張學(xué)文， 孫媛霞*

（1.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程研究中心，天津 300308；2.國(guó)家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308）

隨著消費(fèi)者對(duì)功能食品和藥物遞送提出的更高需求，采用酶法制備結(jié)構(gòu)可控的功能性淀粉已成為一種發(fā)展趨勢(shì)[1]。直鏈淀粉和高支化淀粉是功能性淀粉的重要組成部分。雖然天然淀粉中存在直鏈淀粉，但其分離難度大、純度低、結(jié)構(gòu)不均一，限制了其在功能食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用[2-3]。高支化淀粉是天然淀粉的衍生物，具有良好的水溶性、抗降解性等特性，使其在功能食品和藥物遞送等方面具有廣闊應(yīng)用前景。以淀粉為底物酶法合成直鏈淀粉和高支化淀粉具有結(jié)構(gòu)調(diào)控性差的缺陷[4]，而以蔗糖為底物合成結(jié)構(gòu)可控淀粉已成為功能性淀粉合成的新手段。作者旨在綜述以蔗糖合成直鏈淀粉和高支化淀粉的研究進(jìn)展及其在功能食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用前景，為結(jié)構(gòu)可控的功能性淀粉創(chuàng)新性研發(fā)提供參考。

1 直鏈淀粉的定向合成

1.1 蔗糖合成功能性多糖概況

蔗糖是由葡萄糖和果糖通過α-1，2糖苷鍵連接而成，再利用生物酶法進(jìn)行深加工得到異麥芽酮糖、異麥芽糖、低聚果糖、低聚麥芽聚糖等具有高附加值的功能性糖[5-8]。近年來，以蔗糖為底物制備功能性多糖的報(bào)道逐漸增多，其中β-果聚糖、β-葡聚糖和α-葡聚糖是食品工業(yè)中具有重要應(yīng)用的功能性多糖（見圖1）。β-果聚糖是一類具有重要益生作用多糖，例如菊糖和果聚糖等。β-果聚糖可以促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖，改善腸道微環(huán)境，降低膽固醇和脂肪吸收[9]，還具有調(diào)節(jié)血糖、降低糖尿病引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)、保濕與冷凍保護(hù)的功能[10-11]，已被廣泛開發(fā)成穩(wěn)定劑、表面形成劑、乳化劑、食品風(fēng)味載體等應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)[12]。β-葡聚糖作為功能性食品原料，可作為食品增稠劑、膳食纖維、脂肪替代物等應(yīng)用于食品工業(yè)中，同時(shí)還具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫力、改善腸道菌群等多種益生功能[13]。

圖1 蔗糖制備多功能葡聚糖和果聚糖Fig.1 Enzymatic synthesis of functional glucans and fructosans from sucrose

蔗糖作為葡萄糖供體能夠合成結(jié)構(gòu)豐富的功能性α-葡聚糖，包括直鏈淀粉、葡聚糖、Reuteran和交替糖等。多種類型的糖苷鍵極大地提高了功能性α-葡聚糖的結(jié)構(gòu)多樣性，使其具有抗消化、調(diào)節(jié)腸道微生物種群等益生作用。直鏈淀粉由α-1，4糖苷鍵連接的重復(fù)葡萄糖單元構(gòu)成，是天然淀粉的重要組成部分。除作為能量來源之外，直鏈淀粉由于其高度可控的螺旋結(jié)構(gòu)被開發(fā)為功能性高分子材料[14]。在水溶液中直鏈淀粉單鏈能夠自發(fā)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)在內(nèi)部空腔中結(jié)合客體分子形成超分子聚合物[15]。自然界中直鏈淀粉通常與支鏈淀粉相互交聯(lián)形成淀粉顆粒，由于分離方法限制，高純度的直鏈淀粉很難從自然界中分離獲得，酶法體外合成是獲得結(jié)構(gòu)可控直鏈淀粉的有效途徑[16]。

