.待樣品干燥后，將TLC板傾斜放入展層缸中，吸入約5 mL展開劑沒過底部.用玻璃板蓋住頂蓋，防止溶劑揮發(fā).

1.2.5 菌種鑒定

(1)菌落形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的單菌株wxy-b3在含3% NaCl的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，察看wxy-b3菌落的形態(tài)、顏色、大小和透明度等外觀特征.

(2)掃描電鏡

參照Cai等[12]描述的方法并進(jìn)行改良.按照1.2.2中所述的方法獲得菌懸液(OD600nm=0.5)，離心后向菌體沉淀中加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃靜置固定12 h，使用PBS洗濯菌體2-3次，再用30%、50%、70%、80%、90%和100%濃度的乙醇溶液脫水菌體，每次10 min.隨后重懸于乙酸異戊酯中30 min，6 000 rpm離心10 min后在烘箱中烘干2 h.最后，用牙簽移取適量樣品粘在載物臺上，渡金后進(jìn)行電鏡觀察(MLA 650,FEI,Hillsboro,USA).

(3)生理生化指標(biāo)

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[13]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]中的方法進(jìn)行測定.

(4)16S rDNA鑒定

根據(jù)邢旋等[15]的改進(jìn)方法實(shí)施16S rDNA的擴(kuò)增.將從細(xì)菌基因組提取試劑盒中提取各菌株的DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA序列的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)以及1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)用于擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系為：2 μL100 ng/μL DNA模板、1 μL10.74 nmol上游引物、1 μL10.69 nmol下游引物、10 μL Mix酶和6 μL ddH2O.其中DNA模板為提取的菌株基因組DNA.

所獲取的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生物(上海)公司測序.利用NCBI比對得到菌株16S rDNA序列，以及相似序列的其他菌株序列.MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與討論

2.1 堿蓬內(nèi)生菌菌種庫的構(gòu)建

將耐鹽植物堿蓬的根、莖和葉置于含0%、3%、5%、10% NaCl的LB固體培養(yǎng)基中，分別分離得到了21株內(nèi)生細(xì)菌和24株內(nèi)生真菌.其中，從0% NaCl的LB固體培養(yǎng)基中篩選出9株內(nèi)生細(xì)菌，命名為wxy-b(1～5、18～21)，如圖1(a)～(e)、(r)～(u)所示.從3% NaCl的LB固體培養(yǎng)基中篩選得到6株內(nèi)生細(xì)菌，命名為wxy-b(6～11)，如圖1(f)～(k)所示.從5% NaCl的LB固體培養(yǎng)基中篩選出4株內(nèi)生細(xì)菌，命名為wxy-b(12～13、16～17)，如圖1(l)～(m)、(p)～(q)所示.從10% NaCl的LB固體培養(yǎng)基中篩選得到2株內(nèi)生細(xì)菌，命名為wxy-b(14～15)，如圖1(n)～(o)所示.

圖1 堿蓬內(nèi)生細(xì)菌

另外，從0% NaCl改良的馬丁培養(yǎng)基中篩選得到一株內(nèi)生真菌，命名為wxy-f22，如圖2(v)所示.從3% NaCl的改良馬丁培養(yǎng)基中篩選出10株內(nèi)生真菌，命名為wxy-f(1～9、23)，如圖2(a)～(i)、(w)所示.從5% NaCl的改良馬丁培養(yǎng)基中篩選出7株內(nèi)生真菌，命名為wxy-f(10～17)，如圖2(j)～(q)所示.從10% NaCl的改良馬丁培養(yǎng)基中篩選得到6株內(nèi)生細(xì)菌，命名為wxy-f(18～21、24)，如圖2(r)～(u)、(x)所示.

圖2 堿蓬內(nèi)生真菌

2.2 堿蓬內(nèi)生菌抑菌活性

為了檢測內(nèi)生菌株的次生代謝產(chǎn)物是否具有抑菌活性，本文利用部分指示菌對21株內(nèi)生細(xì)菌和24株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌檢測.結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株內(nèi)生細(xì)菌和7株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物均具備抑菌作用，但大多菌株只有窄譜的抑菌活性.如表2所示，細(xì)菌wxy-b10和12只抗蘋果腐爛病菌，真菌wxy-f2、3和9只抗番茄灰霉病菌，真菌wxy-f18和19僅有馬鈴薯干腐病菌抑制活性.細(xì)菌wxy-b4對小麥赤霉病菌和蘋果腐爛病菌有抑制活性，真菌wxy-f16和22對番茄灰霉病菌和馬鈴薯干腐病菌有抑制作用.這些菌株大多具備抑制植物病原真菌生長的活性.其中，細(xì)菌wxy-b3表現(xiàn)出較廣譜的抗菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小麥赤霉病菌、馬鈴薯干腐病菌和蘋果腐爛病菌等均具有抑制作用.

