張 瓊，舒愛華，陳小波

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院/宜昌市第一人民醫(yī)院麻醉科/三峽大學(xué)老年麻醉醫(yī)學(xué)研究所,湖北宜昌 443000)

糖尿病是缺血性心臟病最重要的危險(xiǎn)因素之一[1]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)表明糖尿病顯著加劇了心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)的發(fā)生概率，但具體機(jī)制尚未闡明[2]。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信號(hào)通路的核心效應(yīng)因子，與TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEAD)等結(jié)合，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，并且通過調(diào)控炎癥、增殖、氧化應(yīng)激等參與糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[3-5]。

線粒體自噬是一種高度選擇性的自噬，線粒體功能障礙導(dǎo)致跨線粒體內(nèi)膜的電位崩潰，同時(shí)細(xì)胞ATP濃度不降低，通過使個(gè)體線粒體去極化靶向去除功能失調(diào)的線粒體，防止有缺陷的線粒體增殖，在MIRI過程中保護(hù)心肌[6]。B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)/E1B-19k Da相互作用蛋白3(Bcl-2and adenovirus E1B19k Da-interacting protein 3，BNIP3)調(diào)控線粒體自噬，保護(hù)線粒體功能，研究表明BNIP3在MIRI中發(fā)揮保護(hù)作用，但未表明YAP有調(diào)控BNIP3及線粒體自噬中的作用[7]。因此，本研究旨在討論YAP調(diào)控BNIP3介導(dǎo)線粒體自噬在D-MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔、健康雄性大鼠，體重200～220 g，6～8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，晝夜12 h光照節(jié)律，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。36只大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為非糖尿病假手術(shù)組(NS組)、非糖尿病缺血再灌注組(NIR組)、糖尿病假手術(shù)組(DS組)、糖尿病缺血再灌注組(DIR組)、糖尿病缺血再灌注+YAP抑制劑Super-TDU組(DIR+ST組)、糖尿病缺血再灌注+YAP抑制劑Super-TDU+自噬抑制劑3-MA組(DIR+ST+3-MA組)，每組6只。本實(shí)驗(yàn)通過三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要儀器與試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾柯特生物科技有限公司)，CX31正置顯微鏡(日本Olympus公司)，恒壓恒流電泳儀(美國Bio-Rad公司)，鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司)，YAP抑制劑Super-TDU(美國BOC Science公司)，線粒體自噬抑制劑3-MA(美國CSNpharm公司)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，BCA試劑盒(上海碧云天公司)，YAP、BNIP3、Beclin兔抗大鼠一抗(美國CST公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的多克隆抗兔二抗(武漢谷歌生物公司)。

1.2 方法

1.2.1糖尿病模型制備

本研究中糖尿病大鼠均經(jīng)腹腔注射濃度1%的STZ-檸檬酸鹽緩沖液60 mg/kg建立，72 h后尾靜脈采血測(cè)血糖濃度>16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿等癥狀則表明1型糖尿病大鼠模型制備成功。非糖尿病大鼠經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水，所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)12周。

1.2.2MIRI模型制備

大鼠禁食12 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉并固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，接心電監(jiān)測(cè)，剃毛后行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。左胸第四肋間開胸并暴露心臟，用6-0尼龍線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LDA)，肉眼觀察心尖部變白，心室壁運(yùn)動(dòng)減弱且心電監(jiān)測(cè)(成都泰盟，BL420F)顯示ST段弓背向上抬高則心肌缺血成功。松開尼龍線可見心尖部恢復(fù)紅潤(rùn)，ST段回落，表明再灌注成功。NIR、DIR、DIR+ST、DIR+ST+3-MA組大鼠結(jié)扎30 min，再灌注120 min，NS組、DS組只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。再灌注前1 d，DIR+ST、DIR+ST+3-MA組大鼠尾靜脈注射Super-TDU 300 μg/kg，再灌注前1 h，DIR+ST+3-MA組大鼠腹腔注射3-MA 10 mg/kg。

1.2.3心肌梗死面積測(cè)定

各組取1只大鼠，于再灌注結(jié)束時(shí)重新結(jié)扎LDA，經(jīng)股靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%伊文藍(lán)染色劑1 mL，待未梗死心臟區(qū)域染藍(lán)后迅速夾閉主動(dòng)脈摘取心臟，放入-20 ℃冰箱凍存30 min，心臟凍硬后制作1 mm厚度切片，在37 ℃下于1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液避光孵育15 min，4%多聚甲醛固定15 min后用掃描儀掃描圖片。藍(lán)色為正常心肌，紅色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌，采用Image-J 7.0軟件分析心臟梗死面積。

1.2.4心肌組織病理檢測(cè)

再灌注結(jié)束后取大鼠左心室心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后于切片機(jī)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后于正置顯微鏡下觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)。

1.2.5血清CK-MB及LDH檢測(cè)

各組大鼠MIRI模型制備完畢后立即經(jīng)左心室取血5 mL，離心半徑8.5 cm，12 000 r/min離心5 min后取血清，使用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清CK-MB、LDH水平，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

1.2.6心肌組織YAP、BNIP3、Beclin檢測(cè)

采用蛋白免疫印跡法(Western blot)取各組大鼠心肌組織，清洗經(jīng)液氮研磨后加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃下離心半徑8.5 cm，12 000 r/min離心5 min后取上清液即為心臟組織總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入YAP(1∶1 000)、BNIP3(1∶1 000)、Beclin(1∶1 000)一抗，4 ℃下?lián)u床孵育過夜。TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h后TBST洗滌3次。經(jīng)顯影儀掃描分析蛋白條帶，將GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算YAP、BNIP3、Beclin表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積及CK-MB、LDH水平比較

