董麗紅，羅牡康，張名位，張瑞芬，鄧 梅，陳燕霞，賈栩超

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610）

皮膚老化包括自然老化和光老化，研究表明，光老化占面部老化的80%以上，太陽紫外線輻射是造成皮膚光老化的主要原因[1]。紫外線分為長(zhǎng)波紫外線（ultraviolet A，UVA）（波長(zhǎng)320～400 nm），中波紫外線（ultraviolet B，UVB）（波長(zhǎng)280～320 nm）和短波紫外線（波長(zhǎng)100～280 nm）。UVB主要作用于皮膚最外層的表皮，是引起皮膚損傷的主要波段[2]。氧化損傷是UVB所致皮膚損傷的重要機(jī)制，其中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）起著關(guān)鍵性的作用。UVB可以導(dǎo)致皮膚中的ROS過量產(chǎn)生，大量的ROS可直接或間接地氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化物，進(jìn)一步形成脂褐素，破壞表皮細(xì)胞內(nèi)酶性和非酶性抗氧化防御系統(tǒng)，造成細(xì)胞損傷，容易誘發(fā)皮膚出現(xiàn)局部紅斑、色素沉著異常、皺紋甚至皮膚癌等病理狀態(tài)[3]。因此，抗氧化是預(yù)防皮膚紫外損傷或延緩皮膚光老化的一個(gè)重要途徑。研究表明，一些天然的植物化學(xué)組分表現(xiàn)出較好的抑制紫外線致皮膚氧化損傷潛力[4-7]，鑒于其安全性更高、功能活性更突出等優(yōu)點(diǎn)受到學(xué)者們的極大關(guān)注，從天然植物化合物中開發(fā)皮膚光保護(hù)劑已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞模型因其實(shí)驗(yàn)條件可控、影響因素少且可模擬機(jī)體生理環(huán)境而被廣泛用于皮膚氧化損傷的體外研究，最常用的是人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）或人表皮成纖維細(xì)胞[8-9]。其中，角質(zhì)形成細(xì)胞是構(gòu)成人表皮的主要細(xì)胞，而UVB作用于皮膚表皮會(huì)引起角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡[10]，因此UVB誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞損傷更適合于構(gòu)建皮膚氧化損傷細(xì)胞模型，且近年來，已有部分研究報(bào)道了天然多酚類物質(zhì)對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[9-11]。

原花青素是廣泛存在于自然界中的一大類多酚化合物，由表兒茶素和/或兒茶素為單元聚合而成，根據(jù)其單體聚合度（degree of polymerization，DP）分為單體（DP＝1）、寡聚體（DP＝2～5）和多聚體（DP＞5）；根據(jù)單體連接方式的不同，可分為A型（C2-O-C7或C2-O-C5連接）和B型（C4-C8或C4-C6連接）兩種[12]。大量研究已證實(shí)，原花青素因含有多個(gè)酚羥基而顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除能力，同時(shí)還具有一些生理活性，如抗炎癥、抗衰老、抗腫瘤、抗心血管疾病等[13-15]。近年來研究表明，原花青素對(duì)紫外線有很強(qiáng)的吸收，可以有效抑制紫外線照射引起的皮膚損傷。李桂雙等[16]發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可通過增加細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活力，減少丙二醛（malondialdehyde，MDA）生成量，從而對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷發(fā)揮防護(hù)作用。史云容等[17]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素具有抗紫外線所致光老化早期血管生成的作用，能夠修復(fù)紫外線照射誘導(dǎo)的皮膚屏障功能損傷。王剛等[18]發(fā)現(xiàn)黑果枸杞原花青素能減輕D-半乳糖皮下注射聯(lián)合紫外線（UVA＋UVB）輻射后小鼠頸背部皮膚氧化損傷及炎癥反應(yīng)，延緩皮膚衰老。以上研究中原花青素提取物均以B型原花青素為主，而對(duì)于A型原花青素的抗紫外線損傷鮮有報(bào)道。

