臧志意，魏小東

肺癌的發(fā)病率位居世界第二而死亡率居世界首位，其病理類型多為肺腺癌，約占所有肺癌病例的40%[1-3]。盡管目前通過手術(shù)及新輔助治療患者預(yù)后得到改善，但效果仍不理想，其高發(fā)病率及死亡率嚴(yán)重危害著患者的健康和生命[4]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因密切相關(guān)，因此通過分子水平探究肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，可能為肺癌的治療提供新的思路[5]。蛋白激酶D2(protein kinase D2,PKD2)是絲氨酸/蘇氨酸激酶的蛋白激酶 D家族的成員之一，在反式高爾基體網(wǎng)發(fā)揮作用，其表達(dá)及活性影響著細(xì)胞的許多功能，包括蛋白的分泌、細(xì)胞的遷移、血管的生成及炎癥的發(fā)生等[6]。高爾基體磷蛋白 3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)是一種癌蛋白,位于反式高爾基體網(wǎng)，參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與遷移，并與腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等不良預(yù)后相關(guān)[7]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于肺腺癌中PKD2及GOLPH3的研究較少，本文通過分析PKD2及GOLPH3在肺腺癌中的表達(dá)情況以及與臨床病理資料的關(guān)系，探究?jī)烧咴诜蜗侔┌l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，為肺癌的診治及改善患者不良預(yù)后提供新的思路。

1資料與方法

1.1 一般資料 收集2014-06至2018-06我院進(jìn)行肺癌根治術(shù)、術(shù)后病理診斷為肺腺癌的106例患者的臨床資料，其中男57例，女49例；年齡45～87歲，中位數(shù)66歲；Ⅰ期58例，Ⅱ期21例，Ⅲ期27例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。本研究已通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2021-9-003)。

1.2 免疫組化染色 包埋蠟塊連續(xù)切片厚度約為4 μm，采用SP法對(duì)106例肺腺癌病理組織切片及對(duì)應(yīng)的40例癌旁組織進(jìn)行染色，PKD2和GOLPH3工作濃度為 1∶100(抗體購(gòu)自Proteintech公司)。陽(yáng)性對(duì)照：按抗體說(shuō)明書上組織切片陽(yáng)性結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：按上述染色步驟進(jìn)行，以PBS緩沖液代替一抗溶液為陰性對(duì)照。

1.3 顯微鏡結(jié)果判定 所有染色結(jié)果均由兩名高年資病理科醫(yī)師，采用半定量積分法判定：PKD2和GOLPH3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。陽(yáng)性細(xì)胞染色程度(括號(hào)中為評(píng)分)分為未染色(0)、淡黃色(1)、黃色(2)、深棕色(3)。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例(括號(hào)中為評(píng)分)劃分為 0～5%(0)、5%～25%(1)、26%～50%(2)、51%～75%(3)、76%～100%(4) 。陽(yáng)性細(xì)胞染色程度與染色比例評(píng)分相乘得到最終評(píng)分：0分(-)，1～3分(+)，4～5分(++)，>5 分( +++)。GOLPH3和PKD2的表達(dá)：-與+為低表達(dá)，++與+++為高表達(dá)；<4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)[8]。

1.4 隨訪 采用門診定期隨訪及電話隨訪(截止日期2021-06-30)。

2結(jié) 果

2.1 肺癌組及對(duì)應(yīng)癌旁組中GOLPH3與PKD2表達(dá)水平的比較 GOLPH3與PKD2表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。40例肺腺癌組織中GOLPH3與PKD2的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖1 肺癌組織與癌旁組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況(SP, ×200)

表1 肺癌組及癌旁組中 GOLPH3及PKD2表達(dá)的比較 (n；%)

2.2 GOLPH3與PKD2的表達(dá)水平與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 GOLPH3表達(dá)水平與年齡、性別、吸煙史、腫塊位置、手術(shù)方式無(wú)關(guān)，與分化程度、腫塊直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)；PKD2的表達(dá)水平與年齡、性別、吸煙史、腫塊位置、手術(shù)方式、分化程度無(wú)關(guān)，與腫塊直徑、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05，表2)。

