羅凱旋，王鈺宏，莫曉艷，井治聰，陳茉弦，敖麗娟

（昆明醫(yī)科大學(xué) 康復(fù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等組成[1]，對(duì)穩(wěn)定大腦微環(huán)境有著重要作用。一般情況下，分子量＞400 Da 的物質(zhì)無法進(jìn)入BBB[2]，在保護(hù)腦組織免受外來毒素侵?jǐn)_的同時(shí)，也限制了大部分治療物質(zhì)的進(jìn)入，成為治療腦組織疾病的一道障礙[3]。聚焦超聲（focused ultrasound,FUS）技術(shù)可開放BBB，增加治療藥物的遞送效率，進(jìn)而治療腦組織疾病[4-5]。由于具有安全、可逆的特點(diǎn)[6-7]，F(xiàn)US 開放BBB 臨床轉(zhuǎn)化潛力巨大，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。有學(xué)者研究不同子參數(shù)對(duì)FUS 開放BBB 的效率和安全性的影響，結(jié)果顯示聲壓（一般由輸出電壓控制）和脈寬對(duì)FUS 開放BBB 的效率影響最大[8]，本實(shí)驗(yàn)在控制其他條件不變的情況下，探索輸出電壓對(duì)FUS 經(jīng)顱開放BBB 有效性及安全性的影響，篩選出可安全、有效開放BBB 的輸出電壓值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及FUS治療系統(tǒng)

SonoVue?注射用六氟化硫微泡（平均粒徑7.5 μm）購(gòu)自云南省醫(yī)藥有限公司，Sigma?依文思藍(lán)（evans blue,EB）、Biosharp?4%多聚甲醛溶液、蘇木素-伊紅（hematoxylineosin staining,HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；聚焦超聲設(shè)備由昆明醫(yī)科大學(xué)康復(fù)學(xué)院提供（包括信號(hào)發(fā)生器、功率放大器、超聲探頭等）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF 級(jí)昆明小鼠55 只，雄性，8～9 周齡，體重≥28 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）K2020-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滇）K2020-0006。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為0 mV 組、100 mV組、200 mV 組、500 mV 組和1200 mV 組，每組11 只。各組8 只用于腦組織中EB 含量測(cè)定，3 只用于病理學(xué)檢查。本實(shí)驗(yàn)已通過昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（No：KMMU2019078）。

1.3 FUS開放小鼠BBB及取材

正確連接信號(hào)發(fā)生器、功率放大器、包封好的超聲探頭，并在信號(hào)發(fā)生器上設(shè)置好參數(shù)（基礎(chǔ)頻率為1 MHz，脈寬10 ms，總輻照時(shí)間120 s，脈沖重復(fù)頻率1 Hz），檢查儀器運(yùn)行正常。將小鼠放于預(yù)麻箱中，打開麻醉系統(tǒng)，調(diào)整至合適的氣流流速和麻醉劑（異氟烷）劑量。待小鼠麻醉進(jìn)入平穩(wěn)狀態(tài)后將其固定于小鼠適配器上，用麻醉面罩持續(xù)給予麻醉支持，調(diào)整固定位置使小鼠顱頂與地面平行；用電推剪和脫毛膏予小鼠顱頂皮膚脫毛備用；用鐵架臺(tái)將超聲探頭固定于小鼠頭皮上，中間用耦合劑填充，使探頭正對(duì)小鼠左側(cè)海馬（Bregma-2.7 mm，lateral+2.5 mm）。按照說明書配置SonoVue?注射用六氟化硫微泡（平均粒徑7.5 μm）溶液，配置好的微泡6 h 內(nèi)有效。根據(jù)體重用胰島素針抽取相應(yīng)體積（2.5 μL/g）的微泡，以一定速度經(jīng)尾靜脈注入。10 s后打開信號(hào)發(fā)生器并計(jì)時(shí)，120 s 后關(guān)閉開關(guān)。經(jīng)尾靜脈注入2.5 μL/g 的EB 溶液（濃度2%，示意圖見圖1）。FUS 輻照4 h 后常規(guī)生理鹽水灌注取鼠腦，用于HE 染色的標(biāo)本放入4%的多聚甲醛溶液中固定，EB 定量評(píng)價(jià)的標(biāo)本去除嗅球和小腦后待檢。

圖1 FUS開放BBB示意圖

1.4 腦組織藍(lán)染的定性評(píng)價(jià)及藍(lán)染程度觀察

肉眼觀察鼠腦上視面和冠狀切面EB 的滲出情況，并用單反相機(jī)對(duì)鼠腦上視面和冠狀切面拍照。

1.5 腦組織藍(lán)染程度的定量評(píng)價(jià)