1.2 蔗糖合成直鏈淀粉途徑

蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphoryl ase，SP）和葡聚糖磷酸化酶（glucan phosphorylase，GP）是催化蔗糖合成直鏈淀粉的典型磷酸化酶體系（見圖2）。SP以蔗糖為底物催化α-D-葡萄糖-1-磷酸（Glc-1-P）的合成。GP利用Glc-1-P在引物非還原端進(jìn)行糖鏈延伸，最終合成直鏈淀粉[17]。GP合成直鏈淀粉的引物通常為麥芽寡糖，最短引物為麥芽四糖[18]。由于α-1，4糖苷鍵的斷裂和1-磷酸鍵的形成需要相似的能量，因此GP催化的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，除催化糖鏈的延伸外還可以催化α-1，4葡聚糖從非還原端磷解生成游離Glc-1-P[19]。調(diào)控蔗糖與引物的比例能在一定程度上實(shí)現(xiàn)直鏈淀粉長(zhǎng)度的調(diào)控[20]，但直鏈淀粉的長(zhǎng)度還受到兩種酶的比例、引物濃度、蔗糖濃度等多因素影響，這給直鏈淀粉定向合成造成了很大困難。

圖2 蔗糖合成直鏈淀粉的酶促體系Fig.2 Enzymatic synthesis of amylose from sucrose

淀粉蔗糖酶（amylosucrase，ASase）催化蔗糖合成直鏈淀粉是直鏈淀粉生物合成的新途徑，此方法僅需要淀粉蔗糖酶且不需要添加引物。相比于磷酸化酶合成體系，淀粉蔗糖酶體系更為簡(jiǎn)潔高效，且直鏈淀粉的結(jié)構(gòu)僅受酶催化特性和蔗糖濃度的影響。

1.3 淀粉蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)及催化機(jī)理

1974年，研究人員分析得到可產(chǎn)胞外酶的Neisseria polysaccharea菌株，而該酶可以將蔗糖催化為淀粉狀聚合物[21]。1999年Montalk等報(bào)道了第一個(gè)來自N.polysaccharea的ASase基因序列（NpAS）[22]，是對(duì)ASase研究的新起點(diǎn)。隨著研究的深入，多種來源的ASase被鑒定出來，其性質(zhì)比對(duì)如表1所示[5，23-30]。ASase的最適溫度為30～45℃，最適pH為7.0～8.0。從表1可以發(fā)現(xiàn)ASase擁有較強(qiáng)的聚合活性，且均表現(xiàn)出一定的水解活性和異構(gòu)活性。來自C.carbonis的CcAS產(chǎn)物中直鏈淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到84.0%，是目前已知最高水平，且水解產(chǎn)物葡萄糖和果糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約7%，異構(gòu)產(chǎn)物松二糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約10%。聚合產(chǎn)物直鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布差異較大，因此改變淀粉蔗糖酶催化特性能夠?qū)崿F(xiàn)淀粉長(zhǎng)度的特異性調(diào)控。

表1 不同來源淀粉蔗糖酶性質(zhì)比對(duì)Table 1 Properties of amylomaltases from diverse resources

淀粉蔗糖酶屬于糖苷水解酶家族13（GH13），可以進(jìn)行水解、聚合等催化多種反應(yīng)。淀粉蔗糖酶和其他糖苷水解酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶擁有相似的反應(yīng)機(jī)理（見圖3）。首先，催化中心的質(zhì)子供體（Asp）對(duì)蔗糖中糖苷鍵進(jìn)行質(zhì)子化，并對(duì)葡萄糖的異頭碳進(jìn)行親核攻擊，形成酶與底物分子共價(jià)連接中間體。中間體與水分子或糖受體反應(yīng)完成水解或轉(zhuǎn)苷催化。酶分子活性中的水分子和糖受體的濃度決定了水解和轉(zhuǎn)苷活性。當(dāng)蔗糖是唯一底物時(shí)，淀粉蔗糖酶前期水解蔗糖獲得游離葡萄糖（轉(zhuǎn)苷催化受體），通過轉(zhuǎn)苷催化把蔗糖中葡萄糖單元連接到游離葡萄糖受體上合成麥芽二糖，此可繼續(xù)作為受體實(shí)現(xiàn)糖鏈的不斷延伸，最終合成直鏈淀粉。

