何海鷗，史林艷

（珠海伊斯佳科技股份有限公司，廣東珠海 519000）

地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓 Pheretima aspergillum （E.Perrier）、通俗環(huán)毛蚓 P.vulgaris Chen、威廉環(huán)毛蚓 P.guillelmi （Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓P.pectinifera Michaelsen 的干燥體[1]。可入藥，該藥材在我國已有悠久的使用歷史，其性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱止痙、平肝熄風(fēng)、通經(jīng)活絡(luò)、平喘利尿的功效；用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等癥[2]。地龍的化學(xué)成分主要包括：氨基酸類化合物、核苷類化合物、二肽類化合物、有機酸類化學(xué)物、無機元素、蛋白類化合物及其他類[3]。其有非常多的藥理作用：抗炎鎮(zhèn)痛、治療哮喘、化痰止咳、鎮(zhèn)靜催眠及抗驚厥、預(yù)防糖尿病腎臟疾病、促進創(chuàng)傷愈合、降脂等。其中抗炎鎮(zhèn)痛和促進創(chuàng)傷愈合的功效讓其可應(yīng)用在舒緩類的化妝品中，在《已使用化妝品原料名稱目錄》（2021 版）中有參環(huán)毛蚓提取物，本文通過誘導(dǎo)人體皮膚紅斑模型法和開放使用法兩種評價方法，探究地龍多肽DHEPP舒緩和修護皮膚的功效。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

地龍多肽DH-EPP，INCI中文名：參環(huán)毛蚓提取物，疏松淡黃色粉末（重慶東寰科技提供）；十二烷基硫酸鈉（SLS，分析純99%）；10%乳酸溶液；精華A（不含地龍多肽DH-EPP），精華B（含0.5%地龍多肽DH-EPP）（精華A和B其他成分均相同，且不含其他舒緩修護功效成分）；皮膚經(jīng)皮水分流失測試儀（Delfin）；皮膚膚色測試儀（Delfin）；皮膚分析儀（visia 7）；溫濕度記錄儀；斑試器，分析天平。

1.2 測試環(huán)境

溫度（21±1）℃，濕度40 %～ 60%。

1.3 實驗方法

1.3.1 誘導(dǎo)人體皮膚紅斑模型法

在封閉性的條件下，用3%十二烷基硫酸鈉（SLS）溶液斑貼作用于皮膚24h，待斑貼去除后，利用人工誘導(dǎo)皮膚紅斑反應(yīng)。通過測量皮膚在誘導(dǎo)后及使用產(chǎn)品后不同的皮膚參數(shù)（如經(jīng)表皮失水率和皮膚紅色素），評價產(chǎn)品舒緩修護功效。

1.3.1.1 研究對象

受試者納入應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：18~60 歲的健康成年人；無嚴(yán)重慢性消耗性疾?。ㄈ缦⑻悄虿〉龋?，無皮膚病變、炎癥、濕疹等；雙前臂屈側(cè)皮膚完好，沒有任何疤痕，損傷，膚色不均等影響評估因素；近一月內(nèi)未曾使用激素類藥物及免疫抑制劑者；最近三個月受試部位未參加其他臨床試驗者；孕期或哺乳期的女性應(yīng)排除在外；測試前簽署志愿者知情同意書。

1.3.1.2 誘導(dǎo)人體特應(yīng)性皮炎模型

根據(jù)要求招募33名受試者，受試者應(yīng)在測試環(huán)境中休息30min后再開展測試。在受試者雙前臂屈側(cè)處，根據(jù)隨機要求在左或右前臂屈側(cè)標(biāo)記受試區(qū)域，受試面積不得少于3cm×3cm。受試區(qū)域根據(jù)隨機選擇分為對照組、測試組區(qū)域。將0.020~0.025mL的誘導(dǎo)物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的SLS溶液）置于濾紙片，放入斑試器小室內(nèi)。將加有誘導(dǎo)物的斑試器用低致敏膠帶貼敷于受試者的預(yù)設(shè)受試區(qū)，用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上，持續(xù)24h[4]。在移除斑試器后的6h為皮膚紅斑誘導(dǎo)反應(yīng)期，不進行任何處理。

1.3.1.3 指標(biāo)測定

由專業(yè)研究員對受試者誘導(dǎo)受試部位的皮膚狀況進行詢問和檢查，最終納入31人，完成測試31人。

受試者按要求在各紅斑反應(yīng)測試區(qū)使用產(chǎn)品，早晚各一次，連續(xù)使用測試產(chǎn)品10d，在使用產(chǎn)品后5d±1d、10d±1d對經(jīng)皮失水量、皮膚紅區(qū)a*值進行回訪測試，并記錄。

1.3.2 人體開放使用法

通過乳酸刺痛測試篩選出皮膚不耐受人群，通過測量皮膚使用產(chǎn)品前及后不同的皮膚參數(shù)（經(jīng)皮失水量和皮膚紅區(qū)面積），評價產(chǎn)品舒緩修護功效。

1.3.2.1 研究對象

受試者納入應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：乳酸刺痛試驗篩選呈陽性者；受試者處于敏感肌的非發(fā)病期；顏面部皮膚完好，沒有任何疤痕，損傷，膚色不均等影響評估因素；其他基礎(chǔ)條件同紅斑模型法。

1.3.2.2 半主觀評價乳酸刺痛試驗

在測試環(huán)境下，將50μL 10%乳酸溶液涂抹于鼻唇溝，分別在涂抹后2.5min和5min時詢問受試者的自覺癥狀，按4分法進行評分（0分為沒有刺痛感，1分為輕度刺痛，2 分為中度刺痛，3 分為重度刺痛），并將兩次分?jǐn)?shù)相加，總分≥3分者為乳酸刺痛反應(yīng)陽性。納入乳酸刺痛試驗陽性受試者33人，最終完成測試31人（其中有2人因個人原因退出）。

1.3.2.3 指標(biāo)測定

使用面部圖像分析儀對顏面部進行圖像采集分析皮膚紅區(qū)面積，利用皮膚探頭測量皮膚經(jīng)皮失水量，并將測試數(shù)據(jù)記錄。受試者按要求半臉使用不同產(chǎn)品，樣品組（精華B）與對照組（精華A）隨機分布，早晚各一次，連續(xù)使用產(chǎn)品28d，在使用產(chǎn)品后14d±1d、28d±1d進行上述指標(biāo)測試，并再次進行乳酸刺痛試驗。

1.4 統(tǒng)計分析

計算分析參數(shù)的初始值/其他測量時間點/其他組間的數(shù)值，使用專業(yè)統(tǒng)計軟件SPSS21.0進行分析。如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用 t 檢驗或方差分析方法進行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計；如數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用秩和檢驗方法進行統(tǒng)計；統(tǒng)計方法均采用雙尾檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘導(dǎo)人體皮膚紅斑模型法

用3% SLS溶液誘導(dǎo)手臂內(nèi)側(cè)皮膚紅斑，基于儀器測量經(jīng)皮水失水量（TWEL）如表1所示。

表1 手臂經(jīng)皮失水量（g·m-2·h-1）差異性分析

從上述數(shù)據(jù)可知，不管使用精華A或精華B，紅斑區(qū)的經(jīng)皮失水量在第5d和第10d都顯著降低（P＜0.05），皮膚存在自身修護作用；使用精華B的部位經(jīng)皮失水量顯著低于精華A，在第5d和第10d改善率分別達到49.19%（P＜0.001），57.38%（P＜0.05），在第10d的經(jīng)皮失水量已恢復(fù)至建模前的狀況，說明添加了地龍多肽的精華B有更好的舒緩修護的功效。

用皮膚顏色測試儀測試代表紅區(qū)的皮膚a值，a值越小，說明紅區(qū)改善效果越明顯，測試結(jié)果如表2所示。

表2 手臂皮膚a值差異性分析

從上述數(shù)據(jù)可知，使用精華B的部位在第5d與建模6h的基值相比就表現(xiàn)出了非常顯著的改善（P＜0.001），精華A和精華B在使用第5d和第10d紅區(qū)效果改善均有顯著性差異，說明精華B有較好的改善皮膚紅區(qū)的效果。

2.2 人體開放使用法

通過產(chǎn)品使用前后半主觀評價乳酸刺痛試驗評分、皮膚經(jīng)皮失水量和visia圖像分析皮膚紅區(qū)面積的變化情況來評估舒緩和修護效果，數(shù)據(jù)如表3所示。

由上述數(shù)據(jù)可知，從乳酸刺痛試驗評分、經(jīng)皮失水量和皮膚紅區(qū)面積幾個指標(biāo)來看，使用精華B 28d后與精華A相比，效果都有顯著性差異（P＜0.05），說明在人體開放使用法中，添加了地龍多肽的精華B對皮膚有更好的舒緩修護效果。

3 結(jié)論

研究表明，通過誘導(dǎo)人體皮膚紅斑模型法和開放使用法評估添加了0.5%地龍多肽DH-EPP的精華對皮膚舒緩修護的功效，在兩種人體功效評價方法中，該精華與對照組相比，都表現(xiàn)了顯著性的舒緩修護效果，且兩種方法測試的趨勢一致。

表3 產(chǎn)品使用前后皮膚各測量指標(biāo)的差異性分析

4 討論

中藥地龍資源豐富，其蛋白多肽類成分含量高、毒性低，具有多方面的藥理作用，國內(nèi)外學(xué)者對地龍蛋白多肽類成分的研究也日益深入和廣泛，并開發(fā)出多種地龍蛋白多肽類產(chǎn)品，如地龍活性蛋白膠囊、地龍蛋白溶血栓膠囊、蚓激酶腸溶膠囊、多肽地龍蛋白等[4]。地龍多肽DH-EPP可溶解在水中，采用了特殊的酶解工藝，低溫分離制備，多肽分子量在5000道爾頓以下，具有高生物活性。本文通過誘導(dǎo)人體皮膚紅斑模型法和開放使用法對比評估添加了0.5%地龍多肽DH-EPP的精華B和不添加地龍多肽的精華A對皮膚的舒緩修護效果，在兩種測試方法中，測試的結(jié)果趨勢一致，說明地龍多肽DH-EPP有比較好的舒緩修護效果，為進一步擴展地龍多肽在化妝品中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。