以小鼠腦組織中EB 含量作為BBB 開放程度的指標(biāo)。

1.5.1 EB 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作配置25.00000 μg/mL、12.50000 μg/mL、6.25000 μg/mL、3.12500 μg/mL、1.56250 μg/mL 和0.78125 μg/mL 的EB溶液，用日本日立株式會(huì)社的U3010 型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)EB 溶液最大吸收峰，并檢測(cè)最大吸收峰處各濃度EB 溶液的吸光度值，每個(gè)濃度梯度測(cè)量3 次，取平均值。對(duì)各濃度梯度及其所對(duì)應(yīng)的吸光度值進(jìn)行回歸分析，求出回歸方程并繪制EB 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 各組腦組織EB 含量測(cè)定稱重后的腦組織切成小塊浸泡于含3 mL 甲酰胺溶液的5 mL 離心管中，做好標(biāo)記并置于37℃恒溫箱中萃取24 h，25℃下以3 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL 于比色杯中，以同體積甲酰胺作為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)EB 最大吸收峰處樣本溶液的吸光度值，每個(gè)樣本測(cè)量3 次，取平均值。將3 mL 甲酰胺中EB 總含量除以腦組織總重量得到每克腦組織的EB 含量。

1.6 HE 染色檢測(cè)不同輸出電壓下FUS 經(jīng)顱開放BBB小鼠腦組織的變化

小鼠腦組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水后用OTC 包埋，制備厚度為10 μm 的冷凍切片（選取FUS 輻照中心區(qū)域切片）。將小鼠腦組織切片采用HE 染色，經(jīng)脫水、透明后用中性樹脂封片，并在顯微鏡下觀察不同組小鼠腦組織變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊則做H檢驗(yàn)，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行秩變換后再行兩兩比較（LSD-t檢驗(yàn)）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同輸出電壓下FUS經(jīng)顱開放BBB的小鼠腦組織藍(lán)染情況

0 mV 組腦組織未見EB 滲出，100 mV 組、200 mV組、500 mV 組、1 200 mV 組超聲未輻照區(qū)域腦組織未見EB 滲出，輻照區(qū)域均有不同面積和程度的BBB開放，BBB 開放區(qū)域與輻照位置一致，說明當(dāng)輸出電壓為100 mV、200 mV、500 mV、1 200 mV 時(shí)，F(xiàn)US 可以開放BBB，且隨著輸出電壓的升高，腦組織上視面和冠狀面所對(duì)應(yīng)的BBB 開放面積和藍(lán)染程度逐漸增加，見圖2。

圖2 不同輸出電壓下FUS開放BBB的小鼠腦組織藍(lán)染情況

2.2 不同濃度EB溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)EB 在620 nm 處有最大吸收峰，以甲酰胺作為空白調(diào)零液，對(duì)各梯度濃度的EB 吸光度及其濃度進(jìn)行回歸分析，回歸方程：Y=12X+0.0925（Y為EB，X為吸光度值），R2=0.9999，擬合性好，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 不同濃度EB溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 各組小鼠腦組織EB含量比較

0 mV 組、100 mV 組、200 mV 組、500 mV 組、1 200 mV 組小鼠腦組織EB 含量分別為（2.81±0.97）μg/g、（3.87±0.51）μg/g、（13.07±1.47）μg/g、（34.2±19.4）μg/g、（76.83±16.92）μg/g，經(jīng)H檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=35.958，P=0.000）。100 mV 組、200 mV 組、500 mV 組和1 200 mV 組小鼠腦組織EB含量分別與0 mV 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即當(dāng)輸出電壓為100 mV、200 mV、500 mV和1 200 mV 時(shí)，F(xiàn)US 可開放BBB。200 mV 組、500 mV組、1200 mV 組小鼠腦組織EB 含量分別與100 mV組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且500 mV組和1200 mV 組小鼠腦組織EB 含量高于200 mV 組（P＜0.05），1 200 mV 組高于500 mV 組（P＜0.05），即隨著輸出電壓升高，EB 滲透量逐漸增多，提示BBB 開放效率逐漸升高。

2.4 不同輸出電壓下FUS經(jīng)顱開放BBB的小鼠腦組織受輻照情況

0 mV 組、100 mV 組、200 mV 組小鼠大腦受 超聲輻照區(qū)域腦組織未見明顯異常，均無紅細(xì)胞滲出。500 mV 組小鼠大腦超聲作用區(qū)域有紅細(xì)胞滲出，該輸出電壓下FUS 同時(shí)開放BBB 不能兼顧安全性。1 200 mV 組小鼠大腦超聲作用區(qū)域腦組織有大量紅細(xì)胞滲出，該輸出電壓下FUS 亦無法安全開放BBB，見圖4。

圖4 不同輸出電壓下FUS經(jīng)顱開放BBB小鼠腦組織受輻照情況（HE染色）

3 討論

FUS 可將超聲能量集中于焦點(diǎn)并于局部發(fā)揮作用。放大鏡是FUS 的一個(gè)形象化類比[9]，把放大鏡置于陽光下，入射太陽光可匯聚于焦點(diǎn)，在焦點(diǎn)范圍內(nèi)更容易引燃可燃物，而在焦點(diǎn)外的區(qū)域則難以實(shí)現(xiàn)。由于其聚焦的特性，相比平面超聲，F(xiàn)US 作用更為集中，在神經(jīng)調(diào)控等治療領(lǐng)域更有優(yōu)勢(shì)。

