劉金美，付翠元，馬 坤，李 哲，賈紹輝,4,*

（1.武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079；2.濟(jì)南大學(xué)體育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250024；3.湖北開放大學(xué)經(jīng)濟(jì)貿(mào)易學(xué)院，湖北 武漢 430074；4. 武漢體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省運(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430079）

眾所周知，運(yùn)動(dòng)能力下降的主要原因是運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生，運(yùn)動(dòng)疲勞是指“機(jī)體的生理過程不能維持其機(jī)能在某一特定水平或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”的一種生理現(xiàn)象[1]。運(yùn)動(dòng)疲勞容易誘發(fā)運(yùn)動(dòng)損傷，直接影響人體的正常運(yùn)動(dòng)，降低運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力和表現(xiàn)。線粒體是機(jī)體內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，已有研究顯示運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生與骨骼肌線粒體呼吸鏈的損傷有直接關(guān)系，會(huì)引起骨骼肌線粒體鈣代謝、膜流動(dòng)性和膜脂質(zhì)過氧化的改變。脂質(zhì)過氧化水平增高會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜分子動(dòng)力學(xué)改變和內(nèi)膜組分活性的變化，并且劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)引起ATP酶活性降低，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，引發(fā)運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生[2]。報(bào)道顯示，通過補(bǔ)劑的方式保持線粒體功能的完整性可能對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的消除和運(yùn)動(dòng)能力提高具有顯著效果，例如，Liu Lixia等[3]發(fā)現(xiàn)吡咯喹啉醌可通過改善小鼠線粒體功能預(yù)防運(yùn)動(dòng)性疲勞和氧化損傷的產(chǎn)生，提高小鼠運(yùn)動(dòng)能力。Zhu Hongkang等[4]也發(fā)現(xiàn)馬蹄蓮可通過減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生保護(hù)線粒體功能的完整性，從而降低骨骼肌疲勞，提高骨骼肌運(yùn)動(dòng)能力。

玉米肽是玉米蛋白經(jīng)定向酶切及特定小肽分離技術(shù)獲得的小分子多肽，其營(yíng)養(yǎng)豐富，并且具有穩(wěn)定性高、溶解性好、易吸收等優(yōu)點(diǎn)[5]。近年來，玉米肽的應(yīng)用范圍越來越廣泛，包括降血壓、醒酒、護(hù)肝、增強(qiáng)免疫及運(yùn)動(dòng)能力、抗氧化應(yīng)激等。

F值是指支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的物質(zhì)的量比值，正常人體血液中F值為3.0～3.5，高F值活性肽的F值應(yīng)大于20[6]。高F值活性肽中支鏈氨基酸含量高，具有為機(jī)體提供能量、促進(jìn)胰島素分泌、促進(jìn)蛋白合成等重要生理功能[7]。比較普通玉米肽與高F值玉米肽的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，高F值玉米肽具有更強(qiáng)的清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的能力，說明高F值玉米肽相比普通玉米肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力[8]。

鑒于高F值玉米肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力，而體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多導(dǎo)致的線粒體損傷是運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生、運(yùn)動(dòng)能力下降的重要原因，因此推測(cè)高F值玉米肽具有潛在的抗運(yùn)動(dòng)疲勞、提高運(yùn)動(dòng)能力的功效。本研究選取SD大鼠，在長(zhǎng)期給予高F值玉米肽并進(jìn)行游泳訓(xùn)練后，進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)，分析高F值玉米肽對(duì)大鼠骨骼肌氧自由基清除能力及線粒體功能的影響，考察高F值玉米肽對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響，以期為明確高F值玉米肽的抗運(yùn)動(dòng)疲勞、提高運(yùn)動(dòng)能力功效提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

80 只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量約250 g，購(gòu)于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2016-0018，使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2021-0087。

高F值玉米肽（F值為27.8）由山東中食都慶生物科技有限公司提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；ATP合成酶與水解酶檢測(cè)試劑盒美國(guó)Abcam生物技術(shù)公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；核因子2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）抗體 美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；線粒體融合蛋白（mitofusin2，Mfn2）、動(dòng)力相關(guān)蛋白（dynaminrelated protein，Drp1）、GAPDH抗體 美國(guó)Cell Signaling生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lactate-scout血乳酸測(cè)定儀 德國(guó)EFK公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及游泳訓(xùn)練