圖3 淀粉蔗糖酶水解和轉(zhuǎn)苷催化機(jī)理Fig.3 Reaction mechanism for hydrolysis and transglycosylation of amylosucrase

1.4 淀粉蔗糖酶結(jié)構(gòu)與直鏈淀粉合成調(diào)控機(jī)理

以蔗糖為底物時(shí)，實(shí)現(xiàn)ASase合成結(jié)構(gòu)可控的直鏈淀粉，需要對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理有深入認(rèn)識(shí)。隨著對(duì)ASase研究的深入，目前已有3種不同來源的ASase晶體結(jié)構(gòu)被解析出來，分別為DgAS（PDB：3UCQ，D.geothermalis）、DrAS（PDB：4AYS，D.radiodurans）和NpAS（PDB：1G5A，N.polysaccharea）[31-33]。ASase的每個(gè)單亞基都含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為N結(jié)構(gòu)域、A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、B′結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域（見圖4（a））。A、B、C結(jié)構(gòu)域在GH13家族中普遍存在，而N結(jié)構(gòu)域和B′結(jié)構(gòu)域是ASase的獨(dú)有結(jié)構(gòu)域。A結(jié)構(gòu)域具有（β/α）8筒狀結(jié)構(gòu)，是具有催化能力的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域同源性非常低，研究表明N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域影響ASase是單體還是多聚體形態(tài)[33]。

2001年隨著NpAS晶體結(jié)構(gòu)被解析，位于活性中心的多個(gè)保守氨基酸（Asp144、Tyr147、His187、Arg284、Asp286、Glu328和His392）被驗(yàn)證與ASase聚合活性有關(guān)[34]。2002年Skov等利用酶與底物共結(jié)晶解析了NpAS的底物結(jié)合位點(diǎn)（見圖4（b）），并預(yù)測(cè)了B結(jié)構(gòu)域和B′結(jié)構(gòu)域?qū)Sase活性有重要影響[35]。NpAS活性中心含有兩個(gè)催化殘基（Asp286和Glu328）和7個(gè)底物結(jié)合亞位點(diǎn)（-1到+6），其中-1和+1是底物結(jié)合亞位點(diǎn)，-1亞位點(diǎn)包括Asp144、His187、Arg284、His392、Asp393和Arg509，是蔗糖中葡萄糖結(jié)合位置；+1亞位點(diǎn)包括Arg394和Asp446，是蔗糖中果糖單元的結(jié)合位置，也是麥芽寡糖中葡萄糖單元的結(jié)合位置（見圖4（c））。

圖4 淀粉蔗糖酶（NpAS：1G5A）結(jié)構(gòu)域分布、底物結(jié)合位點(diǎn)及催化活性中心Fig.4 Crystal structure of amylosucrase（NpAS：1G5A）with multi domains，substrate binding sites，and active site

ASase最適溫度通常為35～45℃，熔融溫度（Tm）為40～50℃，因此較低的熱穩(wěn)定性限制了ASase在工業(yè)中的應(yīng)用。2005年，有研究者開始對(duì)NpAS進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造，分子改造位點(diǎn)包含催化結(jié)構(gòu)域A結(jié)構(gòu)域、N結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域和B′結(jié)構(gòu)域。對(duì)A結(jié)構(gòu)域中β-strand上的N387位點(diǎn)突變?yōu)樘於彼?，?0℃時(shí)其催化活性從0增加到野生型的60%[36]；針對(duì)N結(jié)構(gòu)域和B′結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的R20C/A451T突變體，在50℃下突變體半衰期從3 min提高到32 min，是因?yàn)镽20C和A451T之間形成鹽橋，同時(shí)B′結(jié)構(gòu)域中的T451與Loop8中的D488形成氫鍵，顯著增加了NpAS的熱穩(wěn)定性[37]；A結(jié)構(gòu)域-1亞位點(diǎn)中H392P突變體Tm從48℃提高到50℃[38]。綜上，通過加強(qiáng)B′結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性能顯著提高ASase的熱穩(wěn)定性。