表2 GOLPH3及PKD2表達(dá)水平與肺癌患者臨床資料的關(guān)系 (n；%)

2.3 GOLPH3與PKD2在肺癌中表達(dá)水平的相關(guān)性 Cramer’V相關(guān)性分析提示GOLPH3與PKD2之間表達(dá)呈正相關(guān)性(V=0.363，P<0.05，表3)。

表3 GOLPH3與PKD2在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 (n；%)

2.4 影響肺腺癌患者預(yù)后的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示GOLPH3及PKD2的表達(dá)水平、腫塊直徑、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、組織分化程度會(huì)影響患者的生存時(shí)間(P<0.05)，而年齡、性別、吸煙史、腫塊位置及手術(shù)的方式不影響患者預(yù)后(表4)。肺癌患者的中位總生存時(shí)間為49個(gè)月(4～83個(gè)月)，死亡51例，存活42例，失訪13例。1、3、5年生存率分別為92.4%、61.6%、42.9%。高表達(dá)的GOLPH3與PKD2提示肺腺癌患者預(yù)后較差(表4，圖2、3)。

圖2 高爾基體磷蛋白3(GOLPH3)表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后關(guān)系

表4 影響肺癌患者預(yù)后生存的單因素分析

2.5 影響腺癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析 將單因素分析中P<0.05的因素以及臨床中有意義的因素納入多因素COX回歸分析中，結(jié)果顯示，GOLPH3、PKD2高表達(dá)及TNM分期(Ⅲ期)是影響患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

圖3 蛋白激酶D2(PKD2)表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

表5 影響肺癌患者預(yù)后生存的COX多因素分析

3討 論

絲氨酸/蘇氨酸激酶的蛋白激酶 D (PKD) 家族由PKD1、PKD2和 PKD3組成，屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)超家族[6]。過往研究證據(jù)顯示，PKD的表達(dá)及活性影響著細(xì)胞的許多功能，包括分泌、遷移、增殖及血管生成等[9]。同時(shí)，研究表明PKD表達(dá)及活性的失調(diào)與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。Pang等[11]通過下調(diào)肺腺癌細(xì)胞系中的PKD2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期在G2-M期停滯，提示PKD2的表達(dá)可能影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖。此外，Azoitei等[12]發(fā)現(xiàn)在肺癌、胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞中，上調(diào)的PKD2會(huì)通過激活NF-κB抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，同時(shí)，PKD2還會(huì)誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，導(dǎo)致腫瘤新生血管的生成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。而在本研究發(fā)現(xiàn)PKD2在肺腺癌組織中的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且PKD2表達(dá)水平與腫瘤的直徑有關(guān)，直徑≥3 cm的腫瘤PKD2高表達(dá)占比較直徑<3 cm的更多，提示PKD2可能參與了腫瘤的增殖生長(zhǎng)。Zhu等[13]在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)活化的PDK2會(huì)通過激活PI3K/Akt/GSK-3β途徑誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的發(fā)生，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差。并且，有研究指出PKD2的上調(diào)會(huì)通過基質(zhì)金屬蛋白酶1/7/9(MMP-1/7/9)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲及遷移[14, 15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDK高表達(dá)更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期更晚，提示PKD2可能參與了腫瘤細(xì)胞的遷移促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生與腫瘤的進(jìn)展，造成高表達(dá)PKD2患者的預(yù)后較差。

