張茹 卜倩 賈宏林 梁曉鷹 高麗 姜孝芳

支氣管哮喘(bronchial asthma, BA)是以發(fā)作性喘息伴呼吸困難為主要癥狀[1]且與微小RNA(microRNA, miRNA)有關[2]的疾病。miRNA可下調靶向轉錄的蛋白質來調控病理生理改變[3]，并可調控BA的發(fā)展[4]。DNA甲基化是不改變DNA序列而調控基因產生可遺傳性改變[5-6]。在哮喘中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的變異，這將推進闡明BA在表觀遺傳學中的機制[7]。本研究旨在探究BA中miR-126、miR-326和miR-155的表達以及甲基化酶抑制劑對BA的調控作用。

資料與方法

一、主要實驗材料與試劑

5-氮雜胞苷(A2385，Sigma)，TRIzol裂解液(152104，Invitrogen)，HISTOPAQUE?-1077 (RNBF2219，Sigma)，磁珠抗體(557787，BD)，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6001，中杉金橋)，IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3抗體(A2385、AF6233、DF3196、AF6544)均定購于Affinity，miScript Ⅱ RT Kit(218161)、miScript SYBR Green PCR kit(1046470)、miScript miRNA-126 Primer Assay(MS00003430)、Hs-miR-326 miScript Primer Assay (MS00003948)、Rn-miR-326 miScript Primer Assay (MS00027342)Hs-miR-155 miScript Primer Assay (MS00008778)、Hs-RNU6 miScript primer assay(MS00033740)均定購于QIAGEN，實驗所需引物序列見表1。

表1 引物序列信息表

二、研究對象

1 哮喘患者

病例為自2015年10月到2017年12月就診于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院及新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院的哮喘急性發(fā)作期患者(48例)，并符合2016年發(fā)布的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》[8]里的診斷要點，排除嚴重的循環(huán)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)疾病、系統(tǒng)性疾病及妊娠，排除采血一周內服用抗組胺藥物、免疫抑制劑等。對照組在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院及新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院的健康志愿者(48例)中選擇。對照組排除近期有感染史、哮喘、類風濕性關節(jié)炎及其他免疫性疾病患者，排除前一個月內服用過三環(huán)類抗抑郁藥、β受體阻滯劑或抗組胺藥等的患者以及有親屬患有過敏性疾病和哮喘病史的人群。本研究獲新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院及新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(20120220-144)，患者或近親親屬對研究方案簽署知情同意書。

2 動物模型

于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心選購180～240 g的無病原體SPF級SD雄性大鼠，并清潔飼養(yǎng)。隨機將大鼠分為4組，每組10只，分組為：正常組、哮喘模型(BA)組、5-aza低劑量(5-aza-L)組、5-aza高劑量(5-aza-H)組。

三、研究方法

1 臨床標本的采集及CD4+T細胞的分離

在無菌條件下對病例組和對照組取靜脈血5mL，使用HISTOPAQUE?-1077分離淋巴細胞。將分離的淋巴細胞用500 μL磷酸緩沖鹽水培養(yǎng)液處理，與45 μL磁珠抗體混合，得到CD4+T細胞。CD4+T細胞保存在-80℃?zhèn)浯?，用于后續(xù)實驗。

2 動物造模

動物致敏：動物實驗的第1、7、14天對大鼠進行基礎致敏，除正常對照組外其他組在實驗的第1天使用10%的OVA溶液(10%的Al(OH)3為佐劑)1 mL腹腔注射進行基礎致敏，第7天和第14天再次腹腔注射1 mL上述溶液，正常對照組用生理鹽水代替致敏溶液進行注射，部位、劑量及方法與其他實驗組相同。

動物激發(fā)：第一天致敏在腹腔內注射10 %OVA和Al(OH)3混合液1 mL，待第7日重復1次以加強致敏，第14天基礎致敏后將大鼠置入自制透明霧化吸入箱激發(fā)，按3 %的濃度OVA霧化吸入(霧粒直徑3～5 μm)，每日1次，每次30 min，連續(xù)15日。正常組予等量生理鹽水腹腔注射以及霧化吸入，其余方法同哮喘模型組。激發(fā)過程中大鼠出現(xiàn)呼吸加快、口唇發(fā)紺、點頭呼吸、短氣喘息、二便失禁及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。

