吳紅紅，劉紫薇，李偲，楊升，馮吉，李建平，孫光偉，孫敬國，陳振國，李亞東

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北 武漢 430062;2.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北 武漢 430030)

0 引言

高品質(zhì)煙葉的種植一直是煙草工業(yè)的技術(shù)要求，但尿素、含酸根化肥的不科學(xué)使用導(dǎo)致土壤嚴(yán)重酸化，產(chǎn)生煙株根系發(fā)育障礙，影響煙株生長、降低煙葉品質(zhì)等系列問題[1-2]，同時影響土壤微生物種群數(shù)量、氮磷鉀含量；眾多研究表明，煙草根系發(fā)育的好壞，將直接影響煙株的長相、長勢，進而影響煙草的產(chǎn)量、質(zhì)量及內(nèi)在品質(zhì)[8]，并且在常規(guī)偏酸或中性土壤種植中，通過施用有機肥能夠改良土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤保水保肥性能[2-4]、有效促進煙株的生長發(fā)育[5-8]，以及能促進煙株根系活力、增加煙草1級、2級和3級側(cè)根的長度、數(shù)量[9-14].但事實上，在山區(qū)的強酸性土壤中難以實現(xiàn)此目標(biāo)，煙葉種植基地通常不直接使用有機肥，而使用速效且含有較高比例硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的專用肥，以應(yīng)對土壤強酸性、高海拔低氣溫、煙株生長緩慢等問題；基于此現(xiàn)狀，以及在課題組前期研究基礎(chǔ)上，將蛋白廢棄物轉(zhuǎn)化為小分子多肽以提高其對煙株根系生長的速效性，研究是否可代替含有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的專用肥，為解決銨態(tài)氮對土壤的酸化板結(jié)、硝態(tài)氮經(jīng)過反硝化而產(chǎn)生溫室氣體等建立技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料烤煙品種為云煙87，于湖北省恩施州利川市柏楊壩鎮(zhèn)煙草基地種植,其土壤性質(zhì)為酸化黃黏土，測得pH為4.20，全氮、全磷、全鉀和全鈣含量分別為0.94、0.32、25.27和16.86 g/kg；所用肥料為多肽(實驗室自備),其pH為10.85，全氮、全磷、全鉀和全鈣含量分別為90.53、0.36、71.62和53.20 g/kg，煙草專用肥(來自利川煙草基地，N∶P2O5∶K2O含量為1.0∶1.5∶3.0).

1.2 煙草種植實驗設(shè)計田間采用大區(qū)對比試驗，每個處理共種植120株，采用單株重復(fù)原則，共120個重復(fù)，每畝(666.7 m2，全文同)植煙1 010株，株行距55 cm×120 cm.施肥處理方式如表1所示，以含氮量為基準(zhǔn)，N∶P2O5∶K2O為1.0∶1.5∶3.0，同時根據(jù)烤煙生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，采取其他栽培措施.

表1 不同處理施肥方式

3月15日播種，發(fā)苗用時55 d，5月10日移栽大田，6月1日開始進行根系活力的測定，不同時期各取一次，共6個時期，分別是:伸根期，團棵期，旺長期，現(xiàn)蕾期，打頂期和成熟期.在煙草成熟期進行根系長度和體積，根部氮磷鉀鈣含量，土壤pH及土壤微生物等指標(biāo)的測定.

1.3 樣品測定方法煙草根系活力測定采用TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)法[15]；根系長度采用標(biāo)尺進行測量；根系體積采用排水法測定；煙草根部氮磷鉀鈣含量參照王瑞新等[16]的方法進行測定；土壤pH采用國家標(biāo)準(zhǔn)進行測量[17]；土壤微生物群落組成采用高通量測序，將處理1、處理2、處理3及CK的土壤樣品送至武漢譜渡眾合生命科技有限公司進行測序.

1.4 數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和Origin 2019進行統(tǒng)計處理作圖，SPSS 23.0進行單因素方差分析，LSD多重比較(P<0.5為差異顯著).

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配多肽對煙草根系活力的影響各時期煙草根系活力的測定結(jié)果如圖所示.從圖1整體可看出同一處理的根系活力在各時期基本的變化趨勢相同，即從伸根期到團棵期，煙草根系活力呈現(xiàn)下降趨勢，從團棵期到打頂期則呈上升趨勢，在打頂期后又呈下降趨勢.復(fù)配多肽(處理3)的根系活力在大部分時期均高于其他處理.