80 只SPF級(jí)雄性SD大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為4 組，每組20 只，分別為對(duì)照組（A組）、高F值玉米肽低劑量組（B組）、高F值玉米肽中劑量組（C組）與高F值玉米肽高劑量組（D組）。B、C、D組每天灌胃給予0.1、0.2、0.4 g/kgmb高F值玉米肽（采用生理鹽水配制成0.1 g/mL混懸液），A組給予等體積生理鹽水。每天上午給藥，下午進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間為每天1 h，每周第1～5天連續(xù)運(yùn)動(dòng)5 d、安靜狀態(tài)休息2 d，共訓(xùn)練8 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日進(jìn)行一次性負(fù)重力竭運(yùn)動(dòng)，負(fù)重為體質(zhì)量5%，參考文獻(xiàn)[9-10]確定力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠沉入水中10 s不再浮上水面，撈出后在平面上無法完成翻正反射。記錄大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間并測(cè)定其血乳酸濃度。待安靜狀態(tài)休息3 d后，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取外周血以及骨骼肌組織。

1.3.2 血乳酸濃度測(cè)定

分別于力竭運(yùn)動(dòng)前、力竭運(yùn)動(dòng)后5 min、力竭運(yùn)動(dòng)后15 min，取實(shí)驗(yàn)大鼠尾靜脈血1 滴，利用血乳酸測(cè)定儀檢測(cè)并記錄其血乳酸濃度。

1.3.3 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

稱取骨骼肌組織約1 mg，加入1 mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），60 Hz勻漿2 min后超聲1 min。收集超聲后組織液，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清液分別按照MDA以及SOD檢測(cè)試劑盒說明書要求檢測(cè)各組大鼠肌肉組織MDA含量以及SOD活力，結(jié)果均以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 Western blot檢測(cè)抗氧化應(yīng)激蛋白及線粒體融合與分裂蛋白的表達(dá)

取大鼠腓腸肌100 mg，冰浴上加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞和一定劑量蛋白酶抑制劑，60 Hz脈沖條件對(duì)組織進(jìn)行勻漿（勻漿4 次，每次2 min、間隔20 s），然后用超聲裂解儀裂解釋放總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。裂解后的細(xì)胞懸液中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5～10 min使蛋白完全變性。取制備好的40 μg蛋白利用15%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離電泳（85 V、30 min，120 V、90 min），250 mA條件下將分離后蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2.5 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌3 次，然后分別加入Nrf2、Keap1、Mfn2、Drp1以及GAPDH抗體（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3 次，加入二抗室溫孵育1 h。最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑顯影，自動(dòng)曝光機(jī)檢測(cè)蛋白條帶灰度，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 線粒體ATP合成酶活力測(cè)定

稱取100～200 mg新鮮腓腸肌及股四頭肌組織，PBS洗滌，洗凈血水，用定性濾紙吸干；然后將肌肉組織置于冰上的培養(yǎng)皿中，剪碎，加入預(yù)冷裂解液1.5 mL，冰上用手工研杵反復(fù)研磨約30 次，在顯微鏡下觀察，組織中應(yīng)至少50%以上細(xì)胞保持完整。然后將組織勻漿物轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，收集上清液。在另一預(yù)冷離心管中加入0.5 mL預(yù)冷的A液（1 mol/L KCl、0.5 mol/L Tris，pH 7.4），將上清液小心轉(zhuǎn)移到離心管中，覆于A液上層，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清為胞漿，沉淀即為所需提取線粒體。向沉淀中加入0.2 mL漂洗液重懸線粒體，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀中加入100 μL 0.1mol/L KCl溶液重懸，按照試劑盒說明書操作，測(cè)定大鼠骨骼肌線粒體中ATP合成酶活力。

1.3.6 ATP水解酶活力測(cè)定

取新鮮腓腸肌和股四頭肌肌肉組織適量，加入100 μL細(xì)胞裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟溶液（0.01 mol/L），采用組織勻漿機(jī)在60 Hz下勻漿（勻漿4 次，每次2 min、間隔20 s），然后用超聲裂解儀裂解釋放總蛋白。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書操作，測(cè)定大鼠骨骼肌中ATP水解酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 6.0軟件，使用單因素方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05被認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高F值玉米肽對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

如圖1所示，口服低、中、高劑量高F值玉米肽并同時(shí)進(jìn)行8 周游泳訓(xùn)練后，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間由對(duì)照組的（41.56±3.97）min分別延長(zhǎng)至（107.25±5.26）、（148.20±5.34）min以及（185.80±8.53）min。提示隨著高F值玉米肽劑量的提高，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間呈線性遞增。

圖1 高F值玉米肽對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig. 1 Effect of high F-value corn peptide on exhaustive exercise time in rats

2.2 高F值玉米肽對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平的影響

血乳酸水平是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)疲勞的一項(xiàng)重要指標(biāo)。如圖2所示，對(duì)照組在力竭運(yùn)動(dòng)后5 min，其血乳酸水平急劇上升（由運(yùn)動(dòng)前的（2.38±0.26）mol/L上升至（17.88±0.89）mol/L），且在力竭運(yùn)動(dòng)后15 min其血乳酸濃度依然維持在（14.90±0.85）mol/L，恢復(fù)較慢。在力竭運(yùn)動(dòng)前，灌胃3 種劑量高F值玉米肽的實(shí)驗(yàn)大鼠血乳酸水平?jīng)]有明顯差異，低、中、高劑量組分別為（2.84±0.46）、（2.87±0.53）mol/L和（2.90±0.34）mol/L；而在力竭運(yùn)動(dòng)后5 min，低、中、高劑量組大鼠的血乳酸濃度分別為（8.94±0.54）、（7.86±0.57）mol/L和（6.98±0.91）mol/L，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；在力竭運(yùn)動(dòng)后15 min，灌胃高F值玉米肽實(shí)驗(yàn)大鼠的血乳酸水平進(jìn)一步下降，分別為低劑量組（7.52±0.47）mol/L、中劑量組（6.47±0.44）mol/L、高劑量組（5.50±0.62）mol/L。高F值玉米肽高劑量組在力竭運(yùn)動(dòng)后5、15 min的血乳酸水平均顯著低于低劑量組（P＜0.05）。

圖2 高F值玉米肽對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平的影響Fig. 2 Effect of high F-value corn peptide on blood lactate levels in rats after exhaustive exercise

2.3 高F值玉米肽對(duì)大鼠骨骼肌線粒體ATP酶活力的影響

如圖3所示，在服用低、中、高劑量高F值玉米肽并進(jìn)行長(zhǎng)期游泳訓(xùn)練后，運(yùn)動(dòng)疲勞模型大鼠股四頭肌線粒體ATP合成酶活力由對(duì)照組的（1.47±0.18）U/mg分別上升至（1.75±0.25）、（1.96±0.21）、（2.13±0.15）U/mg；腓腸肌線粒體ATP合成酶活力分別由對(duì)照組的（1.65±0.23）U/mg上升到（2.09±0.17）、（2.17±0.18）、（2.53±0.14）U/mg，ATP合成酶活力的提高與高F值玉米肽劑量呈線性依賴關(guān)系，其中高劑量高F值玉米肽組線粒體ATP合成酶活力與對(duì)照相比顯著提高（P＜0.05）。由此可知，高F值玉米肽可以通過提高ATP合成酶活力間接增加骨骼肌中的能量供應(yīng)，從而降低運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生幾率。

圖3 高F值玉米肽對(duì)大鼠股四頭?。ˋ）和腓腸肌（B）線粒體中ATP合成酶活力的影響Fig. 3 Effect of high F-value corn peptide on ATP synthase activity in mitochondria of rat Quadriceps (A) and Gastrocnemius (B) muscle

ATP水解酶是一種存在于組織細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上的蛋白酶，其在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞中發(fā)揮重要作用。本研究考察不同劑量高F值玉米肽對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腓腸肌及股四頭肌線粒體中ATP水解酶活力的影響，如圖4所示，服用低、中、高劑量高F值玉米肽實(shí)驗(yàn)大鼠股四頭肌中ATP水解酶活力由對(duì)照組的（2.975±0.232）U/mg分別上升到（4.252±0.347）、（5.296±0.229）、（6.528±0.459）U/mg（P＜0.05），同時(shí)腓腸肌中ATP水解酶活力由對(duì)照組的（2.157±0.259）U/mg分別上升到（3.512±0.364）、（5.327±0.415）、（6.716±0.548）U/mg（P＜0.05）。經(jīng)8 周游泳訓(xùn)練后，服用高劑量高F值玉米肽的大鼠腓腸肌和股四頭肌線粒體中ATP水解酶活力均較低劑量組大鼠顯著上升（P＜0.05）。

圖4 高F值玉米肽對(duì)大鼠股四頭?。ˋ）和腓腸肌（B）線粒體中ATP水解酶活力的影響Fig. 4 Effect of high F-value corn peptide on ATP hydrolase activity in mitochondria of rat Quadriceps (A) and Gastrocnemius (B) muscle

2.4 高F值玉米肽對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞所致骨骼肌氧化損傷的影響

大鼠在8 周游泳訓(xùn)練結(jié)合服用高F值玉米肽后進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)，如圖5A所示，對(duì)照組大鼠外周血中SOD活力為（10.43±1.53）U/g，而服用低、中、高劑量高F值玉米肽的大鼠外周血中SOD活力分別提高至（12.74±0.85）、（13.58±1.31）、（15.07±1.36）U/g，與對(duì)照組相比，高劑量高F值玉米肽組大鼠外周血中SOD活力顯著提高（P＜0.05）。

