臧志意，魏小東

肺癌的發(fā)病率位居世界第二而死亡率居世界首位，其病理類型多為肺腺癌，約占所有肺癌病例的40%[1-3]。盡管目前通過手術及新輔助治療患者預后得到改善，但效果仍不理想，其高發(fā)病率及死亡率嚴重危害著患者的健康和生命[4]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因密切相關，因此通過分子水平探究肺癌發(fā)生發(fā)展的機制，可能為肺癌的治療提供新的思路[5]。蛋白激酶D2(protein kinase D2,PKD2)是絲氨酸/蘇氨酸激酶的蛋白激酶 D家族的成員之一，在反式高爾基體網(wǎng)發(fā)揮作用，其表達及活性影響著細胞的許多功能，包括蛋白的分泌、細胞的遷移、血管的生成及炎癥的發(fā)生等[6]。高爾基體磷蛋白 3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)是一種癌蛋白,位于反式高爾基體網(wǎng)，參與了腫瘤細胞的生長、增殖與遷移，并與腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等不良預后相關[7]。目前國內(nèi)關于肺腺癌中PKD2及GOLPH3的研究較少，本文通過分析PKD2及GOLPH3在肺腺癌中的表達情況以及與臨床病理資料的關系，探究兩者在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，為肺癌的診治及改善患者不良預后提供新的思路。

1資料與方法

1.1 一般資料 收集2014-06至2018-06我院進行肺癌根治術、術后病理診斷為肺腺癌的106例患者的臨床資料，其中男57例，女49例；年齡45～87歲，中位數(shù)66歲；Ⅰ期58例，Ⅱ期21例，Ⅲ期27例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。本研究已通過我院倫理委員會批準(編號：2021-9-003)。

1.2 免疫組化染色 包埋蠟塊連續(xù)切片厚度約為4 μm，采用SP法對106例肺腺癌病理組織切片及對應的40例癌旁組織進行染色，PKD2和GOLPH3工作濃度為 1∶100(抗體購自Proteintech公司)。陽性對照：按抗體說明書上組織切片陽性結(jié)果為陽性對照。陰性對照：按上述染色步驟進行，以PBS緩沖液代替一抗溶液為陰性對照。

1.3 顯微鏡結(jié)果判定 所有染色結(jié)果均由兩名高年資病理科醫(yī)師，采用半定量積分法判定：PKD2和GOLPH3蛋白主要表達于細胞質(zhì)中。陽性細胞染色程度(括號中為評分)分為未染色(0)、淡黃色(1)、黃色(2)、深棕色(3)。陽性細胞所占比例(括號中為評分)劃分為 0～5%(0)、5%～25%(1)、26%～50%(2)、51%～75%(3)、76%～100%(4) 。陽性細胞染色程度與染色比例評分相乘得到最終評分：0分(-)，1～3分(+)，4～5分(++)，>5 分( +++)。GOLPH3和PKD2的表達：-與+為低表達，++與+++為高表達；<4分為低表達，≥4分為高表達[8]。

1.4 隨訪 采用門診定期隨訪及電話隨訪(截止日期2021-06-30)。

2結(jié) 果

2.1 肺癌組及對應癌旁組中GOLPH3與PKD2表達水平的比較 GOLPH3與PKD2表達于細胞質(zhì)(圖1)。40例肺腺癌組織中GOLPH3與PKD2的表達水平明顯高于對應的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

圖1 肺癌組織與癌旁組織中相關蛋白表達情況(SP, ×200)

表1 肺癌組及癌旁組中 GOLPH3及PKD2表達的比較 (n；%)

2.2 GOLPH3與PKD2的表達水平與肺癌患者臨床病理特征的關系 GOLPH3表達水平與年齡、性別、吸煙史、腫塊位置、手術方式無關，與分化程度、腫塊直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(P<0.05)；PKD2的表達水平與年齡、性別、吸煙史、腫塊位置、手術方式、分化程度無關，與腫塊直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(P<0.05，表2)。

