高坤鵬， 毛相朝*，2

（1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237）

甘油糖苷是糖基與甘油脫水縮合形成的一類糖苷化合物，和原本的糖基相比，它對(duì)于酸、堿、高溫都具有更好的穩(wěn)定性，還可作為中間產(chǎn)物去合成甘油糖脂等其他具有生理活性的化合物[1]。甘油葡萄糖苷能作為細(xì)胞激活劑改善皮膚狀態(tài)[2]，還能夠幫助抵御紫外線導(dǎo)致的氧化損傷[3]。甘油半乳糖苷表現(xiàn)出一定的抗炎效果[4]，同時(shí)，其?；a(chǎn)物半乳糖基甘油酯還能表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性[1]。天然來源的甘油糖苷多從植物或藻類中提取得到，但其含量和回收率通常比較低[5]。梁文輝等測定了藍(lán)藻培養(yǎng)液中甘油葡萄糖苷的含量，其質(zhì)量濃度僅為10～15 mg/L[6]。另一方面，天然來源的甘油糖苷種類有限，且多以混合物的形式存在，在一定程度上制約了其應(yīng)用。針對(duì)這些問題，人工合成特定種類的甘油糖苷是最有效的解決辦法。

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-glucosamine，NAG）是生物細(xì)胞內(nèi)許多重要多糖的基本組成單位[7]，在臨床上也可用于緩解炎癥性關(guān)節(jié)疾病，促進(jìn)軟骨損傷的愈合[8-9]，改善腸道消化吸收功能，促進(jìn)生長[10]，還可以調(diào)節(jié)胎兒心臟的生長發(fā)育[11]。最新的研究還表明，NAG對(duì)于新型冠狀病毒肺炎具有一定的療效，可以顯著降低死亡率，縮短病人住院時(shí)間[12]。因此，合成甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷對(duì)于進(jìn)一步增強(qiáng)其生理功能研究以及新型藥物的開發(fā)具有重要意義。

和化學(xué)合成法相比，酶法合成甘油糖苷不需要多步保護(hù)和去保護(hù)步驟，且具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少的優(yōu)點(diǎn)[1]。Kurakake等利用半乳糖苷酶催化對(duì)硝基苯基半乳糖苷和甘油發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成了甘油半乳糖苷，轉(zhuǎn)化率達(dá)到27.7%[13]。Zhang等構(gòu)建了多酶體系通過磷酸解和轉(zhuǎn)糖基作用，以蔗糖和甘油為底物合成了甘油葡萄糖苷，蔗糖轉(zhuǎn)化率為89%[14]。段培楓等利用異源表達(dá)了蔗糖磷酸化酶的重組枯草芽孢桿菌作為全細(xì)胞催化劑，催化蔗糖和甘油生成甘油葡萄糖苷，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.1%[15]。和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)相比，逆水解反應(yīng)直接以廉價(jià)易得的單糖為底物，僅催化一步反應(yīng)就可以生成目的產(chǎn)物和水，沒有多余的副產(chǎn)物，更有利于目的產(chǎn)物的分離純化。有研究者使用半乳糖苷酶催化半乳糖和甘油發(fā)生逆水解反應(yīng)合成了甘油半乳糖苷，轉(zhuǎn)化率達(dá)到55.88%[16]，經(jīng)過活性炭吸附和G-15柱層析對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行純化后，產(chǎn)物純度達(dá)到97.80%[17]。然而，并非所有糖苷酶都能夠催化逆水解反應(yīng)，陳寶莉克隆了多個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 （N-acetylglucosaminidase，NAGase）并對(duì)其逆水解活性進(jìn)行篩選，最終只有兩個(gè)NAGase能夠通過逆水解反應(yīng)合成幾丁寡糖[18]。