從每個時期分析，在伸根期中，處理1的煙草根系活力為229.22 μg/(g·h),處理2的根系活力為188.56 μg/(g·h)，處理3的根系活力為223.34 μg/(g·h)，處理4的根系活力為239.34 μg/(g·h)，分別比CK(180.77 μg/(g·h))提高了26.80%、4.31%、23.55%、32.40%.由此可看出伸根期施加多肽可顯著增加煙草根系活力；由處理1和處理2可知施加多肽越多，根系活力越強.

在團棵期中，處理1、處理2、處理3、處理4的根系活力分別為74.35、93.27、73.27、82.42 μg/(g·h),比CK(84.53 μg/(g·h))分別提高了-12.04%、10.34%、-13.32%、-2.50%.結(jié)果顯示團棵期時僅處理2根系活力較高，說明單施多肽也可以提高根系活力，而處理1根系活力較低，可能是過量多肽抑制根系活力的緣故.

在旺長期中，處理1的根系活力為79.79 μg/(g·h),處理2為82.00 μg/(g·h)，處理3為103.05 μg/(g·h)，處理4為95.48 μg/(g·h)，比CK(90.89 μg/(g·h))分別提高了-12.21%、-9.78%、13.38%、5.05%.由結(jié)果可知，旺長期時僅單施多肽對根系發(fā)育效果不明顯，復(fù)配多肽效果顯著，這應(yīng)該是因為缺失磷肥和鉀肥，降低了煙草根系活力[18-19].復(fù)配多肽也比多肽作追肥的效果好，說明復(fù)配多肽的組合為最佳施肥方式.

在現(xiàn)蕾期中，處理1、處理2、處理3、處理4的根系活力分別為126.17、120.77、134.54、130.69 μg/(g·h),比CK(126.52 μg/(g·h))分別提高了-0.28%、-4.54%、6.34%、3.30%.結(jié)果表明現(xiàn)蕾期與旺長期類似，復(fù)配多肽對煙草根系效果最顯著.

在打頂期中，處理1的根系活力為125.58 μg/(g·h),處理2為141.61 μg/(g·h)，處理3為184.86 μg/(g·h)，處理4為154.56 μg/(g·h)，比CK(141.29 μg/(g·h))分別提高了-11.12%、0.23%、30.84%、9.39%.從上述結(jié)果可知，打頂期時復(fù)配多肽組根系活力最強，而處理2比處理1要高，可能是因為大量施加多肽對煙草根系活力沒有促進作用.

在成熟期中，處理1、處理2、處理3、處理4的根系活力分別為83.32 μg/(g·h)、89.21 μg/(g·h)、81.11 μg/(g·h)、73.26 μg/(g·h),比CK(76.80 μg/(g·h))分別提高了8.49%、16.16%、5.61%、-4.61%.經(jīng)分析可知，成熟期時處理1和處理2根系活力較強，單施多肽可在后期對根系活力起作用，但此時煙葉即將采摘，故對煙草發(fā)育效果較差；處理4與CK相比，根系活力略弱，但此時不影響煙草生長；從旺長期開始復(fù)配多肽對根系活力的影響效果一直較顯著.

以上結(jié)果表明，單獨施加多肽(處理1、處理2)在前期對煙草根系活力影響不明顯，后期才逐漸升高，但煙草生長發(fā)育受到較大影響；復(fù)配多肽(處理3)則對煙草根系活力有著顯著的促進作用，且將多肽作為追肥(處理4)施加也具有增加根系活力的作用.

2.2 復(fù)配多肽對煙草根系長度的影響在成熟期進行煙草根系長度測定，如圖2所示.處理1的煙草根系長度為47.47 cm,處理2為52.70 cm，處理3為56.17 cm，處理4為54.63 cm，比CK(54.37 cm)分別提高了-12.7%、-3.1%、3.3%、0.48%.由結(jié)果分析可知處理3，處理4與CK相比沒有顯著性差異，但處理3數(shù)值最高，說明復(fù)配多肽促進煙草根系伸長；處理1與處理2根系長度較短，由前面結(jié)果也知單獨施加多肽對于根系發(fā)育效果不顯著.以上結(jié)果表明成熟期時相較煙草專用肥，復(fù)配多肽對煙草根系長度有一定促進作用.

