吳永麗，吳桂儀，馬細(xì)蘭，周立斌*，孫愷輝

（1.惠州學(xué)院，廣東 惠州 516007；2.廣東白鶴生物科技發(fā)展有限公司，廣東 深圳 518120）

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)是一種新型的養(yǎng)殖模式，也稱(chēng)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其原理為養(yǎng)殖尾水通過(guò)水處理設(shè)備凈化處理后再循環(huán)利用。相比傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式，循環(huán)水養(yǎng)殖模式能減少養(yǎng)殖過(guò)程對(duì)周邊水環(huán)境依賴(lài)，減少養(yǎng)殖過(guò)程中污水排放，提高養(yǎng)殖生物成活率，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，其市場(chǎng)前景十分廣闊。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖生物病害的頻繁發(fā)生和嚴(yán)重的水環(huán)境污染，我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨巨大的壓力，產(chǎn)量也持續(xù)走低。研究表明，嚴(yán)重影響我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要原因，是養(yǎng)殖水體微生物生態(tài)環(huán)境惡化，其防治方法是維持良好的養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境[1-3]。因此，加強(qiáng)對(duì)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中細(xì)菌組成及數(shù)量研究，具有重要意義。

細(xì)菌與其他生物及環(huán)境條件一同構(gòu)成水體生態(tài)系統(tǒng)，細(xì)菌是循環(huán)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它可通過(guò)直接參與物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，進(jìn)而影響整個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境的水質(zhì)狀況[4]。目前，有關(guān)對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌組成和數(shù)量的研究比較深入[5-9]。有關(guān)對(duì)灘涂海水種植-養(yǎng)殖系統(tǒng)[10]、凡納濱對(duì)蝦低鹽度高產(chǎn)蝦池環(huán)境[11]、鹽堿地養(yǎng)蝦池塘[12]中的細(xì)菌組成和數(shù)量變化的研究報(bào)道較多，但對(duì)石斑魚(yú)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中細(xì)菌組成方面的研究甚少。石斑魚(yú)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的食用魚(yú)類(lèi)。為比較石斑魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)與自然海水水質(zhì)和細(xì)菌數(shù)量，對(duì)其養(yǎng)殖水體的環(huán)境因子進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌、弧菌、大腸菌群、硫酸鹽還原菌和氨化細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和生物量的計(jì)算，以獲得基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，擬為石斑魚(yú)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的健康持續(xù)發(fā)展以及養(yǎng)殖水體微生物系統(tǒng)的改良調(diào)控和疾病防治，提供參考。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)與樣品采集

試驗(yàn)水樣采自廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心石斑魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的出水口。共有3類(lèi)不同的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其中A1和A2為一類(lèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)，各自有3個(gè)養(yǎng)殖池；B1和B2為另一類(lèi)系統(tǒng)，各有6個(gè)養(yǎng)殖池；此外，C1、C2和C3是第3類(lèi)系統(tǒng)，各有3個(gè)養(yǎng)殖池。于上午投喂4 h后，分別從A1、A2、B1、B2、C1、C2和C3系統(tǒng)每個(gè)養(yǎng)殖池出水口處采集水樣5 000 mL，每個(gè)水樣3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組為大亞灣的自然海水。

1.2 環(huán)境因子的測(cè)定

采用水質(zhì)測(cè)定儀現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)溫度、鹽度、pH值、溶解氧，靛酚藍(lán)分光光度法測(cè)定氨氮，萘乙二胺分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽氮，具體檢測(cè)方法參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB 17378.4—2007）。將3次樣品的平均值作為采樣點(diǎn)的水質(zhì)理化參數(shù)。

1.3 水體細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定

檢測(cè)3類(lèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)和自然海水中的異養(yǎng)細(xì)菌、弧菌、大腸菌群、氨化細(xì)菌及硫酸鹽還原菌5類(lèi)細(xì)菌的數(shù)量。利用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，對(duì)水體異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，弧菌數(shù)量測(cè)定采用TCBS培養(yǎng)法，大腸菌群培養(yǎng)采用伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，配制蛋白胨氨化培養(yǎng)基（含瓊脂）用于氨化細(xì)菌的測(cè)定與培養(yǎng)，制備的硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基用于硫酸鹽還原菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。取備好的樣品分別用無(wú)菌海水做梯度稀釋至10-1、10-2、10-3，各稀釋梯度均取100 μL進(jìn)行涂布平板，每個(gè)梯度分別做3個(gè)平行，將接種后的平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36 h，然后采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)菌落形成單位數(shù)（Colony Forming Units,CFU）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

