田紅軍 徐喜媛 呂娜 楊敬平

膿毒癥(Sepsis)是重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)病人最常見的死亡原因之一[1-2]，因其是感染、燒傷、休克等多種危重癥的并發(fā)癥而難以診斷。目前臨床上采用SOFA[Sequential (Sepsis-Related) Organ Failure Assessment]評分法，相比SOFA帶有的主觀性，生物標(biāo)志物是在實驗室測得，結(jié)果更具客觀性。社區(qū)獲得性肺炎(Community-Acquired Pneumonia, CAP)指在醫(yī)療機構(gòu)外罹患的肺炎,屬呼吸系統(tǒng)常見疾病,發(fā)病率及病死率均較高。膿毒癥(Sepsis)是由宿主對感染的免疫反應(yīng)失調(diào)而引起一種危及生命的器官功能障礙,是CAP嚴(yán)重并發(fā)癥之一,與其不良預(yù)后密切相關(guān)。成人CAP 醫(yī)院外因感染引起的肺實質(zhì)炎性疾病在全球各年齡組都有較高的發(fā)病率和死亡率。因此，尋找特異性的生物標(biāo)志物對于膿毒癥的早診斷、早治療以及降低患者死亡率，提高生存率具有重要意義。本研究將我院收集到的社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者與正常人血液樣本，非靶向地鑒定出與社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥相關(guān)的脂質(zhì)分子；對其進(jìn)行多維統(tǒng)計分析，篩選出具有代表性的脂質(zhì)分子和相關(guān)代謝物，探索將血液中的脂質(zhì)分子與其代謝相關(guān)基因作為診斷社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥的生物學(xué)標(biāo)志物的價值。

資料與方法

一、 研究對象

選取2018 年 09 月至2020 年09月期間，于內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科確診的30例社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者(CAP+sepsis組)和16例健康體檢志愿者(NC組)的外周血液標(biāo)本3mL。納入標(biāo)準(zhǔn)如下[3]：(1)臨床資料齊全；(2)患者符合美國重癥醫(yī)學(xué)會制定的膿毒癥和社區(qū)獲得性肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)無其他系統(tǒng)性疾??；(4)患者及其家屬簽訂知情同意書。排除肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病以及免疫系統(tǒng)受損者。根據(jù)社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者感染指征和重癥患者SOFA評分(SOFA評分≥2分者認(rèn)定為膿毒癥患者)為CAP+sepsis組。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)通過(編號2019MER-053)。

二、主要儀器與試劑

采用UHPLC Nexera LC-30A液相色譜儀(日本島津)與UPLC-Q-TOF/MS質(zhì)譜儀(美國Waters)聯(lián)用進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析。分別使用正負(fù)離子掃描模式對樣本進(jìn)行檢測，色譜柱為ACQUITY UPLCC柱(10 mm x 2.1 mm，1.7m，美國Waters公司)。甲醇、乙腈(HPLC級，Merck公司)；乙酸銨(HPLC級)、內(nèi)標(biāo)脂肪酸FFA16.d3和FFA18.d3(Sigma公司)；磷脂酰膽堿PC38:0、磷脂酰乙醇胺PE34:0、溶血性磷脂酰膽堿LPC19:0、鞘脂SM12:0、甘油三酯TAG45:0和神經(jīng)酰胺Cer17:0(美國Avanti Polar Lipids公司)。血液總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Promega公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列(見表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物列表

三、方法

1. 樣品制備 將EDTA抗凝血3mL室溫下放置25分鐘，在低溫(4℃)下1000g離心15min，上層的血漿移至離心管中，-80℃凍存?zhèn)溆茫籒C組留取的標(biāo)本同樣方法處理。兩組所得血清在液相色譜儀下行分析，檢測其脂質(zhì)分子及其相關(guān)代謝產(chǎn)物含量。