相較于NpAS的單亞基結(jié)構(gòu)，DgAS和DrAS擁有二聚體結(jié)構(gòu)且表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性，主要原因是二聚體結(jié)構(gòu)改善了疏水核心，延長(zhǎng)了鹽橋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了氫鍵相互作用[33]。其中位于二聚體接觸面的7個(gè)區(qū)域?qū)Χ垠w的形成和穩(wěn)定有重要影響（見圖5）。Tian等通過比較DgAS與來自Calidithermus timidus的CtAS位于二聚體接觸面7個(gè)區(qū)域的差異，并對(duì)區(qū)域4進(jìn)行了截短或替換，發(fā)現(xiàn)突變體Tm分別從74.47℃（野生型）降低到62.46℃和64.32℃，同時(shí)60℃下催化活性幾乎完全喪失，說明區(qū)域4對(duì)二聚體的穩(wěn)定性具有顯著影響[39]，其他區(qū)域與二聚體穩(wěn)定性的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

圖5 DgAS二聚體結(jié)構(gòu)中相互作用的7個(gè)區(qū)域Fig.5 Seven interaction regions between DgAS dimers

ASase含有3個(gè)低聚糖結(jié)合位點(diǎn)（OB1、OB2和OB3），其中，OB1位于催化活性中心，OB2位于B′結(jié)構(gòu)域，OB3位于C結(jié)構(gòu)域，OB1和OB2可能與聚合物的延伸有關(guān)[40]。隨著DgAS晶體結(jié)構(gòu)解析，并通過比較NpAS和DgAS的晶體結(jié)構(gòu)推測(cè)ASase聚合酶活性受到催化活性中心的柔性影響，主要表現(xiàn)在多Loop結(jié)構(gòu)的B結(jié)構(gòu)域和B′結(jié)構(gòu)域[33]。將DgAS和NpAS的B結(jié)構(gòu)域和B′結(jié)構(gòu)域互換后發(fā)現(xiàn)擁有來自NpAS的B結(jié)構(gòu)域的DgAS不能合成DP大于12的直鏈淀粉，進(jìn)一步確定了B結(jié)構(gòu)域?qū)酆匣钚缘挠绊慬41]。通過對(duì)NpAS隨機(jī)突變，位于B結(jié)構(gòu)域的突變體（E227G），其聚合酶活性提高60%，產(chǎn)物中直鏈淀粉含量增加[36]。Seo等通過對(duì)DgAS位于B結(jié)構(gòu)域Loop3上的3個(gè)氨基酸（P219、F225和A226）進(jìn)行單點(diǎn)突變，P219Y突變體水解活性降低至60%，聚合活性提高1.3倍，但短直鏈淀粉（DP 6～15）含量增加[42]；A226N突變體產(chǎn)物中DP 16～40的直鏈淀粉含量顯著增加，由此說明Loop3與底物的結(jié)合密切相關(guān)，且其自由度的改變影響直鏈淀粉聚合度[43]。

