陳艷梅，劉琦石，王莉輝，張 哲，余詠宜

女性盆底功能障礙性疾病是常見的婦產科疾病，孕期及分娩引起盆底支持組織損傷是主要病因；組織學特征是盆底支持組織中平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMC）凋亡、膠原減少[1，2]。目前尚缺乏有效的治療手段。近些年，成體干細胞移植是受到越來越多關注的組織工程治療手段，在女性盆底功能障礙性疾病的治療中展現(xiàn)出積極應用前景[3]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是來源廣泛的成體干細胞之一，具有取材方便、自我更新、多向分化等特點，是用于組織工程治療理想的種子細胞。

盆底神經肌肉電刺激是治療盆底功能障礙性疾病的常用方式之一，新近有研究證實電刺激對干細胞的分化具有促進作用。根據(jù)Dong ZY的細胞實驗結果，電刺激通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路促進神經元干細胞向神經元分化[4]。在SMC分化的過程中，PI3K/Akt通路、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路起重要的調控作用[5]，但電刺激對干細胞向SMC分化的調控作用及機制尚不清楚。筆者以PI3K/Akt通路及ERK通路為切入點，通過細胞實驗探究電刺激調控BMSC向SMC分化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠5只，鼠齡8～10周，平均鼠齡9.12周（標準差0.28周）；體質量180～200 g。由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，生產許可證SCXK（滬）2018-0004。

1.1.2 主要試劑

PI3K抑制劑LY294002（簡稱LY）、ERK抑制劑PD98059（簡稱PD）（MCE，美國）；四唑化合物即3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑內鹽[（3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt，MTS]細胞增殖檢測試劑盒（Promega，美國）；CD44、CD29、CD45、CD34一抗（BD，美國）；平滑肌α肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle-myosin heavy chain，SM-MHC）、鈣調節(jié)蛋白（calpoin）一抗（Abcam，美國）；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK一抗（CST，美國）。

1.1.3 主要儀器

細胞電刺激裝置（型號microcontrol。北京久易科儀科技公司，中國）；細胞培養(yǎng)箱（型號Form311。Thermo，美國）；流式細胞儀（型號CytoFlex。Beckman Coulter，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（型號XRS。Bio-rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)

取大鼠脛骨及股骨的骨髓，采用干細胞分離液分離BMSC；在含有10%胎牛血清的達氏改良伊氏培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中原代培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液；待細胞匯合至70%時進行胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 骨髓間充質干細胞的鑒定

取第3代BMSC，制備成密度5×105/mL細胞懸液；將200μL細胞懸液加入1.5 mL離心管內，分別加入2μL CD44、CD29、CD45、CD34抗體，于4℃避光條件下孵育1 h。在流式細胞儀上檢測CD44、CD29、CD45、CD34的表達情況。

1.2.3 骨髓間充質干細胞的分組與干預

取第3代BMSC進行分組，即對照組、電刺激組、溶劑對照組、溶劑+電刺激組、LY+電刺激組、PD+電刺激組、si-NC組、si-NC+電刺激組、si-PI3K+電刺激組、si-ERK+電刺激組。每組重復5次。

對照組在DMEM中進行干預，連續(xù)10 d；電刺激組參照唐敏等[6]的研究給予電壓2 V、頻率2 Hz、脈寬5 ms的電刺激干預，2 h/d，連續(xù)10 d；溶劑對照組在含有0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM中進行干預，連續(xù)10 d；溶劑+電刺激組在含有0.1%DMSO的DMEM中進行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；LY+電刺激組在含有20μmol/L LY294002[7]的DMEM中進行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；PD+電刺激組在含有50μmol/L PD98059[8]的DMEM中進行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；si-NC組轉染NC siRNA，6 h后更換為DMEM并繼續(xù)培養(yǎng)10 d；si-NC+電刺激組轉染NC siRNA，6 h后更換為DMEM并進行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；si-PI3K+電刺激組轉染PI3K siRNA，6 h后更換為DMEM并進行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d；si-ERK+電刺激組轉染ERK siRNA，6 h后更換為DMEM并進行電刺激（條件同電刺激組），連續(xù)10 d。

1.2.4 骨髓間充質干細胞增殖活力的檢測

取干預后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天時對照組和電刺激組BMSC，采用MTS法細胞增殖檢測試劑盒進行實驗。按照試劑盒說明書進行操作并在酶標儀上檢測450 nm波長的光密度（optical density，OD）450值。

1.2.5 骨髓間充質干細胞中平滑肌細胞標志蛋白及信號通路蛋白的檢測

取干預后第10天時對照組和電刺激組BMSC，采用細胞裂解液對BMSC進行裂解，提取BMSC中的蛋白；檢測蛋白濃度后，將含有20μg蛋白的樣本加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠中進行Western blot實驗，用電泳分離不同相對分子質量的蛋白質后電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，室溫，孵育于5%脫脂牛奶1 h；4℃條件下孵育1∶1 000稀釋的α-SMA、SM-MHC、calpoin一抗、1∶2 000稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK一抗、1∶5 000稀釋的β-actin一抗過夜；次日室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到相應的蛋白質條帶。以β-actin條帶的灰度值為內參，計算α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平；以信號蛋白質相應總蛋白質的灰度值為內參，計算磷酸化信號蛋白質的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，采用均數(shù)±標準差表示，經正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞的鑒定