2.3 復(fù)配多肽對煙草根系體積的影響在成熟期進行煙草根系體積測定，如圖3所示.處理1、處理2、處理3、處理4的煙草根系體積分別為306.67、406.67、490.00、418.33 cm3,比CK(436.67 cm3)分別高了-29.77%、-6.87%、12.21%、-4.20%.分析可知成熟期時復(fù)配多肽的根系體積顯著高于其他處理，而處理4與CK相比沒有顯著性差異，處理1和處理2與CK有顯著性差異.以上結(jié)果表明，在成熟期時復(fù)配多肽對煙草根系體積有顯著作用.

2.4 復(fù)配多肽對根系氮含量的影響在成熟期進行根系氮含量測定，結(jié)果如圖4所示.不同處理根部氮含量分別為9.67，9.45，12.74，11.19 g/kg，比CK(11.32 g/kg)分別提高了-14.49%、-16.52%、12.54%、-1.15%.分析可知，處理3顯著高于其他處理，處理4與CK之間差異未達(dá)到顯著水平，處理1與處理2也沒有顯著差異.以上結(jié)果說明，成熟期時復(fù)配多肽顯著提升煙草根系氮含量.

2.5 復(fù)配多肽對根系磷含量的影響在成熟期進行根系磷含量測定，結(jié)果如圖5所示.不同處理的根部磷含量分別為1.93、2.22、2.88、2.31和2.49 g/kg，分析可知，處理3顯著水平最高，比CK提高了15.67%，處理1、2、4顯著低于CK，其中處理2與處理4之間沒有顯著差異.以上結(jié)果表明，復(fù)配多肽顯著提升煙草根系磷含量.

2.6 多肽對根系鉀含量的影響在成熟期進行根系鉀含量測定，結(jié)果如圖7所示.不同處理的根部鉀含量分別為23.86、18.46、30.04、24.35和28.17 g/kg，分析可知，處理3根部鉀含量高于其他處理，雖然與CK之間差異未達(dá)顯著水平，但比CK提高6.64%.以上結(jié)果表明相比煙草專用肥，復(fù)配多肽對成熟期根系鉀含量有一定促進作用.

2.7 多肽對根系鈣含量的影響在成熟期進行根系鈣含量測定，結(jié)果如圖7所示.不同處理根部鈣含量分別為29.67、18.09、29.06、26.14 g/kg，比CK(27.19 g/kg)分別提高了9.12%，-33.47%，6.88%，-3.86%，分析可知，處理1顯著高于其他處理，說明大量施加多肽可以提升根系鈣含量，處理3與處理1之間無顯著差異，與CK之間差異也沒有達(dá)到顯著水平,但高于CK，說明復(fù)配多肽可以提升根系鈣含量，另外處理4與CK之間無顯著差異，說明煙草專用肥作基肥，多肽作追肥的處理也可以達(dá)到全施煙草專用肥的效果.以上結(jié)果表明，施加多肽多少可以影響根系鈣含量，但綜合煙草根系數(shù)據(jù)，復(fù)配多肽更適合用于煙草根系生長發(fā)育.

2.8 多肽對種植土壤pH的影響在成熟期進行種植土壤pH測定，結(jié)果如圖8所示.不同處理的土壤pH值分別為4.78，4.86，5.13，5.06，5.03，分析可知，處理3、4和CK之間差異未達(dá)到顯著水平，但處理3的土壤pH值比CK提高0.10個單位，處理4比CK提高0.03個單位，處理1、2之間無顯著差異且低于其他處理.以上結(jié)果表明，相比煙草專用肥，復(fù)配多肽可提升煙草種植土壤pH值，煙草專用肥作基肥，多肽作追肥的處理也有一定作用，單獨施加多肽則不能明顯提升種植土壤pH值.