荔枝果殼作為荔枝加工的主要副產(chǎn)物，富含原花青素類化合物等多種活性成分，其中以自然界少見的A型原花青素為主，具有很高的藥用價(jià)值。Sui Yong等[19]利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析荔枝果殼原花青素組成，發(fā)現(xiàn)其含有兒茶素、表兒茶素、12 種原花青素二聚體和6 種原花青素三聚體，并指出其中A型原花青素的含量遠(yuǎn)高于B型原花青素，且最主要的單體和低聚原花青素是表兒茶素、A型原花青素二聚體（A1和A2）。目前，荔枝果殼原花青素的生物活性研究已被廣泛報(bào)道，具有良好的抗氧化[20]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[21]、改善高血糖癥[15]、抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶[22]等多種有益的生物活性，在食品、藥品以及化妝品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。也有研究表明荔枝果殼提取物具有良好的亮膚增白和抗光老化效果[23]，但其對(duì)UVB誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞氧化損傷是否具有保護(hù)作用尚不清楚。此外，先前研究均以原花青素粗提物為試材，其中發(fā)揮活性作用的主要活性物質(zhì)是否為A型原花青素仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型，評(píng)價(jià)荔枝果殼低聚原花青素（litchi pericarp oligomolymeric procyanidins，LPOPC）及其單體組分對(duì)UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，考察A型原花青素用于防護(hù)皮膚紫外損傷領(lǐng)域的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘妃子笑’荔枝 廣州水果批發(fā)市場(chǎng)；對(duì)氨基苯甲酸（para-aminobenzoic acid，PABA）（純度≥99.9%） 美國Sigma公司；HaCaT細(xì)胞 美國模式培養(yǎng)物集存庫。

Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（青霉素-鏈霉素）溶液、0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2，下同） 美國Gibco公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ROS、SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）、GSH-Px、還原型谷胱甘肽（glutathion，GSH）、MDA、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2G超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HeraCell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher Scientific公司；DMI 4000B熒光倒置顯微鏡 德國Leica公司；Infinite M200pro熒光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；5702RH低速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；HOPE-MED 8140紫外輻照燈 天津開發(fā)區(qū)合浦工貿(mào)有限公司；WB20恒溫水浴鍋 瑞士Salvis公司。

1.3 方法

1.3.1 LPOPC及其單體化合物的制備及分離純化

取荔枝去殼后參考文獻(xiàn)[24]的方法由新鮮荔枝果殼制備LPOPC。采用香草醛法測(cè)定LPOPC原花青素含量為96.38 g/100 g（以兒茶素計(jì)），純度為96.38%。

2 g LPOPC經(jīng)反相中壓柱層析分離，依次以1.5 L不同體積分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）甲醇溶液以及無水甲醇進(jìn)行洗脫，流速為10 mL/min，分別得到組分1～10。組分5（203.2 mg）經(jīng)過葡聚糖凝膠LH-20柱分離，流動(dòng)相為無水甲醇，流速5 mL/min，收集洗脫液得到化合物1（7.0 mg）和化合物2（155.2 mg）。組分6（316.4 mg）經(jīng)過葡聚糖凝膠LH-20柱分離，流動(dòng)相為無水甲醇，流速5 mL/min，收集洗脫液得到化合物3（87.8 mg）和化合物4（13.4 mg）。組分7（53.6 mg）經(jīng)過葡聚糖凝膠LH-20柱分離，流動(dòng)相為無水甲醇，流速5 mL/min，收集洗脫液得到化合物5（16.7 mg）。組分8（18.8 mg）經(jīng)高效液相色譜分析，流動(dòng)相為65%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液，流速5 mL/min，收集洗脫液得到化合物6（5.5 mg）。綜上，由LPOPC制備得到6 種單體化合物1～6，經(jīng)鑒定（相關(guān)研究尚未發(fā)表）這6 種單體化合物分別為木脂素（meliasendanin B）、表兒茶素、原花青素A2、原花青素A1、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷，純度均在99.0%以上。

1.3.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)

將1 mL凍存的HaCaT細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入6 mL完全培養(yǎng)基（含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）FBS和1%雙抗溶液的DMEM）后放入培養(yǎng)箱（37 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2，下同）內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用1 mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心（4 000 r/min、5 min）后用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 藥物安全劑量和UVB輻照劑量的確定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)液后用100 μL PBS洗滌2 次，分別加入100 μL含不同質(zhì)量濃度（0（即對(duì)照組）、50、100、150、200 μg/mL）LPOPC或含不同濃度（0、12.5、25、50、100 μmol/L）PABA、6 種單體化合物的1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）BSA DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。采用CCK-8分析細(xì)胞活力，以確定PABA、LPOPC及6 種單體化合物對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用的安全劑量范圍。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液后用100 μL PBS洗滌2 次，然后加入100 μL PBS覆蓋細(xì)胞，用紫外輻照裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行UVB照射，照射劑量分別為0、50、100、150、200、250 mJ/cm2。照射后用PBS洗滌細(xì)胞，采用CCK-8分析細(xì)胞活力以確定合適的輻射劑量。