BBB 的存在為腦組織疾病的治療帶來一定困難，開放BBB 有助于治療藥物進(jìn)入腦組織，優(yōu)化療效[10]。靜脈注射甘露醇是常見的BBB 開放方法，此方法可導(dǎo)致BBB 廣泛開放，不具靶向性；電穿孔技術(shù)需將電極插入腦組織中，屬有創(chuàng)治療，難以推廣[11]。FUS 聯(lián)合微泡可安全、有效且可逆[6-7]地開放BBB 并提高治療藥物的遞送效率[12-13]。有研究表明，F(xiàn)US 開放BBB 可使腦惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型小鼠大腦腫瘤組織中貝伐單抗的含量增加至對(duì)照組的5.7 倍，小鼠中位生存期延長(zhǎng)58%[4]。另1 項(xiàng)研究利用FUS 使BBB 局部開放，小鼠腦腫瘤組織中替莫唑胺含量明顯增加[14]。此外，F(xiàn)US 開放BBB 還可提高基因[15]、免疫細(xì)胞[16]、免疫因子[17]和天然化合藥物[18]的遞送效率。除了提高治療藥物的入腦效率外，F(xiàn)US 開放BBB 本身也具有治療作用。JORD?O等[19]運(yùn)用FUS 經(jīng)顱開放AD 小鼠大腦BBB，在未遞藥的情況下觀察到了β-淀粉樣蛋白斑塊明顯減小，而且星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，這兩種膠質(zhì)細(xì)胞中的β-淀粉樣蛋白含量增加，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活可能與β-淀粉樣蛋白的內(nèi)化作用有關(guān)。FUS 可在微泡作用下開放BBB，醫(yī)學(xué)界對(duì)FUS 開放BBB 的機(jī)制進(jìn)行大量探究，目前普遍認(rèn)為FUS 開放BBB 的機(jī)制主要與超聲波空化作用有關(guān)，當(dāng)微泡流經(jīng)FUS 作用區(qū)域時(shí)，會(huì)被不斷壓縮、膨脹甚至爆破，使血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接出現(xiàn)松動(dòng)，導(dǎo)致BBB 開放[20]。

FUS 是否能夠開放BBB 與超聲參數(shù)密切相關(guān)。有學(xué)者就不同子參數(shù)對(duì)FUS 開放BBB 的效率和安全性的研究結(jié)果顯示，聲壓（一般由輸出電壓控制）和脈寬對(duì)FUS 開放BBB 的效率影響最大，并且與BBB 開放區(qū)域組織的損壞程度高度相關(guān)，而脈沖重復(fù)頻率、總輻照時(shí)間、微泡種類及劑量等參數(shù)對(duì)FUS 開放BBB 的安全性影響較小[8]。本研究主要是在固定其他參數(shù)的情況下探討最佳的輸出電壓值。由于技術(shù)原因，早期的FUS 實(shí)驗(yàn)需要移除顱骨[21]，但隨著FUS 技術(shù)和設(shè)備的進(jìn)步，目前已實(shí)現(xiàn)經(jīng)顱FUS 治療。經(jīng)顱FUS 聯(lián)合微泡開放BBB 的實(shí)驗(yàn)中大多采用低頻超聲，因?yàn)槠湓诖┻^顱骨過程中產(chǎn)生的聲束路徑變形較小，可一定程度上減少顱骨的不利影響[22]。另外，大部分實(shí)驗(yàn)使用的脈沖重復(fù)頻率為1 Hz[23]，因此本研究選用基礎(chǔ)頻率1 MHz 的低頻超聲探頭，并將脈沖重復(fù)頻率設(shè)定為1 Hz。輸出電壓主要影響換能器所產(chǎn)生的聲壓值，在一定范圍內(nèi)，輸出電壓越高，所產(chǎn)生聲壓也越高。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)FUS 基礎(chǔ)頻率為1 MHz，脈寬10 ms，總輻照時(shí)間120 s，脈沖重復(fù)頻率1 Hz，SonoVue?注射用六氟化硫微泡（平均粒徑7.5 μm）劑量2.5 μL/g時(shí)，輸出電壓為100 mV、200 mV、500 mV、1200 mV時(shí)FUS 均能夠開放BBB。100 mV 時(shí)BBB 開放效率較低，而200 mV、500 mV、1 200 mV 的輸出電壓可高效開放BBB；就安全性而言，100 mV、200 mV的輸出電壓可安全開放BBB，而500 mV、1200 mV在開放BBB 的同時(shí)難以保證安全性，200 mV 既能有效開放BBB，又能保障安全性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中筆者將把200 mV 作為輸出電壓。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)有FUS 治療系統(tǒng)，固定FUS 基礎(chǔ)頻率為1 MHz，脈寬10 ms，總輻照時(shí)間120 s，脈沖重復(fù)頻率1 Hz，SonoVue?注射用六氟化硫微泡（平均粒徑7.5 μm）劑量2.5 μL/g，探索出可經(jīng)顱、高效、安全開放小鼠BBB 的輸出電壓為200 mV，為下一步FUS 經(jīng)顱無創(chuàng)開放BBB 治療腦組織疾病提供依據(jù)。