朱婷 董星宇 陳詩雨 吳曉紅 葉明君 李白坤 李慶林

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，肺腺癌則是較為多見的肺癌類型[1]。研究顯示，高凝狀態(tài)及其所致的血栓栓塞是影響肺癌病人治療效果的重要因素[2]；因為血液高凝狀態(tài)不但可增強循環(huán)癌細胞的存活力，還會增強循環(huán)癌細胞向血管內(nèi)皮細胞(VEC)的黏附力，為癌細胞進一步實現(xiàn)跨內(nèi)皮遷移提供便利[3]。導致癌癥患者血液高凝狀態(tài)的原因復雜，進入血管的癌細胞可通過活化血小板和(或)血管內(nèi)皮細胞等，促進高凝狀態(tài)形成[4]。同時，活化血小板又可將癌細胞包裹起來增強其存活力，并介導癌細胞向VEC黏附等[5]。因此，肺腺癌細胞與血小板共孵育后，可能會增加VEC損傷和促凝表型形成，但相關研究卻非常鮮見。本文采用共培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)微環(huán)境，觀察肺腺癌細胞H1299與血小板串擾對VEC促凝表型形成的作用。

資料與方法

一、 材料和試劑

人肺腺癌細胞株(H1299)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)均來自安徽中醫(yī)藥大學科研技術中心。β-actin(Abbkine)，細胞間黏附分子(ICAM-1)(absin), 血管細胞黏附分子(VCAM-1)(Affinity)，P-選擇素受體(PSGL-1)(Bioss)。山羊抗兔IgG(absin)，山羊抗鼠IgG(absin)，1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(維森特生物技術有限公司)，雙抗、胰酶(碧云天)，CGS緩沖液(氯化鈉3.6g、D-葡萄糖3.3g、檸檬酸鈉2.165g，試劑溶解于95mL超純水，調(diào)節(jié)PH至6.5，定容至500mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，0.22um濾頭過濾，37℃水浴預熱)。

二、 實驗方法

本研究獲得安徽省中醫(yī)院倫理委員會批準(2020AHZY-01)。

1 細胞培養(yǎng)

HUVEC和H1299細胞復蘇后，置于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，取狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

2 洗滌血小板制備

取健康成年志愿者靜脈全血10mL，枸櫞酸抗凝，200g離心20min后，吸出富血小板血漿，800g離心10min后，棄上清，以預熱過濾后的CGS重懸PLT沉淀，600g離心5min，洗滌3次后，以預熱的無血清培養(yǎng)基重懸血小板，將濃度調(diào)至3.0×108個/mL后進行實驗研究。

3 條件培養(yǎng)基制備

H1299條件培養(yǎng)基(CM_H)制備：H1299細胞長至70%～80%密度時，更換含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取上清，3000r/min離心10min，0.22um微孔過濾后，-20℃保存?zhèn)溆谩1299和血小板共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基制備(CM_HP)：H1299細胞長至70%～80%密度時，更換含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，同時加入洗滌血小板(血小板：瘤細胞=200)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取上清，3000r/min離心10min，0.22um微孔過濾后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 鬼筆環(huán)肽染色

取狀態(tài)良好的HUVEC接種于24孔板爬片，加入不同種類條件培養(yǎng)基孵育24h后，取出24孔板，PBS洗3遍，每次5min，多聚甲醛固定20min，PBS洗3遍，每次5min， 0.1%曲拉通透化5min，PBS洗3遍，每次5min，每孔加入FITC-鬼筆環(huán)肽染色液200 uL，室溫避光染色20min，棄染色液，PBS洗3遍，每次5min，DAPI染色10min，PBS洗3遍，每次5min，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

5 酶聯(lián)免疫吸附測定

將CM_H、CM_HP和PLT分別作用于HUVEC，24h后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書配置標準品，測定上清中的PS含量，450nm處測定OD值，根據(jù)標準曲線計算不同上清中的PS水平。

6 蛋白免疫印跡法

收集處理過的各組細胞，冰上裂解，提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，與Loading buffer混合，100℃，10 min煮沸，進行SDS凝膠電泳，200mA，轉膜2h，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，放入一抗，4℃條件下過夜，次日取出，與山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG室溫孵育2h，TBST漂洗后，曝光，以β-Actin為內(nèi)參分析蛋白表達水平。

三、 統(tǒng)計學方法

結 果

一、 H1299和血小板共培養(yǎng)促進HUVEC骨架改變

細胞骨架是調(diào)控細胞運動的重要因素，鬼筆環(huán)肽染色后采用激光共聚焦顯微鏡可觀察細胞骨架的改變情況。研究結果顯示，HUVEC組細胞骨架排列清晰，呈絲網(wǎng)狀；HUVEC+CM_H組邊緣不光滑，細胞骨架排列不清晰；HUVEC+CM_HP組細胞骨架排列不清晰，微絲部分缺失，出現(xiàn)絲狀偽足，HUVEC+PLT 組，HUVEC邊緣光滑，微絲有所減少，細胞形態(tài)有所變化(見圖1)。