環(huán)境因子（溫度、鹽度、pH值、溶解氧、氨氮，亞硝酸鹽氮）及細(xì)菌數(shù)量的比較用Spass的t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異顯著。采用Graphpad 6.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子的變化特征

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)和自然海水水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1（a）（b）（c）。由圖1（a）可見(jiàn)，各類(lèi)水體的水溫差異并不明顯，均維持在27.6℃左右。除了B1系統(tǒng)中溶解氧質(zhì)量濃度較低，為4.1 mg/L；其他循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)和自然海水中的溶解氧含量較高，且較恒定[圖1（a）]。各類(lèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的鹽度差異較小，為3.13%~3.45%，自然海水的鹽度最低，為2.6%[圖1（b）]。除了B1的pH值為5.29（水呈酸性）外，其余水體pH值均為6.4~7.5[圖1（b）]。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的氨氮和亞硝酸鹽氮含量差異明顯，B1系統(tǒng)的氨氮含量最高，達(dá)到1 190 μg/L，但其亞硝酸鹽氮含量較低，為10 μg/L；B2、C1系統(tǒng)和自然海水的氨氮含量較低，分別為20，30和30 μg/L，亞硝酸鹽氮含量為10，10和3 μg/L[圖1（c）]?？傮w來(lái)說(shuō)，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的溶解氧普遍低于自然海水，鹽度和亞硝酸鹽氮含量均高于自然海水，同時(shí)其pH值都低于自然海水，而大部分循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的氨氮含量高于自然海水。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)和自然海水中環(huán)境因子的變化

2.2 養(yǎng)殖水體和自然海水中細(xì)菌數(shù)量變化特征

各個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量見(jiàn)圖2（a）（b）（c）。由圖2可見(jiàn)，各個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的細(xì)菌數(shù)量高于自然海水。其中系統(tǒng)A2中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)最高，而系統(tǒng)A1、C1、C3較低。雖然A1和A2共用一類(lèi)循環(huán)水系統(tǒng)，但A1中的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)比A2的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)高出1個(gè)數(shù)量級(jí)[圖2（a）]，推測(cè)此差異是與魚(yú)體的放養(yǎng)密度和魚(yú)體自身的進(jìn)食情況有關(guān)。而自然海水中致病菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的數(shù)量。致病菌中弧菌的數(shù)量，在各個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的分布，基本處于同一個(gè)數(shù)量級(jí)，而自然海水中的弧菌數(shù)量比較少，少于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)大腸菌群數(shù)量級(jí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然海水中的大腸菌群。其中A1和A2系統(tǒng)中大腸菌群數(shù)量最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他養(yǎng)殖系統(tǒng)，其所檢測(cè)弧菌的數(shù)量也高[圖2（b）]。由圖2（c）可以看出，氨化細(xì)菌和硫酸鹽還原菌的數(shù)量分布差異明顯。其中氨化細(xì)菌數(shù)在系統(tǒng)A1和系統(tǒng)B1的分布較多，分別為1.46×105和1.48×105CFU/mL；系統(tǒng)C1的氨化細(xì)菌數(shù)最少，為1.42×104CFU/mL，其硫酸鹽還原菌數(shù)較氨化細(xì)菌數(shù)而言，低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，系統(tǒng)C3的硫酸鹽還原菌數(shù)最高，為8.1×103CFU/mL；系統(tǒng)C1的硫酸鹽還原菌數(shù)最低，為5.0×102CFU/mL[圖2（c）]。