作者在前期克隆表達(dá)和催化特性篩選的基礎(chǔ)上獲得了一個(gè)能夠催化NAG和甘油發(fā)生逆水解反應(yīng)的NAGase。該酶的編碼基因來自桿菌狀鏈霉菌（Streptomyces bacillaris ATCC 15855T），異源表達(dá)宿主為大腸桿菌BL21（DE3）。利用鎳離子親和層析法獲得純酶后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并對(duì)該酶催化甘油和NAG合成甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷（glyceryl N-acetyl-glucosamine，GNAG）的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為其功能研究和應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桿菌狀鏈霉菌：山東省海洋微生物菌種保藏與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供；Phanta Max Super-Fidelity DNA聚 合 酶、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit、2×Taq Master Mix（Dye Plus）：南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；快速質(zhì)粒小提試劑盒：北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒：Omega公司產(chǎn)品；大腸桿菌Trelief?5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：北京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物sbnag2550-F：5′-agcaaatgggtcgcggatccatgtcgcccacgc--gaggtgc-3′，sbnag2550-R：5′-gtgcggccgcaagcttgccc gcgctgcccgtc-3′，28a-F：5′-aagcttgcggccgcactcgag-3′，28a-R：5′-ggatccgcgacccatttgctgtcc-3′：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品合成。

硫酸卡那霉素（kanamycin，Kana）、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-1-thiogalactopyranoside，IPTG）：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；鎳離子親和層析柱填料：北京全式金生物科技有限公司產(chǎn)品；聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel，PAGE）快速制備試劑盒：上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；彩虹180廣譜蛋白質(zhì)Marker、NAG：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；超濾離心管（相對(duì)分子質(zhì)量30 000）：美國密理博公司產(chǎn)品；對(duì)硝基苯基-N-乙酰氨基葡萄糖苷（p-nitrophenyl N-acetyl-glucosaminide，pNP-NAG）、對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；針式過濾器：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

T960 PCR儀、超凈工作臺(tái)：力新儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；DHP9051生化培養(yǎng)箱：上海一恒儀器科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Multiskan FC全波長酶標(biāo)儀：Thermo Scientific公司產(chǎn)品；水浴搖床：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；LC-20A高效液相色譜儀（示差檢測器）：日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SbNag2550序列分析SbNag2550重組蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小及等電點(diǎn)等性質(zhì)預(yù)測使用在 線 服 務(wù) 器ExPASy ProtParam Server（https：//web.expasy.org/protparam/），進(jìn) 化 親 緣 關(guān) 系 分 析 使 用MEGA 7.0。

1.3.2 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)前期從山東省海洋微生物菌種保藏與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心購買了桿菌狀鏈霉菌，并對(duì)其進(jìn)行了全基因組測序，通過氨基酸序列預(yù)測分析，從中找到了一個(gè)假定的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段sbnag2550。利用添加了同源臂的引物對(duì)該片段進(jìn)行擴(kuò)增后與線性化的pET-28a（+）進(jìn)行同源重組，經(jīng)過陽性克隆驗(yàn)證和二代測序，將在大腸桿菌Trelief?5α細(xì)胞中構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒提取并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞。

1.3.3 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將該重組工程菌在試管中活化后按照1%的體積分?jǐn)?shù)接種至LB培養(yǎng)基（添加質(zhì)量濃度為50 mg/L的Kana），于37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG后于20℃培養(yǎng)24 h。收集菌體后用20%培養(yǎng)液體積的超純水重懸菌體，360 W超聲破碎10 min。8 000 r/min離心20 min除去細(xì)胞碎片后將上清液過膜獲得粗酶液。粗酶液經(jīng)鎳離子親和層析柱吸附后用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫，利用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況和純化效果。

1.3.4 SbNag2550的酶活力測定方法以pNPNAG為反應(yīng)底物，通過405 nm下測定SbNag2550水解底物產(chǎn)生pNP的量來計(jì)算其酶活力。反應(yīng)時(shí)在470 μL緩沖液中加入10 μL酶液，混合均勻后于水浴鍋中孵育2 min，加入20 μL底物溶液（10 mmol/L）并吹打均勻，計(jì)時(shí)5 min后加入500 μL的氫氧化鈉溶液（50 mmol/L）終止反應(yīng)。吸取200 μL反應(yīng)液于96孔板中測定吸光度，計(jì)算反應(yīng)體系中生成pNP的總量。1個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol pNP所需要的酶量。