1.3.4 抑制UVB輻照損傷實(shí)驗(yàn)分組

參考文獻(xiàn)[25]的方法并略有改動(dòng)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照（Con）組、UVB照射組、8 個(gè)藥物組（LPOPC、PABA及6 種單體化合物）。HaCaT細(xì)胞（106個(gè)/mL）以2 mL/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)液后加入1 mL PBS洗滌2 次，然后對(duì)照組和UVB照射組分別加入2 mL 1% BSA DMEM；LPOPC、PABA、單體化合物組加入2 mL含相應(yīng)藥物的1% BSA DMEM，其中LPOPC質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100 μg/mL，PABA和6 種單體化合物濃度分別為6.25、12.5、25、50 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2 次，然后加入1 mL PBS覆蓋細(xì)胞，除對(duì)照組外，其余各組經(jīng)142 mJ/cm2UVB照射，用PBS洗滌細(xì)胞。收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，考察藥物對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷的抑制作用。

1.3.5 細(xì)胞活力的測(cè)定

參照CCK-8說明書測(cè)定1.3.4節(jié)中各組細(xì)胞活力（以細(xì)胞存活率表征）。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的測(cè)定

HaCaT細(xì)胞（106個(gè)/mL）以2 mL/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及處理方法參考1.3.4節(jié)。用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofuorescin diacetate，DCFH-DA）熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS相對(duì)含量，參照試劑盒說明書原位裝載探針，用DMEM將DCFH-DA稀釋至10 μmol/L，每孔加入1 mL DCFH-DA溶液，將6 孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞3 次，用熒光酶標(biāo)儀在500 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定DCFH-DA熒光強(qiáng)度，按下式計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px活力和GSH、MDA含量的測(cè)定

HaCaT細(xì)胞（106個(gè)/mL）以2 mL/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及處理方法同1.3.4節(jié)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行加藥處理，對(duì)照組和UVB照射組更換為1% BSA DMEM；LPOPC組和PABA組及6 種單體化合物組分別更換為含100 μg/mL LPOPC和50 μmol/L PABA及6 種單體化合物的1% BSA DMEM。參考相應(yīng)試劑盒說明書測(cè)定SOD、CAT和GSH-Px活力以及GSH、MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和作圖。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPOPC及其單體化合物對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

由圖1可知，隨著藥物劑量的增大，HaCaT細(xì)胞活力逐漸降低。與對(duì)照組相比，50 μg/mL LPOPC對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響（P＞0.05），當(dāng)LPOPC質(zhì)量濃度增加至100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力為（84.12±7.03）%，而當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加至150 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降至（53.47±4.40）%（P＜0.05）。0～50 μmol/L PABA和6 種單體化合物處理細(xì)胞活力均大于80%，而當(dāng)處理濃度增加至100 μmol/L時(shí)，僅表兒茶素處理細(xì)胞活力仍大于80%，其余化合物處理細(xì)胞活力均小于80%。一般細(xì)胞活力大于80%可視為藥物對(duì)細(xì)胞無毒性，因此，選擇12.5、25、50、100 μg/mL LPOPC和6.25、12.5、25、50 μmol/L PABA及6 種單體化合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同劑量的LPOPC（A）、PABA和6 種單體化合物（B）對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effect of LPOPC (A), PABA and six monomeric compounds (B)at different concentrations on HaCaT cell viability

2.2 UVB輻照對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)所選UVB照射劑量對(duì)HaCaT細(xì)胞活力有顯著影響，細(xì)胞活力隨著UVB照射劑量的增大而顯著降低（P＜0.05），當(dāng)照射劑量達(dá)到250 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞活力僅為（20.95±9.88）%。通過SPSS 24.0軟件對(duì)細(xì)胞活力和照射劑量進(jìn)行擬合分析，結(jié)果表明細(xì)胞活力為50%時(shí)的照射劑量為142 mJ/cm2，后續(xù)研究采用該劑量建立UVB輻照損傷細(xì)胞模型。

圖2 UVB輻射強(qiáng)度對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響Fig. 2 Effect of UVB intensity on HaCaT cell viability