圖1 鬼筆環(huán)肽染色的HUVEC細胞骨架(激光共聚焦顯微鏡，×100)

二、H1299和血小板共培養(yǎng)促進HUVEC上清PS的表達

由(圖2)可見，4組的PS表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=31.17，P<0.001)；且HUVEC+CM_HP組(2.66±0.06)的表達量高于HUVEC組(2.15±0.04)、HUVEC+CM_H組(2.26±0.07)和HUVEC+PLT組(2.34±0.05)，HUVEC+PLT組PS表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 HUVECPS的表達水平

三、H1299和血小板共培養(yǎng)促進HUVEC ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1的表達

ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1在HUVEC處于靜息狀態(tài)時低表達，與肺腺癌細胞和血小板共存時高表達。由(圖3)可見，CM_HP可促進HUVEC上述三種蛋白的表達，且各組間蛋白的表達差異均有統(tǒng)計學意義(ICAM-1：F=142.60，PSGL-1：F=56.53，VCAM-1：F=147.90，P<0.001)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，HUVEC+CM_HP組ICAM-1表達量(2.57±0.11)高于HUVEC(1.00±0.03)、HUVEC+CM_H(1.23±0.08)和HUVEC+PLT組(1.40±0.09)；HUVEC+CM_H和HUVEC+PLT組ICAM-1表達量均高于HUVEC組(P<0.001)。類似的，HUVEC+CM_HP組的PSGL-1(1.98±0.13)表達量高于HUVEC(1.00±0.02)、HUVEC+CM_H(1.26±0.07)和HUVEC+PLT組(1.34±0.04)；HUVEC+CM_HP組的VCAM-1(2.93±0.12)表達量也高于HUVEC(1.00±0.03)、HUVEC+CM_H組(1.12±0.05)和HUVEC+PLT組(1.17±0.16)(P<0.001)。提示，肺腺癌細胞和血小板共孵育，可能促進了內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，有利于內(nèi)皮細胞促凝表型形成。

圖3 H1299和血小板共孵育上調(diào)的ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1 蛋白表達量

討 論

轉移是導致肺腺癌治療失敗的主要原因之一[6]，探究影響肺癌發(fā)生轉移的因素，有利于針對性地進行干預。研究表明，內(nèi)皮細胞促凝表型的形成可能與PS外翻有關[7]，促凝表型的主要特征是細胞骨架改變，并伴隨ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1等黏附分子表達量增加等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞和血小板自身，都具有一定的促進內(nèi)皮細胞黏附蛋白表達的作用[8]?？紤]到肺腺癌細胞可活化血小板，活化并結合內(nèi)皮細胞，血小板對肺癌的轉移具有重要作用[9]，血小板可促進肺癌細胞的活力與增殖，促進腫瘤生長[10]；因此，肺腺癌細胞與血小板共培養(yǎng)，可能促進內(nèi)皮細胞形成促凝表型[11]。

本研究結果顯示，與H1299和血小板共孵育后，內(nèi)皮細胞骨架發(fā)生改變、上清中PS的表達量以及內(nèi)皮細胞中的幾種黏附分子表達量均顯著增加；而單獨與肺腺癌細胞或血小板共孵育的內(nèi)皮細胞骨架改變情況、PS和黏附分子表達也較單純內(nèi)皮細胞組增加，但程度明顯低于H1299和血小板共孵育組。提示，與H1299細胞和血小板共培養(yǎng)可能通過某種途徑，促進了內(nèi)皮細胞結構的改變和相關分子的表達，進而誘發(fā)HUVEC促凝表型形成；研究結果同Chuang P.C.以及Falanga A.的研究結果相似[5,12]。但也有研究提示活化的血小板可通過保護內(nèi)皮細胞免受腫瘤細胞的滲透而抑制腫瘤轉移[8]。出現(xiàn)這種不一致現(xiàn)象的原因目前尚不完全清楚，可能與細胞株和實驗條件等不同有關[13]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)與H1299細胞和血小板共培養(yǎng)可能為內(nèi)皮細胞促凝表型的形成提供了便利，抑制腫瘤細胞-血小板-血管內(nèi)皮細胞間的相互作用，可能有助于改善肺腺癌的高凝狀態(tài)，抑制腫瘤細胞跨內(nèi)皮遷移的實現(xiàn)，進而降低腫瘤轉移風險。誠然，本研究結果還有待進一步開展動物實驗和臨床試驗去深入探究。