表2 GOLPH3及PKD2表達水平與肺癌患者臨床資料的關系 (n；%)

2.3 GOLPH3與PKD2在肺癌中表達水平的相關性 Cramer’V相關性分析提示GOLPH3與PKD2之間表達呈正相關性(V=0.363，P<0.05，表3)。

表3 GOLPH3與PKD2在肺癌組織中表達的相關性分析 (n；%)

2.4 影響肺腺癌患者預后的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示GOLPH3及PKD2的表達水平、腫塊直徑、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、組織分化程度會影響患者的生存時間(P<0.05)，而年齡、性別、吸煙史、腫塊位置及手術的方式不影響患者預后(表4)。肺癌患者的中位總生存時間為49個月(4～83個月)，死亡51例，存活42例，失訪13例。1、3、5年生存率分別為92.4%、61.6%、42.9%。高表達的GOLPH3與PKD2提示肺腺癌患者預后較差(表4，圖2、3)。

圖2 高爾基體磷蛋白3(GOLPH3)表達水平與肺癌患者預后關系

表4 影響肺癌患者預后生存的單因素分析

2.5 影響腺癌患者預后的多因素COX回歸分析 將單因素分析中P<0.05的因素以及臨床中有意義的因素納入多因素COX回歸分析中，結(jié)果顯示，GOLPH3、PKD2高表達及TNM分期(Ⅲ期)是影響患者生存的獨立危險因素(表5)。

圖3 蛋白激酶D2(PKD2)表達水平與肺癌患者預后的關系

表5 影響肺癌患者預后生存的COX多因素分析

3討 論

絲氨酸/蘇氨酸激酶的蛋白激酶 D (PKD) 家族由PKD1、PKD2和 PKD3組成，屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)超家族[6]。過往研究證據(jù)顯示，PKD的表達及活性影響著細胞的許多功能，包括分泌、遷移、增殖及血管生成等[9]。同時，研究表明PKD表達及活性的失調(diào)與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。Pang等[11]通過下調(diào)肺腺癌細胞系中的PKD2表達，發(fā)現(xiàn)細胞周期在G2-M期停滯，提示PKD2的表達可能影響著細胞的生長及增殖。此外，Azoitei等[12]發(fā)現(xiàn)在肺癌、胰腺癌和乳腺癌細胞中，上調(diào)的PKD2會通過激活NF-κB抑制腫瘤細胞的凋亡，同時，PKD2還會誘導缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，導致腫瘤新生血管的生成，促進腫瘤的生長。而在本研究發(fā)現(xiàn)PKD2在肺腺癌組織中的高表達率明顯高于癌旁組織，且PKD2表達水平與腫瘤的直徑有關，直徑≥3 cm的腫瘤PKD2高表達占比較直徑<3 cm的更多，提示PKD2可能參與了腫瘤的增殖生長。Zhu等[13]在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)活化的PDK2會通過激活PI3K/Akt/GSK-3β途徑誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的發(fā)生，導致患者的預后較差。并且，有研究指出PKD2的上調(diào)會通過基質(zhì)金屬蛋白酶1/7/9(MMP-1/7/9)誘導癌細胞的侵襲及遷移[14, 15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDK高表達更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期更晚，提示PKD2可能參與了腫瘤細胞的遷移促進淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生與腫瘤的進展，造成高表達PKD2患者的預后較差。