圖2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)和自然海水中細(xì)菌數(shù)量的變化

3 討論

水體微生物，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境具有生物修復(fù)作用。異養(yǎng)細(xì)菌是養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)源，能夠?qū)⒏黝?lèi)型的有機(jī)物質(zhì)分解成無(wú)機(jī)物，并且從中獲得所需的養(yǎng)分和能量。異養(yǎng)細(xì)菌與養(yǎng)殖水體的理化因子有密切聯(lián)系，其數(shù)量分布受水體溫度、有機(jī)質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度等影響[12]，可通過(guò)測(cè)量其含量，來(lái)監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)。本研究中，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)A1、A2、B1和C2的氨氮含量較高，其所檢測(cè)出的異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量也高。此外，通過(guò)對(duì)比海域營(yíng)養(yǎng)型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13]，發(fā)現(xiàn)本研究的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的水體處于腐水狀態(tài)。由于水體的氨氮含量過(guò)高，導(dǎo)致水體營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，進(jìn)而引起異養(yǎng)細(xì)菌大量繁殖。本研究結(jié)果表明，A2系統(tǒng)的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)高達(dá)1.01×106CFU/mL，異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)較高，可能與養(yǎng)殖過(guò)程中石斑魚(yú)的排泄物和剩餌的不斷積累有關(guān)。

一些弧菌和大腸菌群是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的致病菌，因此在養(yǎng)殖過(guò)程中需要對(duì)這2類(lèi)菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如果這兩者數(shù)量較大，說(shuō)明養(yǎng)殖動(dòng)物存在暴發(fā)疾病的危險(xiǎn)[7]。文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)，弧菌數(shù)量的變化與水溫的變化趨勢(shì)相同，在8月份中旬達(dá)到全年最高值，此時(shí)弧菌數(shù)量會(huì)超過(guò)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量。本研究中弧菌的數(shù)量相對(duì)較高，達(dá)到7.45×104CFU/mL，可能是由于取樣時(shí)為9 月下旬，水溫仍然較高，弧菌大量繁殖。

氨化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌是養(yǎng)殖水環(huán)境中與營(yíng)養(yǎng)鹽轉(zhuǎn)化關(guān)系甚為密切的微生物類(lèi)群，其酶解作用，可以將養(yǎng)殖環(huán)境中的有機(jī)氮、硫酸鹽等轉(zhuǎn)化或分解，對(duì)水環(huán)境起到一定的“緩沖”作用，有益于養(yǎng)殖水體的自?xún)?。然而，氨化?xì)菌將含氮有機(jī)化合物（主要是蛋白質(zhì)）降解后，再將其脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榘睔猓∟H3）[7]；硫酸鹽還原菌，是通過(guò)異化作用進(jìn)行硫酸鹽還原的一類(lèi)厭氧細(xì)菌，它對(duì)水體的污染，是由于水體中硫酸鹽和有機(jī)物的積累而引起，有機(jī)物的大量積累，增加了水體的化學(xué)需氧量，從而增加了氧氣的消耗，使水體處于厭氧狀態(tài)，因此有利于硫酸鹽還原菌的大量繁殖，產(chǎn)生大量的硫化氫（H2S）[13-15]；這 2 類(lèi)產(chǎn)物均對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)有毒性。若養(yǎng)殖水體中NH3和H2S含量較高，會(huì)污染水體，從而影響?hù)~(yú)類(lèi)的正常生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中B1 的這3 類(lèi)細(xì)菌的數(shù)量，均高于其他養(yǎng)殖系統(tǒng)；水體的理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果也顯示，系統(tǒng)B1 的水體是處于低氧、氨氮值較高的狀態(tài)。而氨氮含量過(guò)高，又會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)攝食量，導(dǎo)致剩余過(guò)多的餌料，增加水體中有機(jī)物的含量，致使細(xì)菌大量繁殖。

養(yǎng)殖密度的增加，會(huì)產(chǎn)生大量的剩餌和水產(chǎn)動(dòng)物排泄物，造成積累，水體會(huì)出現(xiàn)低氧、高氨氮和高亞硝酸鹽氮現(xiàn)象，同時(shí)抗生素和化學(xué)藥物的使用等綜合因素，會(huì)導(dǎo)致水體污染和有害細(xì)菌增多。該研究結(jié)果顯示，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)、弧菌數(shù)、大腸菌群數(shù)、氨化細(xì)菌數(shù)和硫酸鹽還原菌數(shù)均高于自然海水，并且水體呈腐水狀態(tài)，表明養(yǎng)殖用水必須通過(guò)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行再凈化后，才能重新進(jìn)入循環(huán)水養(yǎng)殖池中。