BMSC表面干細胞標志基因CD44、CD90的陽性率均在99%以上，而造血細胞表型標志基因CD45的陽性率僅0.1%，符合干細胞特性。見圖1。

2.2 電刺激對骨髓間充質干細胞增殖活力的影響

干預后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天時，對照組與電刺激組BMSC的OD450水平比較，差異無統(tǒng)計學意義 （t=0.171、0.2841、0.112、0.093，P＞0.05）。見圖2。

2.3 電刺激對骨髓間充質干細胞向平滑肌細胞分化的影響

干預后第10天時，電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 對照組與電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin表達水平的比較Tab.1 Comparison of BMSC expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin between control group and electrical stimulation group

2.4 電刺激對骨髓間充質干細胞中PI3K/Akt通路及ERK的影響

干預后第10天時，電刺激組BMSC中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的表達水平均高于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2。

表2 對照組與電刺激組BMSC中p-PI3K、p-Akt、p-ERK表達水平的比較Tab.2 Comparison of BMSC expression level of p-PI3K,p-Akt and p-ERK between control group and electrical stimulation group

2.5 PI3K抑制劑及ERK抑制劑對電刺激促進骨髓間充質干細胞向平滑肌細胞分化的影響

溶劑+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平均高于溶劑對照組（P<0.05）；LY+電刺激組、PD+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平均低于溶劑+電刺激組（P<0.05）。見表3。

表3 溶劑對照組、溶劑+電刺激組、LY+電刺激組、PD+電刺激組α-SMA、SM-MHC、calpoin表達水平的比較Tab.3 Comparison of expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin in solvent group,solvent+electrical stimulation group,LY+electrical stimulation group and PD+electrical stimulation group

2.6 敲低PI3K、ERK對電刺激促進骨髓間充質干細胞向平滑肌細胞分化的影響

si-NC+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平均高于si-NC組（P<0.05）；si-PI3K+電刺激組、si-ERK+電刺激組BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平均低于si-NC+電刺激組（P<0.05）。見表4。

表4 si-NC組、si-NC+電刺激組、si-PI3K+電刺激組、si-ERK+電刺激組α-SMA、SM-MHC、calpoin表達水平的比較Tab.4 Comparison of expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin in si-NC group,si-NC+electrical stimulation group,si-PI3K+electrical stimulation group and si-ERK+electrical stimulation group

3 討論

近些年，組織工程技術在組織修復中的作用受到越來越多關注，BMSC是組織工程中常用的種子細胞，用于心肌梗死[6，7]、脊髓損傷[8，9]、腦梗死[10，11]、腦外傷[12]等能夠促進組織修復、改善臟器功能。盆底功能障礙性疾病以盆底組織結構損傷為特征，包括壓力性尿失禁和盆腔器官脫垂，嚴重影響患者的生存質量。盆底支持組織中的SMC對維持盆底功能具有重要意義，進行干細胞移植并促進干細胞向SMC分化是近些年組織工程技術治療盆底功能障礙性疾病主要思路[13，14]。

干細胞具有多向分化潛能，施加一定的干預條件以促進干細胞向SMC分化在盆底功能障礙性疾病的治療中具有重要意義。電刺激是臨床上治療盆底功能障礙性疾病的常用手段，主要通過增強盆底肌肉功能起到治療作用[15，16]。干細胞的相關研究證實，電刺激是誘導干細胞分化的重要物理手段，在神經元干細胞向神經元細胞分化的過程中，電刺激起到促進作用[4]。筆者將電刺激用于BMSC的干預，旨在發(fā)揮電刺激調控干細胞分化的作用。在電刺激干預后通過檢測SMC標志蛋白α-SMA、SM-MHC、calpoin表達的方式評價SMC分化程度，結果顯示電刺激后BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平顯著增加，表明電刺激對BMSC向SMC的分化具有促進作用。

BMSC向SMC分化的調控機制涉及復雜的生物信號轉導網絡，其中PI3K/Akt通路、ERK通路是已知參與BMSC向SMC分化調控的信號通路。根據(jù)Wei S等[5]研究，激活PI3K/Akt通路和ERK通路對SMC的分化具有促進作用。另有電刺激相關的研究證實，電刺激對上皮細胞、內皮細胞中PI3K/Akt通路、ERK通路的激活具有促進作用[17～19]。筆者研究在使用電刺激對BMSC進行干預后觀察到細胞中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的表達水平顯著增加，表明電刺激對BMSC中PI3K/Akt通路、ERK通路的激活具有促進作用，調控上述信號通路可能是電刺激促進BMSC向SMC分化的分子機制。

為了進一步明確PI3K/Akt通路、ERK通路在電刺激促進BMSC向SMC分化中的作用，筆者分別通過使用信號通路抑制劑及轉染siRNA的方式進行驗證。LY294002和PD98059分別是目前使用最廣泛的PI3K抑制劑和ERK抑制劑，對兩種信號蛋白的磷酸化具有抑制作用，進而抑制信號通路的激活。在電刺激干預的同時加用信號通路抑制劑，細胞中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平顯著降低。轉染siRNA是特異性敲低基因表達的有效手段，在電刺激干預的同時轉染PI3K或ERK的siRNA，敲低PI3K或ERK的表達后，細胞中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表達水平顯著降低。以上結果表明信號通路抑制劑及敲低信號蛋白表達均能削弱電刺激對BMSC向SMC分化的促進作用，進而表明電刺激促進BMSC向SMC分化的作用與激活PI3K/Akt通路、ERK通路有關。