動物給藥：第31日起藥物干預，腹腔注射5-aza-L(0.5 mg/kg)和5-aza-H(5 mg/kg)，連續(xù)給藥7天，每次給藥前30min進行OVA霧化30min。

3 CD4+T細胞和大鼠模型RNA的提取

分離出的T細胞，采用TRIzol法提取總RNA后逆轉錄，用于RT-PCR檢測。按照試劑盒說明手冊進行操作，用Nanodrop 2000測定RNA的濃度。取各組大鼠右肺約50 mg，放入液氮中研磨組織，與T細胞提取總RNA相同。

4 實時熒光定量RT-PCR檢測miRNA 以及Th細胞相關因子mRNA的表達

按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將RNA置于MyCyclerTM Thermal Cycler 中進行逆轉錄，逆轉錄反應條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，+∞；得到cDNA，然后于PCR儀器中進行擴增，反應體系：2× Master Mix 10 μL、10× PCR Universal Primer 2 μL、10×PCR Primer Assay 2 μL、cDNA 模板2 μL、滅菌水補充至20 μL。擴增反應程序：95 ℃, 15 min;94 ℃, 15 s;55 ℃, 30 s;70 ℃, 34 s；循環(huán)數：40。最后用2-△△Ct法計算各組mRNA相對表達量。

5 HE染色及免疫組化檢測大鼠肺組織中蛋白表達

造模結束后取大鼠肺組織，進行包埋、切片，HE染色，一抗孵育過夜、顯色、二抗孵育、復染封片。在光鏡下觀察肺組織氣道的變化，每組選取6個樣本，每個樣本選取5個不重疊視野，測定平均吸光度用軟件Image-Pro Plus進行分析。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、哮喘組與正常組中miR-126、miR-326和miR-155 mRNA的相對表達量

miR-126 、miR-326和miR-155在哮喘組表達水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義。(表2)

表2 哮喘患者組與正常組miR-126、miR-326、miR-155的表達水平

二、哮喘組與正常組中IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA的相對表達量

IFN-γ和 Foxp3在哮喘組表達水平明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義；ROR-γ在哮喘組表達水平顯著高于正常組，差異有顯著統(tǒng)計學意義。(表3)

表3 哮喘患者組與正常組IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3的表達水平

三、 哮喘患者miR-126、miR-326和miR-155 mRNA與IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA的相關性分析

Pearson相關性分析顯示在哮喘患者中miR-126 、miR-326和 miR-155 與IFN-γ、GATA3 、ROR-γ和Foxp3表達無明顯相關性(見表4)。

表4 哮喘患者miR-126、miR-326和miR-155 mRNA與IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA的相關性分析

四、各組大鼠肺組織病理學變化

光鏡下觀察顯示: 正常組支氣管平滑肌細胞、黏膜皺襞無增生，無炎性滲出物，杯狀細胞無增生，氣道內無明顯炎性細胞; 哮喘組氣管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，部分肺泡壁斷裂，杯狀細胞出現(xiàn)增生，支氣管黏膜皺襞增多延長，管腔縮窄； 5-aza-L組、5-aza-H組周圍有少量炎性細胞浸潤，支氣管黏膜皺襞少許增多，杯狀細胞少量增生，管腔有些輕微縮窄。(圖1)

圖1 HE染色觀察大鼠肺組織病理改變(×200)

五、5-aza干預大鼠模型對miR-126、miR-326和miR-155 mRNA表達的影

miR-126在哮喘組表達水平高于正常組，在5-aza-L組和5-aza-H組表達水平低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義；miR-326在5-aza-L組表達水平低于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義； miR-155在5-aza-L組表達水平低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義。(表5-6)