1.3.5 SbNag2550的酶學(xué)性質(zhì)研究選擇25～70℃對(duì)SbNag2550的最適溫度進(jìn)行測定，結(jié)果以最高酶活力的百分比（即相對(duì)酶活力）表示；在最適溫度及其幾個(gè)臨近溫度下測定酶活力隨時(shí)間的變化曲線，定時(shí)取樣直至60 h，評(píng)估其熱穩(wěn)定性，結(jié)果以各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)所取樣品占初始酶活力的百分比（即相對(duì)殘余酶活力）表示；選擇pH 4.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和pH 6.0～8.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（濃度均為100 mmol/L）測定SbNag2550的最適pH。pH穩(wěn)定性同樣在pH 4.0～8.0進(jìn)行測定，取樣周期為60 h，結(jié)果呈現(xiàn)方式與上文一致。選擇不同金屬離子的氯鹽及EDTA二鈉來探究金屬離子對(duì)該糖苷酶活性的影響，作用濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L。以不添加金屬離子條件下測定的酶活力為對(duì)照，其余樣品按其占對(duì)照酶活力的百分比（即相對(duì)酶活力）表示。

1.3.6 SbNag2550催化合成GNAG甘油與NAG質(zhì)量比為5∶1，SbNag2550用量為20 U/g（以對(duì)pNPNAG的水解活性計(jì)），體系含水量與NAG體積質(zhì)量比為10 mL∶1 g，反應(yīng)體系密封后于50℃、180 r/min反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后煮沸10 min滅酶，取樣100 μL，加入900 μL去離子水進(jìn)行稀釋，利用0.45 μm針式過濾器除去不溶性雜質(zhì)后用于高效液相色譜和質(zhì)譜檢測。液相色譜檢測計(jì)算其轉(zhuǎn)化率，色譜柱選擇Shodex Sugar KS801（300 mm×8 mm，6 μm），柱溫設(shè)定為75℃，上樣體積為20 μL，以純水作為流動(dòng)相1 mL/min進(jìn)行洗脫。質(zhì)譜檢測條件：正離子模式，掃描電壓為100～500 eV。

1.3.7 GNAG合成反應(yīng)條件優(yōu)化稱取不同質(zhì)量的甘油和一定質(zhì)量的NAG于反應(yīng)瓶中，使甘油與NAG質(zhì) 量 比 為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，SbNag2550用量（以NAG質(zhì)量計(jì)）為20 U/g，體系中含水量（以NAG質(zhì)量計(jì)）為10 mL/g。反應(yīng)體系密封后于50℃、180 r/min反應(yīng)24 h。通過液相色譜檢測反應(yīng)體系中NAG和GNAG的相對(duì)含量以計(jì)算其轉(zhuǎn)化率，得到最適甘油添加量。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)反應(yīng)體系含水量（4～10 mL/g，以NAG質(zhì)量計(jì)）、反應(yīng)體系pH（4.6～6.6）、反應(yīng)溫度（40～60℃）、加酶量（5～30 U/g，以NAG質(zhì)量計(jì)）進(jìn)行了優(yōu)化，并測定了不同反應(yīng)時(shí)間（12～144 h）下的轉(zhuǎn)化率。

1.3.8 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

式中：X為反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，%；A1為液相色譜檢測GNAG的相對(duì)峰面積；A2為液相色譜檢測NAG的相對(duì)峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbNag2550的序列分析及克隆表達(dá)

SbNag2550的編碼序列長度為1 611 bp，編碼了536個(gè)氨基酸，該序列已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫，Genbank登錄號(hào)為BK059888。SbNag2550屬于糖苷水解酶20家族，進(jìn)化親緣關(guān)系分析結(jié)果（見圖1）表明其與來源于雙歧桿菌和肺炎鏈球菌的糖苷水解酶序列最為相似，這暗示了SbNag2550也是典型的細(xì)菌來源的糖苷酶，與其實(shí)際來源相一致。