表2 堿蓬內(nèi)生菌抑菌譜

2.3 脂肽合成基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對上述具有抑菌活性的菌株進(jìn)行脂肽合成基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有菌株wxy-b3含有脂肽生物合成相關(guān)基因，見圖3所示.該菌株含有Iturin家族的ituD和bamC生物合成基因，擴(kuò)增片段大小為750～1 000 kb，而Fengycin家族的fenA、fenB、fenD基因和Surfacin家族的srfA基因未擴(kuò)增出.依據(jù)脂肽生物合成基因擴(kuò)增結(jié)果，推斷出菌株wxy-b3可能產(chǎn)生Iturin家族的脂肽Iturin A和Bacillomycin D.

圖3 菌株wxy-b3脂肽生物合成基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 TLC分析

菌株wxy-b3發(fā)酵上清液的TLC分析見圖4所示.結(jié)果顯示，品層析后硅膠板上出現(xiàn)4個(gè)淡黃色斑點(diǎn).根據(jù)氨基酸或肽與茚三酮在加熱條件下產(chǎn)生紫紅色或黃色的原理[16]，可以得知菌株wxy-b3的發(fā)酵上清液中至少含4種蛋白質(zhì)或肽類產(chǎn)物，證明菌株wxy-b3有產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽的能力.由于菌株wxy-b3具有Iturin A和Bacillomycin D的合成基因，因此可能含脂肽化合物.此外，茚三酮與脯氨酸和羥脯氨酸反應(yīng)生成了黃色物質(zhì)，這表明菌株wxy-b3產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽的氨基酸組成中含有脯氨酸.

圖4 wxy-b3菌株發(fā)酵上清液的薄層色譜層析結(jié)果

2.5 菌種鑒定結(jié)果

菌落的形態(tài)特征和細(xì)胞形態(tài)見圖5所示.根據(jù)菌落形態(tài)和掃描電鏡可以看出菌株wxy-b3為桿狀菌體，大小為0.6～0.7 μm×3～4 μm.LB培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色菌落，有裂紋，邊緣粗糙，表面干燥不透明.

生理生化特征見表3所示.結(jié)果顯示，過氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉酶試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、明膠水解均為陰性，氧化酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、酯酶試驗(yàn)、酪素降解試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)結(jié)果均為陽性.說明菌株wxy-b3能分解利用甘露糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等糖醇類物質(zhì)生長.這表明菌株wxy-b3具備《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中常見芽孢桿菌屬的特征.

圖5 wxy-b3菌株的菌落及掃描電鏡

表3 菌株wxy-b3的生理生化特征

通過PCR擴(kuò)增菌株wxy-b3的16S rDNA，獲得大小為1 000～1 500 kb的條帶，見圖6所示.公司測序后獲得長度為1 488 bp的16S rDNA序列，其NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號為：SUB 10918382 Bacillus OM189446，見圖7所示.經(jīng)BLAST比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株wxy-b3與芽孢桿菌屬成簇，與B.amyloliquefaciens(IMA10)的同源性最高，達(dá)到100%，如圖8所示.其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用序列信息如表4所示.

圖6 菌株wxy-b3 16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖7 菌株wxy-b3的16S rDNA 堿基序列

圖8 菌株wxy-b3的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

表4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用序列信息

因此，菌株wxy-b3為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens.

3 結(jié)論

本研究從植物堿蓬組織中分離得到具有產(chǎn)脂肽能力的植物內(nèi)生菌株，對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌和蘋果腐爛病菌等均具有抑制活性，并對其進(jìn)行脂肽合成基因的PCR擴(kuò)增，其中菌株wxy-b3含有Iturin家族脂肽的合成基因.繼而對菌株wxy-b3進(jìn)行了TLC分析，發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生4種含有脯氨酸的蛋白質(zhì)或肽類組分.因此，菌株wxy-b3可確定具有產(chǎn)生抗菌脂肽的能力，推測其可以產(chǎn)生Iturin家族脂肽.并經(jīng)過形態(tài)學(xué)察看、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA鑒定，將菌株wxy-b3歸類為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens).本文為菌株wxy-b3的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ).