梁 秋，劉相花，周德強(qiáng)，劉 偉，李 睿

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，準(zhǔn)確地說是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescen quantitative-polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)，是指在PCR體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[1～3]。熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要是癌癥的診斷、病原體檢測、基因缺陷性疾病檢測等方面[4，5]。目前，筆者所在單位投入使用的熒光定量PCR儀主要為進(jìn)口醫(yī)療設(shè)備，如美國Agilent、BIO-RAD和瑞典Roche公司的產(chǎn)品。各品牌型號的儀器基本原理一致，但是各自有其優(yōu)缺點(diǎn)；如果單純依賴價(jià)格優(yōu)勢來選擇醫(yī)療設(shè)備購置肯定不能滿足各種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需求，因此筆者主要基于日常工作實(shí)踐中收集的單位投入使用的幾大品牌熒光定量PCR儀功能信息等進(jìn)行分析，從儀器的基本結(jié)構(gòu)、性能參數(shù)與維護(hù)保養(yǎng)等方面來評價(jià)它們相互之間的差異，為以后工作中PCR儀維護(hù)保養(yǎng)及提高工作效率提供技術(shù)參考。

1 基本功能、結(jié)構(gòu)、性能參數(shù)比較

1.1 加熱模塊

加熱模塊根據(jù)儀器的溫度均一性、升降溫的方式和升降溫的速度來體現(xiàn)熒光定量PCR儀的性能[6]，是保證樣品擴(kuò)增效能的重要指標(biāo)之一。筆者所在單位使用的3個(gè)品牌中Roche Light Cycler96的溫控均一性為±0.2℃，精度高于BIO-RAD CFX96的±0.4℃和Agilent Stratagene Mx3000P的±0.25℃；升降溫方式三者都是Peltier半導(dǎo)體模式[7]；升降溫速度BIO-RAD CFX96的5.0℃/s，高于Roche LightCycler96的升溫速度（4.4℃/s）和降溫速度（2.2℃/s）、Agilent Stratagene Mx3000P的升降溫速度（2.5℃/s）。見表1。

表1 3種品牌熒光定量PCR儀加熱模塊技術(shù)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of heating module technical parameter in 3 brands of fluorescence quantitative PCR instrument

1.2 光源

光源是激發(fā)熒光染料，其強(qiáng)度和激發(fā)范圍影響擴(kuò)增目的基因的信號收集[8]。Agilent Stratagene Mx3000P的光源為石英鹵鎢燈，檢測光波長為350～700 nm；BIO-RAD CFX96為6個(gè)發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED），檢測光波長為450～730 nm；Roche LightCycler96的光源為1個(gè)LED，檢測光范圍為非連續(xù)光譜。石英鹵鎢燈的光比LED的激發(fā)范圍寬，強(qiáng)度強(qiáng)，可以選用的熒光染料品種就更多，更適合做多通道的定量PCR，但是LED光源的壽命要相對長一些。因?yàn)锽IO-RAD CFX96有6個(gè)LED光源，因此在強(qiáng)度和激發(fā)范圍上能夠彌補(bǔ)與石英鹵鎢燈的差異，設(shè)計(jì)最多5通道也優(yōu)于其他兩個(gè)品牌。見表2。

表2 3種品牌熒光定量PCR儀的光源技術(shù)參數(shù)比較Tab.2 Comparison of light source technical parameter of 3 brands of fluorescence quantitative PCR instrument

1.3 掃描模式

掃描模式是指儀器收集擴(kuò)增后樣品熒光信號的方式，常見的分為電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）照相和逐孔掃描兩種，包括檢測器和濾光系統(tǒng)[9]。3種不同品牌熒光定量PCR儀掃描模式的比較見表3。其中Agilent Stratagene Mx3000P的檢測器為光電倍增管（photo multiplier tube，PMT），具有靈敏度高、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但是成本高；BIO-RAD CFX96和Roche LightCycler96的檢測器均為LED，具有體積小、壽命長耐用的特點(diǎn)，區(qū)別為BIO-RAD CFX96每臺(tái)儀器具有6個(gè)LED，而Roche LightCycler96每臺(tái)儀器為單個(gè)LED。對應(yīng)的濾光系統(tǒng)Agilent Stratagene Mx3000P帶有4個(gè)激發(fā)光濾鏡和4個(gè)反射光濾鏡；BIO-RAD CFX96帶有6個(gè)激發(fā)光濾鏡和6個(gè)反射光濾鏡；Roche LightCycler96帶有3個(gè)激發(fā)光濾鏡和6個(gè)反射光濾鏡。Agilent Stratagene Mx3000P和BIO-RAD CFX96均使用逐孔掃描的信號收集模式，Roche LightCycler96則為CCD照相模式。信號通量，三者都是96孔。

表3 3種品牌熒光定量PCR儀掃描模式比較Tab.3 Comparison of scanning mode in 3 brands of fluorescence quantitative PCR instrument

2 維護(hù)保養(yǎng)

后期維護(hù)服務(wù)是儀器廠家保證用戶正常、高效運(yùn)行儀器，產(chǎn)出可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要保障。售后團(tuán)隊(duì)的人數(shù)、分布的區(qū)域范圍，都決定了用戶反饋問題后售后響應(yīng)速度。筆者單位目前BIO-RAD占比明顯高于其他品牌儀器，這跟筆者單位所在區(qū)域BIO-RAD的市場占有率較大有較大關(guān)系。

2.1 熒光定量PCR儀使用過程中的常見問題

①上電開機(jī)儀器無反應(yīng)。應(yīng)著重注意電源線是否接觸良好、保險(xiǎn)絲是否熔斷等問題[10]。②加熱或冷卻速度緩慢。這種情況很可能是控制器問題[10]。③半導(dǎo)體模塊主要用于加熱或制冷，常見問題是出現(xiàn)冷凝水、滴落水珠造成電路板短路等，使用過程中應(yīng)注意環(huán)境的溫度和濕度的適宜[10，11]。④灰塵影響散熱，縮短相關(guān)模塊的壽命問題[10]。

2.2 熒光定量PCR儀使用過程中的維護(hù)保養(yǎng)

①日常維護(hù)保養(yǎng)：使用潔凈抹布清潔儀器外觀，避免灰塵落入反應(yīng)裝置。②定期維護(hù)保養(yǎng)：根據(jù)品牌型號特性不同，由專業(yè)工程師每半年或1年對熱循環(huán)組件和光路系統(tǒng)，包括去污染、校準(zhǔn)溫度、光路等[12]進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。③質(zhì)量檢測：主要對熒光信號進(jìn)行檢測，以確保熒光定量PCR儀使用過程中的質(zhì)量滿足臨床要求，這通常由專業(yè)的檢測技術(shù)機(jī)構(gòu)來完成。

3 討論

綜上所述，從熒光定量PCR儀的幾個(gè)指標(biāo)的比較可知，筆者所在單位投入使用的BIO-RAD CFX96在性能和后期維護(hù)上都具有一定的地區(qū)優(yōu)勢，而需要做某種特殊激發(fā)光源的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)可以參考使用Agilent Stratagene Mx3000P或Roche LightCycler96，因?yàn)锳gilent Stratagene Mx3000P的石英鹵鎢燈光源具有更寬的激發(fā)范圍，適用的熒光染料也更全面，而Roche LightCycler96的光源具有不連續(xù)性，表明針對特定波長的激發(fā)光源特異性較高。

熒光定量PCR儀使用質(zhì)量直接關(guān)系到臨床的診斷結(jié)果，定期校準(zhǔn)、去污染維護(hù)等，直接關(guān)系到樣本質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。因此根據(jù)不同品牌型號的產(chǎn)品特點(diǎn)制定維護(hù)保養(yǎng)措施、制定檢測流程對醫(yī)院中熒光定量PCR儀的使用過程中的質(zhì)量控制與診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性、有效性都具有重要作用。

儀器設(shè)備維護(hù)團(tuán)隊(duì)成員應(yīng)該主動(dòng)收集儀器設(shè)備相關(guān)信息，建立完善儀器設(shè)備各項(xiàng)指標(biāo)及相應(yīng)維護(hù)責(zé)任人的信息錄入，便于后期追溯和處理。通過熒光定量PCR儀不同品牌型號差異性的比較，既使儀器設(shè)備維護(hù)團(tuán)隊(duì)成員熟知掌握不同產(chǎn)品的性能特點(diǎn)，又為臨床使用過程的維護(hù)保養(yǎng)與質(zhì)量控制措施提供了參考依據(jù)，提高熒光定量PCR儀的使用管理水平。