Vergès等對(duì)NpAS的活性中心進(jìn)行了理性設(shè)計(jì)，并構(gòu)建了多個(gè)位置的組合突變體30H3，其聚合活性提高6倍，且產(chǎn)物中僅含有低聚麥芽多糖（DP 3～20）[44]。另一個(gè)突變體39A8包含11個(gè)突變位點(diǎn)（位于+1和+2亞位點(diǎn)），其聚合產(chǎn)物僅為麥芽二糖和麥芽三塘。30H3與39A8相比，唯一的區(qū)別在于C445A和C445R。兩個(gè)突變體與野生型相比其產(chǎn)物中僅含有可溶性低聚麥芽糖。在晶體結(jié)構(gòu)中C445位于B′結(jié)構(gòu)域中的Loop7上，因此推斷Loop7的自由度可能與OB1和OB2亞位點(diǎn)的相互作用有關(guān)。30H3突變體中G369和T398位點(diǎn)與野生型一致，而39A8突變體此位點(diǎn)發(fā)生突變是引起兩個(gè)突變體產(chǎn)物差異的直接原因。G369和T398分別位于+2和+3亞位點(diǎn)，39A8突變體對(duì)多糖受體的結(jié)合能力降低，因此導(dǎo)致突變體不能延伸長(zhǎng)鏈[43]。綜上，B′結(jié)構(gòu)域影響葡聚糖結(jié)合到OB2亞位點(diǎn)，同時(shí)影響OB1和OB2的相互作用，最終影響產(chǎn)物中直鏈淀粉的長(zhǎng)度。因此，通過對(duì)OB1和OB2亞位點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，能夠獲得結(jié)構(gòu)可控的直鏈淀粉。

2 高支化淀粉的定向合成

2.1 糖原分支酶的挖掘及催化特性

糖原分支酶（GBE）作為合成高支化淀粉的關(guān)鍵酶，能夠特異性催化淀粉α-1，4糖苷鍵連接的直鏈分子形成新的分支，從而增加淀粉中α-1，6糖苷鍵含量，是一種極具有開發(fā)價(jià)值的新型淀粉酶[45]。在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，依據(jù)序列同源性GBE被歸類于GH13和GH57兩個(gè)家族。

迄今，已有多個(gè)GH13家族GBE用于高支化淀粉合成的報(bào)道，但相關(guān)研究依然處在對(duì)GBE催化活性和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征階段?，F(xiàn)有研究表明，GBE能夠催化直鏈淀粉或天然淀粉合成不同結(jié)構(gòu)的高支化淀粉，且不同來源的GBE展現(xiàn)出顯著的催化活性差異，如表2所示[46-60]。1998年P(guān)reiss團(tuán)隊(duì)報(bào)道了第一個(gè)來自E.coli的EcGBE，其活性為1.1 U/mg[46]；2009年P(guān)alomo等報(bào)道了來自Deinococcus的DgGBE和DrGBE，在最適溫度50℃和30℃下其催化活性分別為7.2 U/mg和4.7 U/mg[47]。2020年Li等報(bào)道了來自V.vulnificus的VvGBE催化活性為10.24 U/mg，其最適溫度為30℃[48]。

表2 已報(bào)道糖原分支酶催化特性比較Table 2 Catalytic properties of glycogen branching enzymes

目前，4個(gè)GH57家族GBE被報(bào)道。2006年有研究者等報(bào)道了第一個(gè)GH57家族糖原分支酶（TkGBE，T.kodakaraensis），其最適溫度為70℃，最適pH為7.0，催化活性為0.56 U/mg[49-50]。2011年P(guān)alomo等報(bào)道了第二個(gè)GH57家族GBE（TtGBE，T.thermophilus），其催化活性為0.29 U/mg，最適溫度為65℃[51]，隨后來源于P.horikoshii的PhGBE和P.mobilis的PmGBE57被報(bào)道，其最適溫度均為50℃，催化活性分別為3.4 U/mg和0.04 U/mg[52-53]。綜合分析兩個(gè)家族GBE發(fā)現(xiàn)，限制GBE合成高支化淀粉應(yīng)用的瓶頸是該酶的催化效率低且熱穩(wěn)定性差，GH13家族GBE催化活性普遍高于GH57家族GBE，因此更具有工業(yè)應(yīng)用潛力。