2. 質(zhì)譜分析條件 電噴霧電離樣本，利用正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，電噴霧電子源質(zhì)譜正離子模式檢測：lysophosphatidylcholine(LPC)、lysophosphatidylethanolamine (LPE)及Ceramide(Cer)；負(fù)離子模式檢測：lysophosphatidic acid(LPA)、lysophosphotidylserine(LPS)及sphingsine-1-phosphate(S1P)。質(zhì)譜ESI源參數(shù)設(shè)置：離子源氣1(Gas1)為45，氣簾氣(Cur)為25，離子源氣2(Gas2)為50，電噴霧電壓5500V(正離子模式)/-4500V(負(fù)離子模式)，離子源溫度500℃。對其優(yōu)化的每個脂質(zhì)相對應(yīng)的母離子、特征子離子、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)，建立質(zhì)譜mutipul reactions monitor(MRM)模式，并進(jìn)行定量檢測。

3． PCR 通過PCR檢驗樣本RNA表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，t檢驗進(jìn)行組間分析，檢驗水平P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過Spearman相關(guān)性分析、主成分分析及其神經(jīng)網(wǎng)分析，得到影響明顯的脂質(zhì)代謝物組成成分。社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥診斷中脂質(zhì)分子相關(guān)變化，通過曲線分析評估其準(zhǔn)確性。

結(jié) 果

一、社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者與健康者年齡及性別的比較

兩組患者性別、年齡上的比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(見表2)。

表2 CAP+sepsis組與NC組年齡及性別的比較

二、社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者與健康者血清中脂質(zhì)含量差異

通過對CAP+sepsis組與NC組血清中脂質(zhì)各組分進(jìn)行液相-氣相分析發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)成分含量有明顯差異的有14種，除棕櫚酰神經(jīng)酰胺(Cer16:0)、硬脂酰神經(jīng)酰胺(Cer18:0)和花生酸神經(jīng)酰胺(Cer20:0)在CAP+sepsis組中含量明顯升高(P<0.003)，其余組分NC組均明顯低于病例組(P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中，LPE18:1、LPE16:0及LPA18:2差異最明顯(見表3)。

表3 CAP+sepsis組與NC組脂質(zhì)含量差異比較

三、CAP+sepsis組各脂質(zhì)組分的等級相關(guān)性分析

CAP+sepsis組各脂質(zhì)組分含量與社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥分別進(jìn)行等級相關(guān)分析(Spearman)，Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0與社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥為正相關(guān)，且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。其余脂質(zhì)組分均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中LPA18:2、LPA20:4、LPC16:0、LPC18:2、LPE16:0、LPE18:2、LPE18:1負(fù)相關(guān)系數(shù)均大于0.6，所有14組數(shù)據(jù)Spearman相關(guān)均有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01,見表4)。

表4 CAP+sepsis組各脂質(zhì)組分的等級相關(guān)性分析(n=30)

四、CAP+sepsis組各脂質(zhì)組分主成分分析

對CAP+sepsis組各脂質(zhì)14個組分進(jìn)行主成分分析(PCA),KMO檢驗系數(shù)0.61，Bartlett檢驗P<0.001,提示可以進(jìn)行主成分分析。結(jié)合碎石圖(見圖1)，取特征值>1的前4位主成分，分別解釋24.1%、15.9%、11.4%及9.8%的總數(shù)據(jù)變異，解釋了61.1%的數(shù)據(jù)變異(累積貢獻(xiàn)率為61.1%，見表5)。應(yīng)用旋轉(zhuǎn)成份矩陣分析顯示：LPA 18:2、LPE 18:0及S1P反應(yīng)第1主成分變化，LPA20:4、LPE18:1及LPC18:1反應(yīng)第二主成分變化，LPC18:2反應(yīng)第3主成分、CER16:0反應(yīng)第4主成分變化。

表5 CAP+sepsis組變量相關(guān)矩陣的特征根值

圖1 CAP+sepsis組14個脂質(zhì)組分主成分分析碎石圖

五、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)多層感知器網(wǎng)絡(luò)分析

各個因子變量網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果在網(wǎng)絡(luò)中變量重要性排名(見圖2)。重要性標(biāo)準(zhǔn)化百分比分別為：LPE18:2(100.0%)、LPE16:0(91.2%)、LPA20:4(84.3%)、LPE18:1(73.3%)對膿毒血癥非常重要。