2.9 多肽對種植土壤微生物的影響在打頂期時取處理1(T100)、處理2(T60)、處理3(TPK)和CK(YF)進行種植土壤微生物多樣性的測定，結(jié)果如圖所示.圖9為對相對豐度排名前30位的土壤微生物物種組成進行的分析.前10位物種分別是:norank_JG30-KF-AS9豐度最高，占6.19%～13.12%；丘氏桿菌(Chujabacter, 0.81%～12.83%)、羅河桿菌(Rhodanobacter，2.51%～13.39%)、嗜酸菌(Acidthermus, 1.36%～2.66%)、norank_f_norank_o_Gaiellales, 1.24%～2.32%、norank_f_norank_o_norank_ c_norank_p_WPS,1.08%～2.13%)、芽孢桿菌(Bacillus，0.69%～2.09%)、JG30a-KF-32, 0.67%～1.84%)、norank_f_norank_o_EIsterales, 0.53%～1.53%) 和八疊球菌(Sporosarcina, 0.51%～1.69%).這10種微生物的相對豐度共占15.59%～53.60%.各樣本中norank_JG30-KF-AS9、丘氏桿菌、羅河桿菌的相對豐度均高于5%,共計達(dá)9.51%～39.34%,為優(yōu)勢微生物.

排名前10位的土壤微生物的相對豐度在施加多肽組和煙草專用肥組間大部分不存在顯著差異，有許多未知的菌群不了解其屬性與生長環(huán)境，其中芽孢桿菌和八疊球菌屬于革蘭氏陽性菌，適宜在偏中性或堿性的環(huán)境下生存，而施加多肽對其數(shù)量有一定提升作用，復(fù)配多肽相比CK分別提高了1.40%和1.18%.以上結(jié)果表明施加多肽對煙草種植土壤微生物群落物種組成在打頂期后均具有一定影響，且復(fù)配多肽可以提升耐堿細(xì)菌的數(shù)量，證明土壤酸度有所改善，這與土壤pH值變化一致.

4種處理12個土壤樣本中共檢測出630個微生物物種，通過圖10分析了4種處理土壤微生物群落所共有和特有的細(xì)菌屬，結(jié)果表明:打頂期后,處理1與CK土壤中共有的微生物為387個，處理1土壤中特有的微生物為10個，CK土壤中特有的微生物為5個；處理2與CK土壤中共有的微生物為404個，處理2土壤中特有的微生物為59個；處理3與CK土壤中共有的微生物為394個，處理3土壤中特有的微生物為6個.以上結(jié)果表明相比CK，施加多肽對土壤微生物多樣性具有一定影響，處理1增加了土壤中特有微生物群落，處理2和處理3增加了土壤微生物多樣性，特有微生物群落也有所增加.

3 結(jié)論

1)煙草種植以優(yōu)質(zhì)煙葉為第一指標(biāo)，而煙草根系發(fā)育旺盛是增長煙葉品質(zhì)的基礎(chǔ).相比煙草專用肥，復(fù)配多肽顯著提高煙草根系活力5.61%～30.84%；復(fù)配多肽組根系長度和體積在成熟期比CK分別提高3.3%和12.21%；且在根系氮、磷、鉀、鈣等方面分別比煙草專用肥提高了12.54%、15.67%、6.64%、6.88%.以上結(jié)果表明，復(fù)配多肽顯著促進煙草根系生長，這可為煙葉生長提供更充分的營養(yǎng).

2)強酸性土壤改良的主要指標(biāo)是pH，煙草專用肥含有的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮對土壤酸化沒有改善作用，而復(fù)配多肽組土壤pH值比CK提高0.10個單位，這與課題組前期研究結(jié)果一致[20]，且復(fù)配多肽不會造成土壤板結(jié)等問題，可用于強酸性土壤改良.

3)復(fù)配多肽還能提高強酸性土壤微生物多樣性，比煙草專用肥增加5個微生物群落，同時還增加了一種特有微生物群落.綜上所述，復(fù)配多肽對強酸性土壤條件下的煙草根系生長具有很好的調(diào)控效應(yīng)，還能降低土壤的酸度、改善土壤微生物多樣性，具有優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的肥料潛力，為土壤改良、優(yōu)質(zhì)煙葉種植、以及山區(qū)煙葉種植農(nóng)戶扶貧等建立技術(shù)基礎(chǔ)，也為煙草專用肥制備建立新的技術(shù)儲備，具有研究開發(fā)價值.