2.2 糖原分支酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

目前，對(duì)糖原分支酶結(jié)構(gòu)與功能的研究越來越深入，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB）收錄了7個(gè)GBE晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（見圖6），其中GH57家族GBE有3個(gè)晶體結(jié)構(gòu)被解析，分別來自古 細(xì) 菌P.horikoshii（5WU7）、T.kodakarensis（3N8T）、和細(xì)菌T.thermophilus（見圖6（c））。GH57家族GBE有A、B、C 3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中A結(jié)構(gòu)域?yàn)榇呋Y(jié)構(gòu)域，具有典型的（β/α）7桶狀結(jié)構(gòu)；B結(jié)構(gòu)域由插入到催化結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，功能不明確；C結(jié)構(gòu)域由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，是底物結(jié)合域。目前，關(guān)于GH57家族GBE研究較少，深入活性中心內(nèi)部的Loop區(qū)域影響催化活性，Loop越短水解活性越高[61]；位于Loop中的酪氨酸（Tyr）進(jìn)行突變后，分支活性顯著降低，水解活性顯著增 加[48，58]。

GH13家族4個(gè)晶體結(jié)構(gòu)被解析（見圖6），分別來 自E.coli（1M7X）、M.tuberculosis（3K1D）、R.marinus（見圖6（b））和C.subtropica（5GQU）。GH13家族GBE主要結(jié)構(gòu)域?yàn)镃結(jié)構(gòu)域、A結(jié)構(gòu)域和N結(jié)構(gòu)域，其中A結(jié)構(gòu)域?yàn)榇呋Y(jié)構(gòu)域，具有典型的（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)；C結(jié)構(gòu)域通常有7個(gè)β-strands組成，是底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；N結(jié)構(gòu)域由一個(gè)或兩個(gè)β-三明治結(jié)構(gòu)單元組成，其功能不明確[58]。

圖6 糖原分支酶結(jié)構(gòu)解析Fig.6 Structural analysis of glycogen branching enzyme

目前，關(guān)于GH13家族GBE的研究主要集中在基因挖掘和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定，尚不完全清楚GBE的催化機(jī)制。隨著對(duì)高支化淀粉功能性的挖掘，影響GBE催化活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究逐漸引起關(guān)注。2002年Abad等報(bào)道了第一個(gè)來自E.coli的EcGBE晶體結(jié)構(gòu)，通過對(duì)N端112個(gè)氨基酸敲除發(fā)現(xiàn)突變體和野生型催化活性沒有明顯變化[62]；2009年P(guān)alomo等通過對(duì)來自Deinococcus的兩個(gè)GBE進(jìn)行了N1和N2結(jié)構(gòu)域缺失或互換，發(fā)現(xiàn)N1和N2結(jié)構(gòu)域影響產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，但并不影響催化活性[47]；2010年P(guān)al等報(bào)道了來自M.tuberculosis的MtGBE N1結(jié)構(gòu)域缺失突變體，發(fā)現(xiàn)N1結(jié)構(gòu)域缺失導(dǎo)致MtGBE催化活性從野生型1.35 U/mg降低到0.62 U/mg，Km從0.56 mg/mL降低到0.33 mg/mL，證明N1結(jié)構(gòu)域?qū)BE催化活性有顯著影響[58]。2015年有研究者選取來自V.vulnificus的VvGBE進(jìn)行了N結(jié)構(gòu)域缺失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)N結(jié)構(gòu)域與GBE轉(zhuǎn)移鏈長(zhǎng)有關(guān)[63]。2021年Jiang等報(bào)道了來自R.marinus的晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)N結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)N結(jié)構(gòu)域的缺失顯著降低了RmGBE的催化活性[59]。綜上可以看出N結(jié)構(gòu)域?qū)BE的催化活性或催化特異性有重要作用，但對(duì)不同來源的GBE表現(xiàn)出明顯差異。