圖2 CAP+sepsis組神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析各因子重要性排名

六、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因定量分析

脂質(zhì)代謝由復(fù)雜的調(diào)控通路構(gòu)成，不同的組織、細(xì)胞參與脂質(zhì)代謝的基因也不同。通過上述脂質(zhì)代謝分析表明，LPA、LPE在膿毒癥患者中有較大意義。所以，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血液中參與LPA、LPE代謝相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)量，其中，合成LPA的ATX、LIPH基因，分解LPA的LPP基因，合成LPE的PLA2G2A、PLA2G15基因，分解LPE的LPEAT2基因，明確LPA、LPE相關(guān)代謝通路關(guān)鍵酶學(xué)的基因變化。結(jié)果顯示：合成LPA的ATX和LIPH基因在NC組及CAP+sepsis組分別為1.011 ± 0.057和1.010 ± 0.053及0.352 ± 0.033和0.357 ± 0.018，NC組明顯高于CAP+sepsis組(t=9.99和11.75，均P<0.0001)。分解LPA的LPP基因在NC組及CAP+sepsis組分別為0.366 ± 0.050及1.013 ± 0.060，NC組明顯低于CAP+sepsis組(t=8.299，P<0.0001)。合成LPE的PLA2G2A和PLA2G15基因在NC組及CAP+sepsis組分別為1.031 ± 0.094和1.018 ± 0.070及0.032±0.003和0.390±0.021，NC組明顯高于CAP+sepsis組(t=10.56和8.645，均P<0.0001)。分解LPE的LPEAT2(t=9.077，P<0.0001)基因在NC組及CAP+sepsis組分別為0.870±0.080及0.128±0.015，NC組也明顯高于CAP+sepsis組。

七、膿毒癥相關(guān)的脂質(zhì)組分對膿毒癥的診斷價值分析

過主成分分析篩選出與膿毒癥相關(guān)性較強的4種脂質(zhì)代謝組分LPA 18:2、LPA 18:0(與第1主成分)、LPE 18:1、LPE16:0 (神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)前2名)及其代謝通路關(guān)鍵酶：合成LPA的ATX、LIPH基因，分解LPA的LPP基因，合成LPE的PLA2G2A、PLA2G15基因，分解LPE的LPEAT2基因，采用ROC曲線對這些指標(biāo)進(jìn)行了膿毒癥診斷的靈敏度和特異分析，結(jié)果LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0曲線下面積分別為：0.95、0.89、0.87及0.86，LPA18:2的診斷準(zhǔn)確性較高(見圖3)。

圖3 CAP+sepsis組LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0 ROC曲線

討 論

膿毒癥具有極高的發(fā)病率和死亡率[3]，很難早期發(fā)現(xiàn)和快速確診，當(dāng)出現(xiàn)了明顯的癥狀，往往很快惡化為多臟器功能衰竭，增加死亡風(fēng)險。因此，找到具有高敏感性、高特異性的生物標(biāo)志物，是實現(xiàn)對社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥的早診斷、早治療、提高其生存率及改善其預(yù)后的關(guān)鍵措施。目前報道的膿毒癥相關(guān)生物標(biāo)志物已經(jīng)超過了170種，包括細(xì)胞因子類、細(xì)胞表面分子、補體、凝血因子、急性時相反應(yīng)蛋白等，但沒有可以被認(rèn)定為社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥特異性的診斷標(biāo)記物[1-4]。雖然C反應(yīng)蛋白和血清降鈣素原二者均為感染、炎癥相關(guān)因子，且較為常用，但也不具備特異性的診斷價值。

