俞婷婷 鄭勝男 蔣澄 謝宇 尹震宇 郭愛斌 李會(huì)穎

軟腦膜轉(zhuǎn)移(leptomeningeal metastasis，LM)是肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。目前臨床上針對(duì)LM主要存在兩個(gè)瓶頸，一是LM缺乏有效治療手段；二是沒有特異性標(biāo)志物可用于LM早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。既往研究發(fā)現(xiàn)外周血中分泌型糖蛋白Dickkopf-1(DKK1)在肺癌早篩、診斷和預(yù)后等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[2-3]。對(duì)LM患者而言，腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)樣本比血液樣本更能準(zhǔn)確地表征顱內(nèi)腫瘤的真實(shí)狀態(tài)[4-5]。目前還沒有關(guān)于LUAD伴L(zhǎng)M患者CSF中DKK1表達(dá)情況的研究報(bào)道。因此，本研究通過比較LUAD伴L(zhǎng)M患者與非瘤對(duì)照者CSF中DKK1的表達(dá)差異，以及鞘內(nèi)化療期間DKK1動(dòng)態(tài)變化情況，首次探討分析了DKK1與LM的發(fā)病、耐藥性、預(yù)后相關(guān)性，以期能為L(zhǎng)M個(gè)體化治療提供可靠指標(biāo)，同時(shí)為難治型LM患者尋找更有針對(duì)性的靶點(diǎn)提供新思路和理論依據(jù)。

資料與方法

一、資料來源

本研究篩選了2019年12月至2021年05月期間就診于南京鼓樓醫(yī)院的經(jīng)病理明確診斷的LUAD患者，經(jīng)頭顱(magnetic resonance imaging，MRI)或腦脊液細(xì)胞學(xué)明確診斷為L(zhǎng)M，進(jìn)行規(guī)律的培美曲塞鞘內(nèi)化療，最終入組20例患者。此外，納入非瘤對(duì)照患者10例。所有入選患者均簽署知情同意書，本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(2019-263-02)并同意開展本研究。

二、臨床樣本的收集

將研究對(duì)象分為對(duì)照組(Con組)和LM組，LM組依據(jù)RANO(Response Assessment in Neuro-Oncology)療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)具體分為：疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)，部分緩解(partial response，PR)，完全緩解(complete response，CR)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)。為便于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析，本研究將療效評(píng)價(jià)為PR、CR和SD的患者統(tǒng)一歸入于疾病控制(disease control，DC)組。DC組的樣本按照治療周期的不同具體分為：DC-0C組(鞘內(nèi)化療前)，DC-2C組(兩周期鞘內(nèi)化療后)，DC-4C組(四周期鞘內(nèi)化療后)。

主要的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18歲至75歲；初診經(jīng)病理診斷為肺腺癌，且經(jīng)臨床、病理、影像學(xué)評(píng)估確診為肺癌軟腦膜轉(zhuǎn)移，至少有一個(gè)可評(píng)價(jià)病灶；美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)評(píng)分≤3分；無明顯出血癥狀、出血性疾病及血栓性疾?。粺o明顯心肝腎功能異常。主要的排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)培美曲塞過敏或禁忌癥患者；無法控制的癲癇；同時(shí)或既往有其它腫瘤病史；妊娠、哺乳期婦女。

入組患者經(jīng)充分評(píng)估后行規(guī)律的培美曲塞鞘內(nèi)化療。詳細(xì)收集患者相關(guān)的臨床、病理、影像學(xué)資料。每2周期鞘內(nèi)化療后復(fù)查頭顱+全脊柱磁共振、胸部CT、腫瘤標(biāo)志物等，結(jié)合患者癥狀，參照RANO標(biāo)準(zhǔn)判斷治療療效。收集LM患者治療前后不同時(shí)間點(diǎn)的腦脊液標(biāo)本6～10mL，對(duì)照組經(jīng)腰椎穿刺留取腦脊液6～10mL。所有樣本統(tǒng)一保存于-80℃冰箱中。

對(duì)所有入組患者進(jìn)行隨訪，記錄患者的無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)。PFS為從鞘內(nèi)化療之日起至疾病發(fā)生進(jìn)展或觀察截止時(shí)間(2021年05月)為止，生存期以月表示。

三、檢測(cè)方法

所用試劑與儀器：Human DKK1 Quantikine ELISA Kit 定量檢測(cè)試劑盒為美國(guó)R&D Systems產(chǎn)品(DKK100B)，最低檢測(cè)值：0.948pg/mL，檢測(cè)范圍：9.4～600.0pg/mL，酶標(biāo)儀為Tecan公司產(chǎn)品。

