張雪玲，崔桂云，鮑 磊，林曉光，陳念東，王黎明

(1.徐州醫(yī)科大學附屬宿遷醫(yī)院神經內科,江蘇宿遷 223800;2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科,江蘇徐州 221002)

腦出血是常見的腦卒中類型，發(fā)病率、致殘率和死亡率均較高，隨著老年化速度加快，腦出血的發(fā)病率在未來很長一段時間還會呈現繼續(xù)攀升趨勢，給社會帶來沉重負擔[1-2]。然而，其確切機制至今仍未闡明，因此，目前治療手段仍有限，僅限于對癥治療減輕并發(fā)癥，死亡率并未大大降低[3]。因此，進一步深入研究腦出血致病機制對于尋找可能的治療靶點具有重要意義。據現有研究顯示炎性反應參與腦出血繼發(fā)性腦損傷過程，腦出血誘發(fā)的炎癥級聯(lián)反應加速形成水腫，進一步損害腦組織[4-5]。有研究顯示，三磷酸腺苷(ATP)/腺嘌呤核苷酸受體2X-4受體(P2X4)/NOD樣受體蛋白-3(NLRP3)信號軸在炎性反應中發(fā)揮重要作用，ATP是機體重要的供能物質，與P2X4結合后，可通過激活NLRP3炎癥小體，促進白細胞介素-1β(IL-1β)成熟及分泌，而誘發(fā)炎癥[6-7]。但此通路是否參與腦出血炎癥損傷目前不得而知。據此，本研究以腦出血作為疾病模型，圍繞繼發(fā)性炎癥損傷，探討ATP/P2X4/NLRP3信號軸在其中所起的作用，以期提供新的研究思路和干預手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

8周齡雄性 C57BL/6小鼠48只，體重 18～22 g，在適宜環(huán)境中進行飼養(yǎng)，兔抗小鼠ATP、P2X4、NLRP3、GAPDH一抗和P2X4 受體激動劑5′-胞苷三磷酸二鈉(cytidine 5′-triphosphate disodium salt,5′-CTP)購自美國Santa Cruz公司，IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-8 ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Western blot試劑盒購自北京康為世紀生物有限公司；電化學發(fā)光(ECL)試劑購自美國Bioworld Technology公司；P2X4受體抑制劑5-BDBD(SML0450)購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒及SYBR green PCR 試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。ABI 7500熒光定量PCR儀、凝膠成像儀購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 小鼠腦出血模型構建

小鼠10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，小鼠大腦固定在立體定位儀，75%乙醇消毒頭皮，暴露頂骨，取尾動脈血50 μL，隨后用注射泵以5 μL/min速度注射至左腦紋狀體，針頭停留10 min，注射孔用醫(yī)用骨蠟封閉，縫合頭皮切口。

1.3 分組及干預方法

實驗分組分為假手術組、模型組、5-BDBD干預組、5′-CTP干預組，每組12例。假手術組注射15 μL生理鹽水，模型組模型構建30 min后注射15 μL生理鹽水，5-BDBD干預組于模型構建30 min后給予腹腔注射15 μL 1 nmol/L 5-BDBD(DMSO溶解)，5′-CTP干預組于模型構建30 min后給予腹腔注射15 μL 5 nmol/L 5′-CTP(DMSO溶解)。

1.4 小鼠腦出血神經功能缺損評分(NDS)

在腦出血模型建立后第1、3、5、7天進行NDS評分，總分為18分：1～6分為輕度傷；7～12分為中度傷；13～18分為重度傷[8]。

1.5 腦含水量測定

第7天測試腦含水量，麻醉小鼠，不用灌注，直接取其頭顱，剝離出腦組織。后迅速將腦組織分為病灶側、病灶對側和小腦，分析天平上稱量，得到濕重。隨后90 ℃干燥箱烘干24 h，再次稱量，得到干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 腦組織炎癥因子水平測定