最新研究顯示，GOLPH3 是一種癌蛋白，其致癌活性主要與影響哺乳動物雷帕霉素靶標 (mTOR) 下游信號傳導，導致哺乳動物 TORC1 和 TORC2 復合物的活化增強有關[16]。同時，GOLPH3參與了細胞生長、增殖、遷移，其表達的上調(diào)與腦腫瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤的不良預后相關[17]。GOLPH3位于反式高爾基體網(wǎng)，反式高爾基體網(wǎng)主要作用是參與識別不同的細胞產(chǎn)物，并將其分類到不同的運輸囊泡群，運至質(zhì)膜或其他目的地[18]。研究發(fā)現(xiàn)反式高爾基體富含大量 4-磷酸磷脂酰肌醇[PI(4)P]， GOLPH3是PI(4)P的效應物之一[19, 20]。過往證據(jù)顯示，GOLPH3會通過與肌球蛋白18A(MYO18A)及F-肌動蛋白結(jié)合，將富含 PI(4)P的反式高爾基體膜連接到與順行運輸密切相關的肌動蛋白細胞骨架上[20, 21]。目前研究表明，PI(4)P /GOLPH3/MYO18A/F-肌動蛋白結(jié)構，為維持正常高爾基體囊泡運輸和結(jié)構提供了所需的張力，并參與了大部分高爾基體到質(zhì)膜的運輸[22]。Ng等[23]發(fā)現(xiàn)PI(4)P /GOLPH3通路活性的適度增加會導致高爾基體延伸和順行運輸?shù)妮p度增加。Halberg等[24]進一步證明通過募集與激活GOLPH3 可以促進高爾基體延伸和增強囊泡釋放，導致癌細胞細胞運動性增加、細胞外基質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)移。此外，GOLPH3會促進多種高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶的高爾基體內(nèi)運輸，過度表達易導致上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)，改變細胞間黏附、侵襲與遷移的能力，導致腫瘤擴散[7]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，高表達GOLPH3的患者組織分化程度更低，腫瘤直徑更大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多及TNM分期更晚，提示GOLPH3高表達可能參與了腫瘤細胞的生長與遷移，促進了腫瘤的進展。通過單因素及多因素分析得出，GOLPH3高表達的患者預后較差，并且其是影響肺癌患者預后的危險因素，這與文獻[1]研究的結(jié)果一致。

現(xiàn)有研究顯示，PKD2會從細胞質(zhì)被募集到反式高爾基體網(wǎng)，參與囊泡形成和斷裂以及協(xié)調(diào)細胞產(chǎn)物從反式高爾基體網(wǎng)到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運[25]。GOLPH3位于反式高爾基體網(wǎng)，其主要功能也是參與細胞產(chǎn)物從反式高爾基體網(wǎng)到質(zhì)膜的運輸，并且與高爾基體囊泡出芽密切相關[18]。研究發(fā)現(xiàn)活化的PKD2會通過激活PKD2/AKT通路，影響多種腫瘤細胞的增殖及遷移[13, 26]。而許多研究結(jié)果顯示GOLPH3會通過GOLPH3/AKT/mTOR影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及耐藥性等[27-29]。PKD2及GOLPH3均位于反式高爾基體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，并與囊泡的釋放相關且都可激活AKT，提示兩者可能存在某種聯(lián)系。而Zhou等[30]研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中PKD2過表達提示患者預后不良，通過細胞系實驗證實，PKD2的上調(diào)會通過PKD2/GOLPH3/AKT途徑影響腫瘤細胞的增殖及遷移。在本研究中發(fā)現(xiàn)PKD2及GOLPH3在肺腺癌中的高表達率明顯高于癌旁組織，并且兩者呈正相關，說明兩者可能存在某種機制聯(lián)系， PKD2可能作為GOLPH3的上游通過PKD2/GOLPH3/AKT影響肺腺癌細胞的增殖，導致腫瘤的進展。因兩者都與高爾基體囊泡功能相關，因此PKD2與GOLPH3兩者可能通過影響高爾基體功能的改變，促進囊泡分泌造成癌細胞擴散，從而使得腫瘤進展。而由于目前本研究只是初步通過免疫組化分析探究兩者關系，樣本量較少且是單中心的研究，所以結(jié)果可能存在部分偏倚，因此未來有必要進行大樣本及多中心的實驗。

總之，PKD2與GOLPH3在肺腺癌中高表達，是影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素，并提示患者預后較差。因此，未來通過研制針對PKD2及GOLPH3作為治療靶點的藥物，阻斷相關增殖遷移信號通路的激活，進而抑制腫瘤的進展，改善患者不良的預后，可能會成為肺癌治療的潛在新方法。