使用前將ELISA試劑盒和CSF樣品平衡至室溫，按照試劑盒說明書具體操作如下：①每孔加入50μL樣本稀釋液；②每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照或CSF樣本50μL，封板，室溫溫育120min；③自動(dòng)洗板機(jī)洗板4次；④加入酶結(jié)合物200μL，室溫溫育120min后洗板4次；⑤每孔加入底物液200μL，室溫避光顯色30min；⑥加入終止液50μL，于30min內(nèi)用酶標(biāo)儀分別在450nm、540nm處測(cè)定各孔的吸光度值OD450、OD540值。儀器軟件根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD450、OD540值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)方程，通過樣本OD450、OD540值計(jì)算濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。DKK1濃度與PFS呈非正態(tài)分布，用M(Q1,Q3)表示，多組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)及曲線下面積(the area under ROC curve，AUC)評(píng)估腦脊液中DKK1濃度診斷的敏感性和特異性。

結(jié) 果

一、基本情況

共納入20例LUAD伴有LM的患者，年齡33～62歲，中位年齡48.4歲，男10例，女10例，男女比例1：1，共11 (55%)例，有吸煙史。基礎(chǔ)突變中，共10 (50%)例，患者為EGFR L858R突變，4 (20%)例，為EGFR Del-19突變，另外6 (30%)例，為間變性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 突變。從診斷為L(zhǎng)UAD至發(fā)生LM，時(shí)間為8～63個(gè)月，中位時(shí)間25個(gè)月；診斷LM時(shí)患者的ECOG評(píng)分為1～3分。20例患者入組前評(píng)估肺部原發(fā)灶均穩(wěn)定，6(30%)例合并腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移 (brain metastasis, BM)，其中5例曾行全腦放療 (whole brain radiation therapy, WBRT)。此外，大部分患者曾接受過培美曲塞聯(lián)合鉑類的雙藥化療(17/20，85%)以及抗血管生成治療(16/20，80%)。為加強(qiáng)顱外病灶的控制、發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的效果，鞘內(nèi)化療的同時(shí)患者均口服靶向藥物，從而確保入組患者的最大生存獲益，主要包括奧希替尼(Osimertinib)和勞拉替尼(Lorlatinib)。相關(guān)內(nèi)容(見表1)。

表1 LUAD伴L(zhǎng)M患者的基本情況[n(%)]

二、CSF中DKK1的表達(dá)

20例LUAD患者CSF中DKKl含量較10例非瘤對(duì)照升高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖l，表2)。DC亞組及PD亞組較對(duì)照組DKK1表達(dá)均上調(diào)，但PD組升高更為顯著(P<0.05)(圖2，表2)。DKKl的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙史、ECOG評(píng)分、基礎(chǔ)突變類型、發(fā)生腦膜轉(zhuǎn)移的時(shí)間、是否合并腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移、全腦放療史、化療史、抗血管生成治療史、TKIs類型等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P>0.05)。在DC組鞘內(nèi)化療的過程中，DKKl的表達(dá)水平整體呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)，其中DC-0C組與DC-4C組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖3，表3)。ROC分析表明診斷LUAD-LM的最佳CSF中DKK1臨界濃度為139.36pg/mL，此時(shí)其敏感性為70%，特異性為80%，AUC為0.745(圖4)。

圖3 DC組患者不同治療周期后的CSF中DKK1的表達(dá)

圖4 LM組和對(duì)照組患者CSF中DKK1濃度ROC分析

表2 鞘內(nèi)化療前各組CSF中DKK1濃度對(duì)比

圖1 LM組與對(duì)照組CSF中DKK1濃度對(duì)比

圖2 鞘內(nèi)化療前各組CSF中DKK1的不同表達(dá)

表3 DC組患者不同治療周期后CSF中DKK1濃度的動(dòng)態(tài)變化

三、DKK1的表達(dá)與預(yù)后

DC組患者PFS為4.5～11個(gè)月，中位PFS為6個(gè)月，PD組PFS為1～6.5個(gè)月，中位PFS為2.25個(gè)月，兩者之間存在明顯差異(P<0.01)。以139.36pg/mL為截?cái)帱c(diǎn)，DKK1高表達(dá)組(16/20)患者PFS為1～8.5個(gè)月，中位PFS為4.5個(gè)月；低表達(dá)組(4/20)患者PFS為4.5～11個(gè)月，中位PFS為7.25個(gè)月，兩組的PFS比較差異具有顯著性(P<0.05)。關(guān)聯(lián)性分析顯示，CSF中DKK1和PFS之間有顯著相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.528，P=0．017)。PFS與患者年齡、性別、吸煙狀況、ECOG評(píng)分、基礎(chǔ)突變、發(fā)生腦膜轉(zhuǎn)移的時(shí)間、有無合并腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移、既往治療史、合并TKIs等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