圖1 SbNag2550的進(jìn)化親緣關(guān)系分析Fig.1 Phylogenetic analysis of SbNag2550

經(jīng)預(yù)測，SbNag2550的等電點(diǎn)為5.35，相對(duì)分子質(zhì)量為58 600。該酶可以在鎳離子親和層析柱吸附后由100 mmol/L咪唑洗脫下來，利用SDS-PAGE檢測了SbNag2550的表達(dá)情況和純化結(jié)果，結(jié)果（見圖2）表明該酶的相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)測結(jié)果一致。

圖2 SDS-PAGE檢測SbNag2550的純化結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified SbNag2550

2.2 SbNag2550的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 SbNag2550的最適溫度及熱穩(wěn)定性SbNag2550最適溫度測定結(jié)果見圖3（a），該酶催化pNP-NAG水解的最適溫度為50℃。同時(shí)，該酶在25℃至70℃都表現(xiàn)出較好的活性（大于最適溫度下催化活性的60%），在45～60℃相對(duì)酶活力均能達(dá)到90%。該酶還表現(xiàn)出了優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，相關(guān)結(jié)果見圖3（b）。同樣是鏈霉菌來源的SvNag2557在55℃孵育12 h后僅保留10%左右的酶活力[19]，而SbNag2550在相同溫度下孵育60 h后仍能保留將近90%的相對(duì)殘余酶活力。

圖3 SbNag2550的酶學(xué)性質(zhì)Fig.3 Enzymatic properties of SbNag2550

2.2.2 SbNag2550的 最 適pH及pH穩(wěn) 定 性SbNag2550的最適pH測定結(jié)果如圖3（c）所示，該酶在pH 6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中催化活性最高，該酶還表現(xiàn)出比較強(qiáng)的pH依賴性，只有在弱酸性環(huán)境中才能較好地催化通用底物的水解，這也與大多已報(bào)道的NAGase一致[19-21]。pH穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖3（d）所示，該酶在pH 4.0和pH 8.0分別在孵育3 h和12 h時(shí)完全失活，而在pH 5.0、6.0和7.0則表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，尤其在pH 6.0孵育60 h后仍保留90%以上的酶活力。

2.2.3 金屬離子對(duì)SbNag2550酶活力的影響如表1所示，Na2-EDTA在兩種濃度下都沒有表現(xiàn)出明顯的抑制效果，表明該酶不是一個(gè)金屬依賴型酶。大多數(shù)金屬離子對(duì)SbNag2550的活性影響不大，高濃度的Zn2+對(duì)其表現(xiàn)出一定的抑制作用，這一點(diǎn)與來源于短小芽孢桿菌的BpNagZ比較相似[22]。Fe3+和Mn2+對(duì)該酶的酶活力表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的促進(jìn)作用，尤其是高濃度的Mn2+，可以使酶活力達(dá)到對(duì)照組的兩倍以上，高濃度的Ni2+和Co2+也表現(xiàn)出一定促進(jìn)作用。來源于申氏桿菌的rJB10Nag同樣屬于糖苷水解酶20家族，低濃度（1 mmol/L）的Fe3+和Mn2+同樣能促進(jìn)其酶活力，但10 mmol/L的Fe3+和Mn2+卻在一定程度上抑制了該酶的酶活性[23]。

表1 金屬離子對(duì)SbNag2550活性的影響Table 1 Effect of metal ions on activity of SbNag2550

2.3 SbNag2550催化逆水解合成甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷

2.3.1 甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷的鑒定用高效液相色譜法對(duì)合成反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果如圖4（a）所示，底物甘油和NAG的出峰時(shí)間分別為8.50 min和6.72 min，產(chǎn)物GNAG的出峰時(shí)間為6.27 min。從圖中可以看出液相色譜能夠較好地分離底物和產(chǎn)物，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物相對(duì)含量的檢測，為后續(xù)反應(yīng)條件的優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖4（b）所示，圖中318.1是目的產(chǎn)物[M+Na]+的分子峰，而244.1則是底物NAG[M+Na]+的分子峰。

圖4 甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷（GNAG）的檢測Fig.4 Determination of glyceryl N-acetyl-glucosamine（GNAG）