最新研究顯示，GOLPH3 是一種癌蛋白，其致癌活性主要與影響哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo) (mTOR) 下游信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物 TORC1 和 TORC2 復(fù)合物的活化增強(qiáng)有關(guān)[16]。同時(shí)，GOLPH3參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移，其表達(dá)的上調(diào)與腦腫瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[17]。GOLPH3位于反式高爾基體網(wǎng)，反式高爾基體網(wǎng)主要作用是參與識(shí)別不同的細(xì)胞產(chǎn)物，并將其分類到不同的運(yùn)輸囊泡群，運(yùn)至質(zhì)膜或其他目的地[18]。研究發(fā)現(xiàn)反式高爾基體富含大量 4-磷酸磷脂酰肌醇[PI(4)P]， GOLPH3是PI(4)P的效應(yīng)物之一[19, 20]。過往證據(jù)顯示，GOLPH3會(huì)通過與肌球蛋白18A(MYO18A)及F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合，將富含 PI(4)P的反式高爾基體膜連接到與順行運(yùn)輸密切相關(guān)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上[20, 21]。目前研究表明，PI(4)P /GOLPH3/MYO18A/F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，為維持正常高爾基體囊泡運(yùn)輸和結(jié)構(gòu)提供了所需的張力，并參與了大部分高爾基體到質(zhì)膜的運(yùn)輸[22]。Ng等[23]發(fā)現(xiàn)PI(4)P /GOLPH3通路活性的適度增加會(huì)導(dǎo)致高爾基體延伸和順行運(yùn)輸?shù)妮p度增加。Halberg等[24]進(jìn)一步證明通過募集與激活GOLPH3 可以促進(jìn)高爾基體延伸和增強(qiáng)囊泡釋放，導(dǎo)致癌細(xì)胞細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)移。此外，GOLPH3會(huì)促進(jìn)多種高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶的高爾基體內(nèi)運(yùn)輸，過度表達(dá)易導(dǎo)致上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)，改變細(xì)胞間黏附、侵襲與遷移的能力，導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散[7]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)GOLPH3的患者組織分化程度更低，腫瘤直徑更大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多及TNM分期更晚，提示GOLPH3高表達(dá)可能參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。通過單因素及多因素分析得出，GOLPH3高表達(dá)的患者預(yù)后較差，并且其是影響肺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，這與文獻(xiàn)[1]研究的結(jié)果一致。

現(xiàn)有研究顯示，PKD2會(huì)從細(xì)胞質(zhì)被募集到反式高爾基體網(wǎng)，參與囊泡形成和斷裂以及協(xié)調(diào)細(xì)胞產(chǎn)物從反式高爾基體網(wǎng)到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[25]。GOLPH3位于反式高爾基體網(wǎng)，其主要功能也是參與細(xì)胞產(chǎn)物從反式高爾基體網(wǎng)到質(zhì)膜的運(yùn)輸，并且與高爾基體囊泡出芽密切相關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)活化的PKD2會(huì)通過激活PKD2/AKT通路，影響多種腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移[13, 26]。而許多研究結(jié)果顯示GOLPH3會(huì)通過GOLPH3/AKT/mTOR影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥性等[27-29]。PKD2及GOLPH3均位于反式高爾基體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并與囊泡的釋放相關(guān)且都可激活A(yù)KT，提示兩者可能存在某種聯(lián)系。而Zhou等[30]研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中PKD2過表達(dá)提示患者預(yù)后不良，通過細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PKD2的上調(diào)會(huì)通過PKD2/GOLPH3/AKT途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移。在本研究中發(fā)現(xiàn)PKD2及GOLPH3在肺腺癌中的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，并且兩者呈正相關(guān)，說(shuō)明兩者可能存在某種機(jī)制聯(lián)系， PKD2可能作為GOLPH3的上游通過PKD2/GOLPH3/AKT影響肺腺癌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展。因兩者都與高爾基體囊泡功能相關(guān)，因此PKD2與GOLPH3兩者可能通過影響高爾基體功能的改變，促進(jìn)囊泡分泌造成癌細(xì)胞擴(kuò)散，從而使得腫瘤進(jìn)展。而由于目前本研究只是初步通過免疫組化分析探究?jī)烧哧P(guān)系，樣本量較少且是單中心的研究，所以結(jié)果可能存在部分偏倚，因此未來(lái)有必要進(jìn)行大樣本及多中心的實(shí)驗(yàn)。

總之，PKD2與GOLPH3在肺腺癌中高表達(dá)，是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并提示患者預(yù)后較差。因此，未來(lái)通過研制針對(duì)PKD2及GOLPH3作為治療靶點(diǎn)的藥物，阻斷相關(guān)增殖遷移信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展，改善患者不良的預(yù)后，可能會(huì)成為肺癌治療的潛在新方法。