2.3 糖原分支酶分子改造

探究酶與底物結(jié)合方式及途徑是酶催化分子機(jī)制研究的突破口，是實(shí)現(xiàn)高支化淀粉結(jié)構(gòu)調(diào)控的基礎(chǔ)。1998年Binderup等通過對(duì)E.coli GBE氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)位于保守區(qū)域CSRIII上的459（E.coli numbering）位點(diǎn)保守性較低，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行突變后E459D突變體催化活性提高1.6倍，但對(duì)產(chǎn)物特異性沒有顯著影響[46]。2017年有研究者通過對(duì)來自G.thermoglucosidans的GBE的M349進(jìn)行單點(diǎn)突變（M349T），使突變體的催化活性提高了35%，同時(shí)提高了產(chǎn)物中α-1，6糖苷鍵的含量[64]。Hayashi等解析了Cyanothece sp.的分支酶與麥芽七糖復(fù)合體結(jié)構(gòu)，推測(cè)了分支酶可能的催化機(jī)理，并明確了活性中心-1到-7的亞位點(diǎn)，并對(duì)位于-7亞位點(diǎn)的W610進(jìn)行了突變，突變體催化活性顯著降低，同時(shí)產(chǎn)物中短鏈組分增加[65]。Ban等對(duì)RmGBE-7亞位點(diǎn)中G160位點(diǎn)進(jìn)行突變，G160R突變體催化活性提高60%，且產(chǎn)物中短鏈組分（DP＜13）質(zhì)量分?jǐn)?shù)從49.16%增加到55.19%[66]。綜上，通過對(duì)糖原分支酶底物結(jié)合位點(diǎn)的改造，可以在一定程度上實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的定向調(diào)控。

2.4 高支化淀粉的酶法合成

蔗糖合成高支化淀粉的經(jīng)典途徑是應(yīng)用蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶和糖原分支酶，由于葡聚糖磷酸化酶需要引物進(jìn)行聚合反應(yīng)，且此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，因此，此途徑合成高支化淀粉的效率較低。相較于經(jīng)典途徑，利用ASase和GBE可提高高支化淀粉合成效率。有研究者利用NpAS和RoGBE探索了蔗糖質(zhì)量濃度和雙酶比例對(duì)高支化淀粉摩爾質(zhì)量的影響，結(jié)果表明蔗糖質(zhì)量濃度越高產(chǎn)物摩爾質(zhì)量越大（3.7×106～4.4×107g/mol），且ASase與GBE比活力比例為1∶2時(shí)高支化淀粉摩爾質(zhì)量最大，當(dāng)進(jìn)一步降低ASase與GBE的比例時(shí)，產(chǎn)物摩爾質(zhì)量反而降低[67-68]。Lee等利用不同來源的ASase和GBE，再次證明了通過雙酶比例能夠調(diào)控高支化淀粉的結(jié)構(gòu)[69]，高支化淀粉的摩爾質(zhì)量為7.37×105～1.94×108g/mol，分子粒徑為23.70～52.65 nm。目前，仍然缺乏ASase突變體和GBE突變體合成高支化淀粉的研究。綜上，ASase和GBE體外催化蔗糖合成高支化淀粉，通過調(diào)控蔗糖質(zhì)量濃度、ASase與GBE比例能夠?qū)崿F(xiàn)高支化淀粉摩爾質(zhì)量的調(diào)控。

高支化淀粉的另一個(gè)重要合成途徑是GBE修飾天然淀粉獲得。Sorndech等利用RmGBE修飾木薯淀粉制備高支化木薯淀粉，其抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高20%[70]。Li等利用BlGBE修飾支鏈淀粉制備高支化淀粉，慢消化淀粉組分提高18%[56]。