與各自NS組、DS組假手術(shù)大鼠比較，NIR組和DIR組CK-MB、LDH表達(dá)水平升高(P<0.05)；與NIR組比較，DIR組心肌梗死面積增加，CK-MB、LDH表達(dá)水平升高(P<0.05)，心肌病理損傷加重；與DIR組比較，DIR+ST組心肌梗死面積減少，CK-MB、LDH表達(dá)水平降低(P<0.05)，心肌病理損傷減輕；與DIR+ST組比較，DIR+ST+3-MA組心肌梗死面積增加，CK-MB、LDH表達(dá)水平升高(P<0.05)，心肌病理損傷加重。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠梗死心肌

2.2 各組大鼠心肌組織病理改變

NS組心肌組織正常，纖維排列整齊；DS組心肌組織較為完整，心肌纖維排列稍亂；NIR組出現(xiàn)心肌纖維水腫及增生；DIR組心肌組織壞死斷裂，大量炎性反應(yīng)；與DIR組比較，DIR+ST組心肌組織損傷減輕；DIR+ST+3-MA組心肌組織損傷最為嚴(yán)重。見圖2。

表1 各組大鼠心肌梗死面積百分比、CK-MB和LDH水平

2.3 各組大鼠YAP、BNIP3和Beclin表達(dá)水平比較

與各自NS組、DS組假手術(shù)大鼠比較，NIR組和DIR組心肌組織YAP、BNIP3和Beclin表達(dá)水平上升(P<0.05)；與各自NS組、NIR組非糖尿病大鼠比較，DS組、DIR組糖尿病大鼠心肌組織YAP表達(dá)水平上升，BNIP3和Beclin表達(dá)水平降低(P<0.05)；與DIR組比較，DIR+ST組YAP表達(dá)水平下降，BNIP3和Beclin表達(dá)水平上升(P<0.05)；與DIR+ST組比較，DIR+ST+3-MA組BNIP3和Beclin表達(dá)水平下降(P<0.05)。見表2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織病理改變情況(HE染色)

表2 各組大鼠心肌組織YAP、BNIP3和Beclin表達(dá)情況

圖3 各組大鼠心肌組織YAP、BNIP3和Beclin的Western blot

3 討 論

本研究參照文獻(xiàn)[8]采用STZ腹腔注射的方式制備1型糖尿病大鼠模型，以出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型癥狀并檢測(cè)空腹血糖>16.7 mmol/L證明模型制備成功。依據(jù)文獻(xiàn)[9]采用結(jié)扎LAD的方式制備MIRI模型，NIR組大鼠心臟梗死面積增加，血清CK-MB與LDH水平升高，心肌病理結(jié)構(gòu)改變，組織破壞加重，證明模型制備成功。

YAP是Hippo信號(hào)通路的核心成分，通過與TEAD結(jié)合促進(jìn)靶基因表達(dá)，調(diào)控多種細(xì)胞功能，參與機(jī)體的各種生理及病理過程[10]。YAP與糖尿病及高糖狀態(tài)息息相關(guān)，YAP在糖尿病小鼠體內(nèi)表達(dá)水平增高，并參與了多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，但目前尚無關(guān)于YAP作用于D-MIRI的報(bào)道。BNIP3是線粒體外膜蛋白，在自噬體-溶酶體融合的調(diào)控中起重要作用，是功能性線粒體自噬必需的蛋白[11]。Beclin是細(xì)胞自噬的經(jīng)典標(biāo)志物之一，其表達(dá)水平增高一般提示自噬增強(qiáng)[12]。研究報(bào)道通過激活BNIP3介導(dǎo)線粒體自噬，可促進(jìn)MIRI后的心肌細(xì)胞存活，而YAP通過JNK通路抑制BNIP3表達(dá)[13-14]。

本次研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)大鼠(NS組、DS組)比較，手術(shù)大鼠(NIR組、DIR組)心肌組織BNIP3和Beclin表達(dá)上升，其機(jī)制可能是MIRI后機(jī)體觸發(fā)線粒體自噬上調(diào)并發(fā)揮保護(hù)性作用，進(jìn)而減輕心肌損傷。與非糖尿病大鼠(NS組、NIR組)比較，糖尿病大鼠(DS組、DIR組)MIRI后YAP表達(dá)水平上升，同時(shí)BNIP3和Beclin表達(dá)降低，心肌梗死面積增大，血清CK-MB與LDH表達(dá)水平增加，心肌損傷加重。有研究顯示YAP被抑制后，YAP表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)BNIP3和Beclin表達(dá)水平上升，心肌梗死面積減小，血清CK-MB與LDH表達(dá)水平降低，心肌損傷減輕[15]。本研究同時(shí)使用YAP抑制劑與自噬抑制劑，BNIP3和Beclin表達(dá)水平下調(diào)，心肌梗死面積增大，血清CK-MB與LDH表達(dá)水平增加，心肌損傷再次加重。值得關(guān)注的是，相關(guān)研究表明缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)/BNIP3信號(hào)通路誘導(dǎo)的自噬在MIRI中同樣發(fā)揮關(guān)鍵保護(hù)作用，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)在糖尿病狀態(tài)下通過抑制YAP并協(xié)同MIRI時(shí)激活的HIF-1α/BNIP3等線粒體自噬保護(hù)途徑可進(jìn)一步增加心肌的耐受性，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，確切結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[7]。

綜上所述，本研究提示YAP可能通過抑制BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬參與D-MIRI。