2.3 LPOPC及其單體化合物對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的影響

由圖3可知，LPOPC及6 種單體化合物對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷均有一定的保護(hù)作用。與對(duì)照組相比，UVB照射組細(xì)胞活力顯著降低至（48.74±1.26）%（P＜0.05）；與UVB照射組相比，12.5 μg/mL LPOPC處理細(xì)胞活力無顯著變化（P＞0.05），25、50、100 μg/mL LPOPC處理可顯著提高細(xì)胞活力（P＜0.05），100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到（84.26±10.32）%。經(jīng)6.25～50 μmol/L的6 種單體化合物處理后，HaCaT細(xì)胞活力均顯著高于UVB照射組（P＜0.05）；50 μmol/L時(shí)，meliasendanin B、表兒茶素、原花青素A2、原花青素A1、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷處理組細(xì)胞活力分別達(dá)到（75.22±14.94）%、（96.96±1.61）%、（96.19±10.14）%、（93.10±10.02）%、（82.28±5.15）%和（69.31±1.84）%；經(jīng)相同濃度的3 種原花青素單體（表兒茶素、原花青素A2和原花青素A1）處理后，細(xì)胞活力均高于其他類單體組分（meliasendanin B、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷），且相同濃度的原花青素A2和陽性藥物PABA處理后細(xì)胞活力相當(dāng)，提示荔枝果殼A型原花青素對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷具有良好的保護(hù)作用。此外，隨著各化合物劑量的增加，細(xì)胞活力逐漸升高，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此選取最高作用劑量，即100 μg/mL LPOPC和50 μmol/L PABA及6 種單體化合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同濃度的LPOPC、PABA和6 種單體化合物對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞活力的影響Fig. 3 Effects of LPOPC, PABA and six monomeric compounds at different concentrations on cell viability of HaCaT cells induced by UVB

2.4 LPOPC及其單體化合物對(duì)UVB誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的影響

ROS是細(xì)胞氧化損傷的重要標(biāo)志因子，通過檢測(cè)DCFH-DA被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化的DCF熒光強(qiáng)度來分析細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量變化，從而反映出細(xì)胞氧化損傷的程度[26]。如圖4所示，UVB照射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量顯著升高至對(duì)照組的2.94 倍（P＜0.05）。而LPOPC及6 種單體化合物的干預(yù)處理對(duì)UVB誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的升高均有顯著抑制作用（P＜0.05），其中表兒茶素、原花青素A2和原花青素A1的干預(yù)作用較強(qiáng)，且原花青素A2對(duì)UVB誘導(dǎo)ROS生成的抑制作用優(yōu)于陽性藥物PABA組，其干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量趨于對(duì)照組。以上結(jié)果表明，荔枝果殼原花青素類化合物，尤其是原花青素A2，能顯著降低UVB誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量（P＜0.05），有效減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而保護(hù)細(xì)胞。

圖4 LPOPC、PABA和6 種單體化合物處理對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的影響Fig. 4 Effects of LPOPC, PABA and six monomeric compounds on intracellular ROS relative content of HaCaT induced by UVB

2.5 LPOPC及其單體化合物對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力、GSH含量和MDA含量的影響

細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶和非酶類抗氧化物GSH是細(xì)胞氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的重要組成部分，能有效清除自由基，阻止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)生，這些物質(zhì)水平均可以間接反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度[27]。由圖5可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)UVB照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT、GSH-Px活力和GSH含量均顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著增加（P＜0.05），表明UVB照射會(huì)打破HaCaT細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)平衡，對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。LPOPC及6 種單體化合物的干預(yù)處理對(duì)受損細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px、GSH、MDA水平的變化均有不同程度的改善作用?？傮w來看，表兒茶素、原花青素A2和原花青素A1的作用強(qiáng)于meliasendanin B、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷，且與對(duì)照組相比，原花青素A2干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活力和GSH含量無顯著差異（P＞0.05），與陽性藥物PABA作用效果相當(dāng)。上述結(jié)果表明，荔枝果殼原花青素能顯著增強(qiáng)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，且6 種單體化合物中原花青素A2的保護(hù)作用最強(qiáng)。

圖5 LPOPC、PABA和6 種單體化合物處理對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)SOD活力（A）、CAT活力（B）、GSH-Px活力（C）、GSH含量（D）和MDA含量（E）的影響Fig. 5 Effects of LPOPC, PABA and six monomeric compounds on the activity of SOD (A), CAT (B), and GSH-Px (C), and the contents of GSH (D) and MDA (E) in HaCaT cells induced by UVB