目前LUAD伴L(zhǎng)M的治療仍較為棘手，早期的診斷及精準(zhǔn)的調(diào)整個(gè)體化的治療方案對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要，但目前臨床上仍缺乏靈敏診斷、動(dòng)態(tài)療效監(jiān)測(cè)的有效方法。腦脊液細(xì)胞學(xué)是目前LM診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，具有100%的特異性，但是由于技術(shù)水平、樣本量有限等諸多原因，存在較多的假陰性，靈敏度僅75%，并且無法有效反應(yīng)治療過程中的療效[6]。頭顱及全脊柱MRI是另外一個(gè)重要的診斷手段，但是由于LM病灶可隨著CSF循環(huán)彌散在整個(gè)中樞系統(tǒng)內(nèi)，較少形成實(shí)性的腫瘤病灶，很多患者在疾病前期MRI無法顯示，敏感性僅有70%，而且在治療前后也無法對(duì)比病灶的大小評(píng)估療效[7]。腦脊液的常規(guī)、生化檢測(cè)及腫瘤標(biāo)志物由于較低的敏感性和特異性，臨床上僅作為輔助的診斷指標(biāo)[8]。因此，臨床上迫切需要一種更為可靠的特異性標(biāo)志物。

Dickkopf(DKK)蛋白家族主要包括DKK1-4四種亞型，其中DKK1為一種分泌型糖蛋白可以抑制Wnt信號(hào)通路[9]。Wnt信號(hào)通路在生物進(jìn)化過程中高度保守，可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9-11]。值得注意的是，DKK1在不同癌癥中卻發(fā)揮著截然不同的作用[9]。一些研究證實(shí)DKK1是一種抑癌基因，在乳腺癌、腸癌等腫瘤組織中低表達(dá)，可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[9]。與此相反，DKK1被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展，在肺癌患者的肺癌組織和血清中DKK1呈現(xiàn)高水平的表達(dá)[3]。但是目前尚無肺癌LM患者腦脊液中DKK1表達(dá)情況的相關(guān)研究。

BBB的存在使得顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶具有獨(dú)特的局部微環(huán)境，因此相較于血液、胸水等，CSF是LM更為準(zhǔn)確的液體活檢樣本[4-5]。我們首次對(duì)DKK1的表達(dá)情況及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)，經(jīng)各組的差異性分析有如下發(fā)現(xiàn)：(1)DKK1的表達(dá)水平在LM組和對(duì)照組CSF中存在顯著差異，提示DKK1與LM的發(fā)生密切相關(guān)，并可作為L(zhǎng)M診斷的潛在標(biāo)志物，擁有較好的敏感性和特異性；(2)與DC組基線狀態(tài)相比，兩周期和四周期鞘內(nèi)化療后的LM患者CSF外泌體中DKK1的表達(dá)水平逐漸下降，說明DKK1與LM的鞘內(nèi)治療緊密相關(guān)，可能成為監(jiān)測(cè)療效的可靠指標(biāo)；(3)相比于DC組，PD組中DKK1上調(diào)更為顯著，DKK1高表達(dá)組PFS劣于低表達(dá)組，進(jìn)一步說明DKK1與LM耐藥性、不良預(yù)后相關(guān)。因此，上述研究結(jié)果均提示CSF中的DKK1對(duì)LUAD伴L(zhǎng)M的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮了重要的作用。

既往有研究表明在非小細(xì)胞肺癌中，DKK1可抑制β-catenin的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中游離的非磷酸化β-catenin增多、核定位增加，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核中與T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor，LEF)復(fù)合物相結(jié)合，激活下游靶基因，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移[12]。例如，β-catenin核定位增加，可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生[12]，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥性，因此我們推測(cè)這可能與LM的發(fā)生及耐藥相關(guān)，有待后續(xù)相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究通過檢測(cè)分析LM患者CSF中DKK1的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化，首次證實(shí)，其與LM的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，在指導(dǎo)用藥、監(jiān)測(cè)耐藥、評(píng)估療效及判斷預(yù)后等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究樣本量有限，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論，以期為L(zhǎng)UAD伴L(zhǎng)M尋找可靠的早期診斷、預(yù)后評(píng)估指標(biāo)及新的防治策略，推進(jìn)更為精準(zhǔn)的個(gè)體化的腫瘤治療。