表5 大鼠正常組與哮喘組miR-126、miR-326、miR-155的表達水平

表6 大鼠模型各組miR-126、miR-326、miR-155的表達水平

六、5-aza干預大鼠模型對IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA 表達的影響

IFN-γ在5-aza-H組表達水平低于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義； GATA3在哮喘組表達水平明顯高于正常組，在5-aza-H組表達水平低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義；ROR-γ在哮喘組表達水平明顯高于正常組，在5-aza-L組和5-aza-H組表達水平明顯低于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義；Foxp3在哮喘中表達低于正常組，在5-aza-L組表達水平明顯高于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義。(表7-8)

表7 大鼠正常組和哮喘組IFN-γ、GATA3 、ROR-γ、Foxp3的表達水平

七、5-aza干預大鼠模型對IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 蛋白 表達的影響

免疫組化檢測，計算平均光密度進行相對表達分析，IFN-γ在哮喘組的表達水平低于正常組，在5-aza-L組表達水平高于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義；GATA3在哮喘組的表達水平高于正常組，5-aza-L組和5-aza-H組表達水平低于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義； ROR-γ在哮喘組表達水平明顯高于正常組，5-aza-L組和5-aza-H組表達水平低于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義；Foxp3在哮喘組表達水平明顯低于正常組，5-aza-L組和5-aza-H組表達水平高于哮喘組，差異有顯著統(tǒng)計學意義。(圖2，表9-10)

表9 大鼠正常組和模型組中IFN-γ、GATA3 、ROR-γ、Foxp3蛋白的平均吸光度值

圖2 大鼠模型各組IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3的蛋白表達水平(×400)

表8 大鼠模型各組IFN-γ、GATA3 、ROR-γ、Foxp3的表達水平

討 論

CD4+T可分為Th1、Th2、Th17以及Treg四個亞群，Th1細胞分泌干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)，參與細胞免疫和遲發(fā)性超敏炎癥反應[9]； Th2細胞的轉錄因子GATA結合蛋白3 ( GATA binding protein 3, GATA3)具有促炎作用[10-11]。Treg細胞負責維持自身耐受并抑制自身免疫, 而Th17細胞參與炎癥反應[12]。Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡在哮喘發(fā)病中起重要作用[13]，免疫失衡易引起氣道炎癥疾病，以BA最常見[14]。哮喘發(fā)作時，GATA3表達迅速升高，促進氣道高反應性和氣道壁重塑[15]。本研究結果表明，與正常組相比較，IFN-γ和叉頭翼狀螺旋轉錄因子3(winged-helix transcription factor 3, Foxp3)在人體外周血中哮喘組表達水平明顯降低，而哮喘組維甲酸相關孤兒受體(retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,ROR-γ)表達水平明顯升高，與此前研究一致。本研究大鼠模型中， GATA3和ROR-γ在哮喘組表達水平升高，這與此前研究一致。