3 討 論

皮膚是人體抵御不良環(huán)境或有害物質(zhì)的第一道物理屏障，UVB是造成皮膚光老化的主要波段，UVB輻射會(huì)引起角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷甚至死亡[28]。目前，關(guān)于UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷已有較多研究報(bào)道[9-11,16,26]，但很少有研究涉及不同輻射劑量與細(xì)胞活力的關(guān)系。本研究首先探究了不同輻照劑量UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著輻照劑量的增加，HaCaT細(xì)胞活力逐漸降低，這與李辰等[29]研究得到的趨勢(shì)一致，然而，李辰等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)照射劑量達(dá)到80 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞活力已降至30%左右，而本研究中照射劑量達(dá)到200 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞活力降至34.06%；He Yong等[30]測(cè)定了經(jīng)100～400 mJ/cm2UVB照射的HaCaT細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)100 mJ/cm2UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞活力無顯著影響，當(dāng)照射劑量達(dá)到400 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞活力仍然可達(dá)到77.59%，這些差異可能與輻照設(shè)備和處理方式不同有關(guān)。為方便后續(xù)研究，本研究選擇UVB照射后細(xì)胞活力為50%時(shí)的照射劑量（142 mJ/cm2）建立紫外線損傷HaCaT細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)荔枝果殼原花青素對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，25、50、100 μg/mL LPOPC處理后HaCaT細(xì)胞活力相比UVB組均顯著升高（P＜0.05），且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，與陽性對(duì)照天然防曬藥物PABA的作用趨勢(shì)相近。由此推測(cè)荔枝果殼原花青素對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚損傷具有良好的保護(hù)作用。

紫外線輻射引起皮膚損傷的主要原因是產(chǎn)生過多的ROS和自由基。經(jīng)UVB照射后，HaCaT細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量ROS，破壞抗氧化防御系統(tǒng)，使抗氧化酶活力下降，產(chǎn)生大量的自由基并攻擊細(xì)胞，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，引起細(xì)胞氧化損傷[31]。SOD、CAT和GSH-Px是機(jī)體中重要的抗氧化酶，這些酶能夠通過多種內(nèi)源性細(xì)胞防御系統(tǒng)消除ROS，并對(duì)細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用[8]。多項(xiàng)研究證實(shí)，多羥基化合物具有清除ROS和抗脂質(zhì)過氧化的作用，可以有效延緩皮膚光老化[4-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPOPC能有效降低經(jīng)UVB輻射后的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS相對(duì)含量，顯著增加受損細(xì)胞的SOD、CAT、GSH-Px活力和GSH含量，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，從而提升角質(zhì)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，抑制UVB輻射所致的皮膚損傷。有研究表明，柿子低聚原花青素能增強(qiáng)UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)的活性，抑制ROS的產(chǎn)生[32]，與本研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于原花青素的抗紫外線致皮膚氧化損傷及光老化的研究已有不少報(bào)道，但以針對(duì)葡萄籽、黑果枸杞等來源的B型原花青素的研究居多[33-36]，而對(duì)于A型原花青素的抗光老化效果鮮有報(bào)道。荔枝果殼中富含以A型結(jié)構(gòu)為主的原花青素類化合物，LPOPC緩解皮膚氧化損傷的主要活性組分尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定并比較LPOPC及各單體化合物（meliasendanin B、表兒茶素、原花青素A2、原花青素A1、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷）對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化相關(guān)酶SOD、CAT、GSH-Px的活力和非酶類抗氧化物GSH以及過氧化產(chǎn)物ROS、MDA的水平，研究發(fā)現(xiàn)表兒茶素、原花青素A2和原花青素A1的抗氧化損傷能力明顯強(qiáng)于meliasendanin B、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷，這可能與原花青素類化合物相比于黃酮苷類化合物因含有更多的活性羥基而具有更強(qiáng)的自由基清除能力有關(guān)[37-38]。且有研究報(bào)道，表兒茶素和原花青素A2是荔枝果殼中最主要的原花青素類化合物[19-20]，提示表兒茶素和原花青素A2是荔枝果殼原花青素中對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷具有防護(hù)作用的主要活性組分。此外，原花青素A2對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)，與陽性藥物PABA相當(dāng)，提示原花青素A2具有作為天然防曬物質(zhì)代替PABA的可能性。

綜上所述，荔枝果殼原花青素對(duì)UVB誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的HaCaT細(xì)胞具有保護(hù)作用，其中原花青素A2是保護(hù)作用最強(qiáng)的活性組分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為荔枝果殼A型原花青素及其主要活性組分原花青素A2在防護(hù)皮膚紫外損傷領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考，但仍需進(jìn)一步研究以闡明其保護(hù)途徑和調(diào)控機(jī)制。