2.3.2 甘油和含水量對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響通過調(diào)整甘油的添加量對(duì)兩種底物的質(zhì)量比進(jìn)行了優(yōu)化（見圖5）。甘油添加量過少時(shí)，底物較少，不利于逆水解反應(yīng)的進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率較低；甘油添加量過大時(shí)，體系的流動(dòng)性較差，不利于酶和兩種底物的接觸，也不利于反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)甘油與NAG質(zhì)量比為10∶1時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。繼續(xù)對(duì)含水量進(jìn)行優(yōu)化，含水量過大時(shí)，SbNag2550更傾向于催化水解反應(yīng)，不利于GNAG的合成，而當(dāng)含水量過小時(shí)，底物不能很好地溶解在體系中，不利于酶與底物的充分接觸，逆水解轉(zhuǎn)化率在含水量為7 mL/g（以NAG質(zhì)量計(jì)）時(shí)達(dá)到最高，為24.69%（見圖6）。

圖5 甘油與N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of mass ratio of glycerol to N-acetylglucosamine（NAG）on the conversion rate of reaction

圖6 含水量對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of water content on the conversion rate of reaction

2.3.3 pH、溫度和加酶量對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響在以pNP-NAG為底物時(shí)，SbNag2550表現(xiàn)出了較強(qiáng)的pH依賴性，而在合成反應(yīng)中，反應(yīng)體系的pH對(duì)反應(yīng)效率的影響同樣很大（見圖7）。當(dāng)pH高于5.0時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)體系pH的降低而逐漸升高。轉(zhuǎn)化率在pH 5.0時(shí)最高，達(dá)到30.55%。當(dāng)反應(yīng)體系過酸（pH 4.6）或者接近中性（pH 6.6）時(shí)，其轉(zhuǎn)化率會(huì)大大降低。值得注意的是，SbNag2550在純水中催化逆水解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高于在pH 6.2和pH 6.6的環(huán)境中的轉(zhuǎn)化率，這說明反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不僅受到pH的影響，還受到緩沖鹽種類的影響。另外，同樣在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，SbNag2550在pH 5.0時(shí)更適合催化逆水解反應(yīng)，在pH 6.0時(shí)則更有利于催化pNP-NAG的水解。這樣的結(jié)果也證明了優(yōu)化逆水解反應(yīng)體系pH的必要性。反應(yīng)溫度的優(yōu)化也呈現(xiàn)出比較明顯的趨勢（見圖8）。從40℃到55℃，隨著溫度的升高，反應(yīng)體系中的分子運(yùn)動(dòng)加快，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢；而當(dāng)溫度繼續(xù)提升至60℃時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率急劇下降，僅達(dá)到13.40%。由上文可知，SbNag2550催化水解反應(yīng)時(shí)對(duì)于溫度有很好的適應(yīng)性，而當(dāng)該酶催化逆水解反應(yīng)時(shí)，溫度對(duì)其轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出了較大的影響。結(jié)合pH優(yōu)化結(jié)果，SbNag2550催化水解反應(yīng)和逆水解反應(yīng)的調(diào)控機(jī)理一定存在某些差異，對(duì)這方面開展進(jìn)一步的研究將有利于控制反應(yīng)向逆水解的方向進(jìn)行，進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)化率。由于55℃僅比50℃略有提升，為了節(jié)約能源，選擇50℃對(duì)體系中SbNag2550的加酶量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的提高逐漸升高，且升高的趨勢越來越平緩，考慮到酶的成本，最終選擇25 U/g（以NAG質(zhì)量計(jì)）作為最適加酶量（見圖9）。

圖7 反應(yīng)體系pH對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of pH of reaction system on the conversion rate of reaction

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of temperature on the conversion rate of reaction

圖9 加酶量對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of enzyme loading on the conversion rate of reaction