建模成功后第1、3、5、7天取各組小鼠腹主動脈血，4 ℃、2 000 r/min離心15 min，取上清液。 ELISA法檢測組織血清 IL-1β、TNF-α、IL-8 水平，嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)測定P2X4和NLRP3表達水平

提取組織蛋白，BCA法測定總蛋白含量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗 P2X4、NLRP3(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。HRP標記山羊抗兔二抗(1∶4 000)室溫孵育 2 h，ECL顯影，使用ImageJ軟件分析蛋白表達水平。

1.8 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定P2X4和NLRP3 mRNA表達水平

TRIzol法提取組織總mRNA，分光光度計測總 RNA 濃度，分別測定260 nm與280 nm的吸光度(A)值，計算濃度和純度，隨后進行反轉錄反應，取總RNA 5 μg，引物 1 μL，加無 RNAase 水至12 μL，混勻，并依次加入5×buffer 4 μL、dNTP 2 μL、RNAase 1 μL、RNAase 抑制劑1 μL，總體積 20 μL。充分混勻，PCR儀中65 ℃ 孵育5 min，42 ℃ 孵育60 min，合成 cDNA。隨后進行qRT-PCR檢測，反應體系：cDNA 2 μL、正反向引物各1 μL、Master(ROX)(2×) 2 μL、FastStart Universal SYBR Green 10 μL、無RNAase水補足至20 μL，引物序列見表1，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)。用 2-ΔΔCt計算各基因表達水平。

1.9 ATP水平測定

將腦組織按5 μL/mg 加入冰預冷的0.4 mol/L 高氯酸，超聲勻漿；4 ℃ 12 000 r/min離心 15 min，取上清液，加入50%上清液體積的1 mol/L 碳酸鉀-甲醇混合液(體積比 4∶1)，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，用反相高效液相色譜法檢測ATP水平。色譜柱：Liehrospher 100 RP-18；流動相：10 mmol/L KH2PO,緩沖液(pH 7.4)；流速：1.2 mL/min。檢測波長：254 nm；檢測時間6 min。-20 ℃冷凍保存。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠不同時間點的NDS比較

與假手術組比較，模型組、5-BDBD干預組、5′-CTP干預組建模后第1、3、5、7天時的NDS均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，5-BDBD干預組各時間點NDS明顯降低(P<0.05)，5′-CTP干預組各時間點NDS明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠不同時間點的NDS比較分，n=12)

2.2 各組小鼠腦含水量比較

與假手術組比較，模型組、5′-CTP干預組建模后第7天時的病灶側腦含水量均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，5-BDBD干預組建模后第7天時的病灶側腦含水量明顯降低(P<0.05)，5′-CTP干預組明顯增加(P<0.05)，各組小鼠病灶對側和小腦含水量未見明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.3 各組小鼠炎癥因子水平比較

與假手術組比較，模型組、5-BDBD干預組、5-BDBD干預組建模后第1、3、5、7天時的IL-1β、TNF-α、IL-8水平均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，5-BDBD干預組以上指標在各時間點明顯降低(P<0.05)，5′-CTP干預組以上指標在各時間點明顯增加(P<0.05)。見表4～6。

表3 各組小鼠建模后第7天腦含水量比較

表4 各組小鼠不同時間點的IL-1β水平比較

2.4 各組小鼠P2X4和NLRP3表達水平

與假手術組比較，模型組、5-BDBD干預組、5′-CTP干預組建模后第7天時P2X4和NLRP3的蛋白及mRNA表達水平均明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，5-BDBD干預組以上指標在建模后第7天明顯下調(P<0.05)，5′-CTP干預組明顯上調(P<0.05)。見圖1、表6、7。