3 功能性淀粉的應(yīng)用

3.1 功能性淀粉在功能食品中的應(yīng)用

直鏈淀粉和高支化淀粉作為抗性淀粉添加到食品中可顯著提高膳食纖維的含量。吳娜娜等利用含有不同直鏈淀粉含量的糙米淀粉制備糙米面包，發(fā)現(xiàn)隨著直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，面包中抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[71]。有研究者在面包中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、30%和50%高直鏈小麥淀粉，面包硬度顯著提高，且50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）添加量的面包體積顯著降低[72-73]。Ortíz-fernández等利用高直鏈淀粉含量的小麥淀粉制作餅干后，餅干中抗性淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2.3%提高到12.8%，顯著提高了餅干的抗消化能力[74]。多項(xiàng)研究表明糖原分支酶制備的高支化淀粉顯著增加其抗降解能力，作為食品添加劑能有效降低血糖水平[75-78]，因此功能性淀粉在調(diào)節(jié)碳水代謝紊亂，尤其對(duì)肥胖病人和糖尿病人有重要意義[79]。

3.2 功能性淀粉在藥物遞送中的應(yīng)用

直鏈淀粉可用于合成V型直鏈淀粉復(fù)合體（Vamylose complex）實(shí)現(xiàn)客體分子的緩釋。V型直鏈淀粉復(fù)合體通常應(yīng)用于藥物遞送，實(shí)現(xiàn)藥物分子緩釋，提高治療效果。有研究者制備了直鏈淀粉和槲皮素的復(fù)合體，顯著延長(zhǎng)了槲皮素在胃和小腸中的釋放時(shí)間[80]。Zhang等利用直鏈淀粉和布洛芬制備的不同直鏈淀粉含量的混合物，發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合物中直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加布洛芬的釋放速率顯著降低，實(shí)現(xiàn)了藥物分子在人體內(nèi)的緩釋，提高治療效果[81]。丙酰化直鏈淀粉與藥物分子制備的螺旋納米團(tuán)簇展現(xiàn)出優(yōu)良的膜滲透性和專一性，能有效克服血腦屏障，實(shí)現(xiàn)藥物分子的快速轉(zhuǎn)運(yùn)，降低藥物使用劑量[82]。

高支化淀粉與糖原具有相似的結(jié)構(gòu)和特性，因此可替代糖原作為藥物載體，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送和緩釋。Besford等開發(fā)了連接乳糖的糖原載體，此載體對(duì)前列腺癌細(xì)胞中花生凝集素具有較高親和力并與半乳糖凝集素相互作用，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的高清成像[83]。Wojnilowicz等將糖原用于siRNA載體，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞中特定基因的沉默[84]。Gálisová等研究了糖原作為抗腫瘤藥物遞送載體，顯著提高了藥物釋放的靶向性，同時(shí)有效延長(zhǎng)了藥物釋放時(shí)間，顯著提高了對(duì)腫瘤的治療效果[85]。Gu等制備高支化淀粉與抗壞血酸復(fù)合體，有效增加了抗壞血酸的穩(wěn)定性，顯著降低了抗壞血酸的釋放速率[86]。以高支化淀粉作為藥物載體的開發(fā)還處于起始階段，高支化淀粉結(jié)構(gòu)對(duì)藥物載體特性的影響尚缺乏深入研究。

4 展望

酶法催化蔗糖合成直鏈淀粉和高支化淀粉具有結(jié)構(gòu)可控、生產(chǎn)周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)。將其應(yīng)用在功能食品和藥物載體中能有效改善食品功能和藥物遞送效率。圍繞蔗糖合成結(jié)構(gòu)可控的功能性淀粉研究，首先，需要進(jìn)一步研究淀粉蔗糖酶和糖原分支酶定向合成直鏈淀粉和高支化淀粉的催化機(jī)制，提高酶的催化活性與熱穩(wěn)定性等應(yīng)用特性，完善功能性淀粉結(jié)構(gòu)調(diào)控的理論體系；其次，還必須研究直鏈淀粉和高支化淀粉結(jié)構(gòu)對(duì)功能食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥物載體特性等的影響，提高功能性淀粉在功能食品和藥物遞送中的創(chuàng)新與應(yīng)用。