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響及反應(yīng)平衡的驗(yàn)證液相色譜測定了不同反應(yīng)時(shí)間下NAG轉(zhuǎn)化為GNAG的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明（見圖10），反應(yīng)轉(zhuǎn)化率在初期增長很快，在24 h即可達(dá)到28.20%；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物不斷積累，酶催化效率開始降低，在72 h時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到34.82%。與同樣具備逆水解活性的LcNAgase和EfNagase在催化合成幾丁寡糖時(shí)的轉(zhuǎn)化率（分別為4.86%和5.05%）相比[18]，本研究中的轉(zhuǎn)化率要高得多，但這可能是因?yàn)楦视妥鳛樘腔荏w時(shí)，空間位阻較小，更容易與NAG脫水縮合。而與酶法合成其他類型甘油糖苷，如甘油葡萄糖苷[14-15]和甘油半乳糖苷[16]的相關(guān)研究相比，本研究中合成GNAG的轉(zhuǎn)化率不是特別高，可能會(huì)對(duì)其后期研究造成一定的限制。為了進(jìn)一步探究反應(yīng)轉(zhuǎn)化率后期不再增長的原因，在以上最適條件下進(jìn)行反應(yīng)，間隔取樣100 μL作為樣品，同時(shí)加入1 U酶液繼續(xù)反應(yīng)，另一組在取樣后加入等體積的水，取樣持續(xù)144 h。測定不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)加酶液組和補(bǔ)加水組的轉(zhuǎn)化率，與不做處理持續(xù)反應(yīng)的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比（見圖10）。結(jié)果表明，補(bǔ)加酶液/水的反應(yīng)體系在12 h和24 h的轉(zhuǎn)化率與不做處理的對(duì)照組基本一致，而48 h時(shí)的轉(zhuǎn)化率則明顯低于對(duì)照組，反應(yīng)后期的轉(zhuǎn)化率更是出現(xiàn)了大幅度的下降。推測原因是因?yàn)樵诓粩嗳又蟹磻?yīng)體系中NAG和甘油等物料的濃度都有所下降，使得反應(yīng)平衡向水解方向移動(dòng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降的趨勢。另外，補(bǔ)加酶液組和補(bǔ)加水組的轉(zhuǎn)化率變化趨勢基本一致，這表明SbNag2550直到144 h仍保留較高的酶活力，再次印證了其優(yōu)良的穩(wěn)定性。另外一方面，驗(yàn)證了反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較低是因?yàn)榉磻?yīng)達(dá)到了平衡，就可以針對(duì)性地采取不同策略來提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，例如在反應(yīng)的同時(shí)移除產(chǎn)物以減弱產(chǎn)物的抑制作用，或者采用非水相反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)以抑制產(chǎn)物的水解。Hang等采用反應(yīng)分離耦合的方式，在酶膜反應(yīng)器中催化菊糖水解生成雙果糖酐Ⅲ，減弱了產(chǎn)物的抑制作用，反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物純度均有顯著提高[24]。Schwarz等采用連續(xù)反應(yīng)的方式，催化鄰硝基苯基葡萄糖苷和甘油發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，最終甘油葡萄糖苷得率達(dá)到80%[25]。采取合適的策略來進(jìn)行反應(yīng)將有利于進(jìn)一步提高NAG的利用率，從而獲得更多的GNAG。

圖10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 Effect of reaction time on the conversion rate of reaction

3 結(jié)語

作者從桿菌狀鏈霉菌中克隆獲得一個(gè)NAGase的編碼基因，并將其在大腸桿菌BL21（DE3）中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，獲得了具備優(yōu)良催化特性的SbNag2550。SbNag2550表現(xiàn)出了較強(qiáng)的溫度適應(yīng)性，在45～60℃均能夠較好地發(fā)揮催化活性。該酶還表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，在55℃孵育60 h仍能保留將近90%的酶活力。同時(shí)，SbNag2550還呈現(xiàn)出比較強(qiáng)的pH依賴性，在弱酸性環(huán)境中才能較好地發(fā)揮作用。利用該酶催化NAG和甘油逆水解實(shí)現(xiàn)了GNAG的合成，反應(yīng)24 h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.20%，反應(yīng)72 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為34.82%。本研究中首次利用酶催化的方式合成了GNAG，且逆水解反應(yīng)底物比較廉價(jià)，反應(yīng)工藝也比較簡單，為GNAG的大量制備及其功能活性研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本研究中所挖掘的SbNag2550還可進(jìn)一步嘗試用于其他含NAG的功能性寡糖的酶促合成。