有研究表明，脂質(zhì)的代謝變化與膿毒癥存在相關(guān)性[5-6]，提示其可能成為潛在診斷社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥的生物標(biāo)志物。血液樣本是一個復(fù)雜的基質(zhì)，包含一大群甘油脂 (GPs)、糖脂 (SLs)、膽固醇酯 (CEs) 和三酰基甘油 (TGs)。由于血流與生物體中的大多數(shù)器官及其單個細(xì)胞有關(guān)。在比較血漿和血清時，據(jù)報道，在血清中可以表征比血漿中更穩(wěn)定的脂質(zhì)譜[5-6]。因此，更可靠分析的潛在替代方法是在血清中進(jìn)行脂質(zhì)研究和方法開發(fā)。結(jié)合上述研究背景，本研究通過脂質(zhì)代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了11種在社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者血漿中含量明顯降低的脂質(zhì)(見表3)，其中LPA 18:2、LPE 18:1及LPE16:0 是與社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥關(guān)聯(lián)最緊密的脂質(zhì)分子，對社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥的預(yù)測準(zhǔn)確率也高于LPC。同時還存在3種在社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者血漿中含量明顯升高的脂質(zhì)，即Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0，與Drobnik等的結(jié)果一致[7]，其可能與炎癥因子誘發(fā)的鞘磷脂代謝增強相關(guān)[8]；

最近的研究表明，LPA 能夠減輕膿毒癥狀態(tài)下的器官損傷，在膿毒血癥中具有抗炎作用[9]。血液中的LPA主要通過兩種途徑合成，ATX與LIPH分別以LPC與PA為底物合成LPA[12]。與此同時，LPP可參與降解LPA，來維持LPA動態(tài)平衡。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血液中ATX與LIPH表達(dá)量明顯降低，而LPP表達(dá)量升高，LPA合成減少并被大量降解，與血液中LPA測定含量降低呈一致性，提示膿毒癥狀態(tài)下LPA動態(tài)平衡被打破，不能有效維持其代謝水平，促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。

溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE, Lys phosphatidylethanolamine) 是一種脂質(zhì)代謝物，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，參與各種免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。研究結(jié)果表明LPE對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激具有顯著的保護(hù)作用。細(xì)胞內(nèi)的LPE可通過磷脂酶A2(PLA2)合成[10-11]，并經(jīng)乙酰化酶降解[12-13]。PLA2家族有多個成員，其中的PLA2G2A與PLA2G15參與了細(xì)胞LPE合成，而參與LPE分解酶卻只有LPEAT2[14-15]。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血液中PLA2G2A與PLA2G15表達(dá)量均降低，而LPEAT2表達(dá)量也顯著降低，提示膿毒癥患者血液中的LPE可能存在其他代謝途徑參與疾病發(fā)生發(fā)展。

本研究經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[8]，發(fā)現(xiàn)了社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥患者的外周血中，脂質(zhì)分子的含量與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了顯著的變化，膿毒癥患者中LPA 18:2、LPA 20:4、S1P、LPC 16:0、LPC 18:2、LPC 18:1、LPC 18:0、LPE 16:0、LPE 18:2、LPE 18:1、LPE 18:0低表達(dá)，而Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0呈高表達(dá)；這種多種脂質(zhì)小分子的含量變化提示膿毒癥過程中脂質(zhì)代謝差異可能與炎癥反應(yīng)中不同的脂質(zhì)代謝過程相關(guān)。而其中LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0 四種脂質(zhì)代謝組分參與了膿毒癥的瀑布式炎癥反應(yīng)，經(jīng)統(tǒng)計分析LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0曲線下面積分別為：0.95、0.89、0.87及0.86，LPA18:2具有極高的膿毒癥診斷敏感性，提示其可以作為社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥診斷的候選生物標(biāo)志物。但其特異性與敏感性還需要進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模驗證，才能為臨床診斷社區(qū)獲得性肺炎合并膿毒癥提供準(zhǔn)確、新型的生物標(biāo)志物。

本研究局限性：納入病例的數(shù)量較少，因此研究可能存在局限性，后續(xù)實驗可以增加病例數(shù)量。