表10 大鼠模型各組中IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3蛋白的平均吸光度值

近年來，研究發(fā)現(xiàn)BA發(fā)病與miRNA有關[16]，可能通過影響炎癥因子釋放參與BA的病理改變[17]。miRNA是CD4+T細胞分化的重要調節(jié)因子[18]，有研究發(fā)現(xiàn)調節(jié)miR-126[19]和miR-155[20]可以調節(jié)Th細胞因子平衡[21]。因此，miRNA與Th細胞因子在BA中的作用成為哮喘新的研究方向。miR-126定位于9號染色體類表皮生長因子樣結構域7基因7號內含子中，能調控Th2細胞因子表達[22]，參與機體炎癥反應及免疫應答[23]， miR-126 表達降低可調控GATA-3表達進而使Th2 細胞減少釋放炎性介質，改善氣道炎癥反應[24]，緩解哮喘小鼠氣道炎癥反應[25]。本研究結果表明， miR-126在哮喘患者組表達水平升高，在大鼠模型中，miR-126在哮喘組表達水平升高，ROR-γ表達水平升高，與此前研究一致。從本研究結果來看，在大鼠模型中，哮喘組miR-126表達水平升高，GATA3和ROR-γ表達水平升高，推測miR-126與GATA3和ROR-γ可能存在負調控關系。miR-326位于人體11號染色體，之前研究發(fā)現(xiàn)miR-326在變應性鼻炎CD4+T淋巴中高表達且與低表達的IFN-γ負相關，推測miR-326可能影響Th1細胞因子IFN-γ的表達[26]，miR-326先前也已被證明通過誘導 Th17 分化和成熟在免疫發(fā)病機制中發(fā)揮作用[27]且miR-326在哮喘中調控氣道平滑肌細胞[28]從而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。本研究結果表明，哮喘患者組miR-326表達水平升高，與此前研究一致，哮喘患者組同時ROR-γ表達水平升高，IFN-γ和Foxp3表達水平降低。進行大鼠造模，結果顯示，在大鼠哮喘組中GATA3和 ROR-γ表達水平升高，與此前研究一致。miR-155位于人體21號染色體上， 具有維持人類免疫系統(tǒng)功能[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，BA患者血清miR-155水平顯著增加[30], 且與其肺功能呈顯著負相關性，而且miR-155能夠抑制CD4+T細胞中IFN-γ信號轉導[31]，促進miR-155的表達，IFN-γ表達水平明顯降低而GATA3表達水平升高[32]，推測miR-155可以負調控IFN-γ和正調控GATA3的表達。在本實驗中，哮喘患者組miR-155表達水平升高，ROR-γ表達水平升高，IFN-γ和Foxp3表達水平降低，與此前研究一致，本研究在哮喘患者組和正常組中miR-126、miR-326和miR-155與IFN-γ、GATA3、 ROR-γ和Foxp3呈弱相關性，考慮原因有三，一可能與病人過敏源不同有關，二可能與疾病發(fā)展階段有關，三可能與哮喘復雜機制有關，因其多種基因多種通路調控，所以此后應針對以上原因細化研究方案，探究它們具體調控關系。

DNA甲基化可以通過調控Th細胞因子失衡進而調控炎癥因子的基因表達[33]，比如DNA甲基化通過調控Th細胞因子失衡參與了類風濕炎早期炎癥的發(fā)生發(fā)展[34]。5-aza作為一種甲基化酶抑制劑，它被證明可以通過調節(jié)甲基化來調節(jié)miRNA的轉錄[35]及下調Th2表達抑制炎癥反應，減輕鼻黏膜損傷，緩解AR大鼠過敏性癥狀[36]，例如之前發(fā)現(xiàn)miR-126在甲基化酶抑制劑作用下表達降低[37]。本研究用5-aza干預大鼠后顯示大鼠模型中5-aza低劑量組miR-126、miR-326和miR-155表達水平降低，所以5-aza作為甲基化酶抑制劑還可以調控miR-126、miR-326和miR-155的表達水平，且調控作用與5-aza劑量正相關。此外，免疫組化結果顯示，與哮喘組相比，IFN-γ蛋白表達水平在5-aza低劑量組表達升高而5-aza高劑量組中并未升高，這表明5-aza對IFN-γ的調控作用是雙向的；GATA3和ROR-γ表達水平在哮喘組表達升高在5-aza 干預之后下降；Foxp3表達水平在5-aza 干預之后升高，因此，5-aza作為甲基化酶抑制劑可以調控IFN-γ、GATA3、ROR-γ和Foxp3基因甲基化的表達。

綜上所述，在哮喘中，甲基化酶抑制劑5-aza可以調控miR-126、miR-326和miR-155的表達；甲基化酶抑制劑5-aza可以下調細胞因子GATA3、ROR-γ的表達以及上調Foxp3的表達，同時可通過調整5-aza的劑量雙向調節(jié)IFN-γ的表達。 miR-326與 GATA3和 ROR-γ表達呈正相關； miR-326和 miR-155 與 Foxp3表達呈負相關，所以 miR-326、miR-155以及Th細胞因子可能存在交互關系，為表觀遺傳藥物治療哮喘提供了新的思路，miRNA和甲基化酶抑制劑可以作為BA和氣道敏感反應的有效切入點，為哮喘中表觀遺傳藥物的研究開闊了思路。