表5 各組小鼠TNF-α水平比較

表6 各組小鼠IL-8水平比較

圖1 各組小鼠P2X4和NLRP3蛋白Western blot

表6 各組小鼠建模后第7天P2X4和NLRP3表達水平比較

2.5 各組小鼠腦組織ATP水平比較

與假手術組比較，模型組、5-BDBD干預組、5′-CTP干預組建模后第7天時的ATP水平明顯增加(P<0.05);與模型組比較，5-BDBD干預組建模后第7天時的ATP水平明顯降低(P<0.05)，5′-CTP干預組明顯增加(P<0.05)。見表7。

表7 各組小鼠建模后第7天P2X4和NLRP3 mRNA

3 討 論

腦出血嚴重影響全球居民健康，且目前仍缺乏有效的治療手段，現有研究顯示腦出血后的繼發(fā)性腦損傷過程中炎性反應起到助推器作用[8-9]?；谘仔苑磻谀X出血中的重要作用機制，目前已出現諸多針對炎性反應的新的潛在治療方法，需要進一步深入研究。

ATP作為細胞能量代謝的主要來源，可作為細胞行使神經遞質激活嘌呤能P2X 的受體，在炎癥和免疫過程起作用[10-11]。本研究采用經典的注射自體血方法建立小鼠腦出血模型，綜合運用血清學及分子生物學實驗方法探究ATP/P2X4/NLRP3信號軸在腦出血繼發(fā)性炎性反應中的作用，結果顯示，與假手術組比較，模型組NDS、病灶側含水量明顯增加，表明小鼠在構建腦出血模型后腦組織出現明顯水腫，認知功能明顯下降。本研究顯示，與假手術組比較，模型組ATP水平、P2X4、NLRP3的蛋白和mRNA表達水平均明顯增加，表明P2X4、NLRP3有可能參與了腦出血后神經功能缺陷。同時，本研究發(fā)現，與假手術組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-8水平均明顯增加。IL-1β、TNF-α、IL-8均為目前最常研究的促炎細胞因子，可驅動炎癥信號傳遞，釋放促炎和消炎因子，這與此前研究結果較為一致[12-13]，表明腦出血后炎性反應明顯增加，可能通過促進炎性反應而加重腦組織損傷。本研究在給予P2X4抑制劑5-BDBD后，NDS明顯下降，病灶側含水量明顯減少，表明腦出血引起的腦水腫和神經功能缺陷得到明顯改善，可能與腦出血繼發(fā)性炎性程度明顯減輕有關；本研究同時發(fā)現NLRP3表達和炎癥因子水平也明顯降低，表明機體炎癥水平得到明顯控制，腦組織損傷程度得到明顯改善。有研究顯示，ATP/P2X4通路可激活NLRP3 炎癥小體，促使半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)激活，進一步促進炎癥因子 IL-1β 釋放，擴大炎性反應，使水腫進一步增大，進一步加劇炎性反應，而給予抑制劑后，其表達水平明顯減輕，初步表明ATP/P2X4/NLRP3信號軸參與了腦出血后炎性反應調控過程，給予抑制劑可有效減輕炎癥損傷[14-15]。為了更進一步證明ATP/P2X4/NLRP3信號軸的炎癥調控作用，本實驗設計將P2X4受體激動劑5′-CTP加入干預方案，結果顯示，在加入激動劑后神經認知功能缺損和炎性反應進一步加重，提示P2X4表達水平上調可促進炎性反應，進而進一步損傷腦組織，更加充分證實了 ATP/P2X4/NLRP3信號軸參與腦出血炎性反應調節(jié)過程，并以P2X4作為治療靶點可明顯減輕腦出血后的炎癥損傷，提示了其未來可成為治療靶點的潛力。

綜上所述，本研究發(fā)現ATP/P2X4/NLRP3信號軸參與腦出血炎癥損傷過程，而且可通過阻滯其通路激活從而有效改善腦出血后炎性反應，減輕損傷，從而改善預后，本研究結果將為進一步理解腦出血繼發(fā)性炎癥損傷機制奠定實驗基礎，為系統(tǒng)性研究腦出血繼發(fā)性炎癥損傷的治療手段提供了依據。