如圖5B所示，8 周游泳訓(xùn)練結(jié)合服用低、中、高劑量高F值玉米肽的大鼠在一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌組織中MDA含量由對(duì)照組的（213.79±21.47）nmol/mg分別降低至（192.87±18.32）、（182.68±17.25）、（160.53±12.21）nmol/mg，且與對(duì)照組相比高劑量組MDA含量顯著下降（P＜0.05）。由此可見，相對(duì)于低、中劑量組，高劑量高F值玉米肽降低實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌中MDA產(chǎn)生的作用更顯著。

Nrf2是重要的抗氧化基因轉(zhuǎn)錄因子，服用高F值玉米肽能夠使核內(nèi)Nrf2和胞漿內(nèi)游離Keap1的表達(dá)水平提高（圖5C），表明高F值玉米肽可能促進(jìn)了Nrf2-Keap1二聚體的分解，加速Nrf2進(jìn)入并定位于核內(nèi)，最終促進(jìn)下游抗氧化基因的表達(dá)。

圖5 高F值玉米肽對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞所致骨骼肌氧化損傷的影響Fig. 5 Effect of high F-value corn peptide on oxidative damage of skeletal muscle induced by exercise fatigue in rats

2.5 高F值玉米肽對(duì)大鼠骨骼肌中線粒體融合的影響

線粒體是合成ATP的重要場(chǎng)所，因此進(jìn)一步考察長(zhǎng)期服用高F值玉米肽對(duì)大鼠骨骼肌線粒體質(zhì)量的影響。如圖6所示，長(zhǎng)期服用高F值玉米肽可以提高線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)，降低裂解蛋白Drp1的表達(dá)，表明長(zhǎng)期服用高F值玉米肽可能有利于促進(jìn)線粒體融合，使處于非最佳狀態(tài)的線粒體通過互相融合提高質(zhì)量，從而最終提高合成ATP的能力。

圖6 高F值玉米肽對(duì)大鼠骨骼肌中線粒體融合的影響Fig. 6 Effect of high F-value corn peptide on mitochondrial fusion in rat skeletal muscle

3 討 論

乳酸的積累是運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生、運(yùn)動(dòng)能力下降的重要原因，也是評(píng)估運(yùn)動(dòng)疲勞水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)[11]。從本研究結(jié)果可以看出，與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期給予不同劑量高F值玉米肽能夠顯著降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠體內(nèi)的血乳酸濃度，促進(jìn)血乳酸代謝。同樣地，昌友權(quán)[12]研究發(fā)現(xiàn)，玉米肽可以顯著延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間和爬桿時(shí)間，并證實(shí)服用玉米肽后小鼠血清尿素氮水平明顯降低、肝糖原和肌糖原含量顯著提高，提示玉米肽具有延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的作用[12]。本研究結(jié)果提示高F值玉米肽能夠通過降低機(jī)體血乳酸的產(chǎn)生對(duì)抗運(yùn)動(dòng)疲勞，提高運(yùn)動(dòng)能力。高F值玉米肽含有豐富的支鏈氨基酸，支鏈氨基酸可以直接改善骨骼肌線粒體功能，減輕疲勞[13]，其在體內(nèi)產(chǎn)生ATP的效率也高于其他氨基酸，并能減少運(yùn)動(dòng)過程中大腦5-羥色胺的積累，防止中樞神經(jīng)疲勞[14]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，支鏈氨基酸可明顯抑制大鼠急性運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體膜脂質(zhì)過氧化物增加和膜流動(dòng)性下降，保護(hù)線粒體膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和正常生物功能[15]。同時(shí)，補(bǔ)充支鏈氨基酸能降低線粒體內(nèi)Ca2＋、Mg＋、K＋的變化幅度，維持胞內(nèi)鈉濃度，改善骨骼肌線粒體功能，并調(diào)節(jié)血液中氨基酸平衡，降低蛋白質(zhì)的分解，提高機(jī)體抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力[16-17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用高F值玉米肽能夠有效增加運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生時(shí)骨骼肌組織中SOD活力，降低MDA含量，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。SOD是體內(nèi)唯一以氧自由基為底物，能夠清除機(jī)體自由基的重要抗過氧化酶，SOD活力是評(píng)價(jià)機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過程中受氧自由基損傷程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[18]。大量研究證實(shí)提高SOD活力增加氧自由基的清除在疲勞消除中發(fā)揮重要作用。李酉坤等[19]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用茶多酚、VE以及硒可以顯著提高急性運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠外周血中SOD活力，從而對(duì)抗疲勞產(chǎn)生。郝紅梅等[20]也發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯可以顯著提高運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠血清SOD活力，且呈劑量依賴性。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。氧自由基能與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而造成細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，膜上的酶、受體及離子通道受損，三羧酸循環(huán)的電子傳遞遭到破壞等，最終導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。已有研究證明，降低大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后MDA的產(chǎn)生是對(duì)抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的有效手段[21]。潘華山等[22]發(fā)現(xiàn)服用人參皂苷Rb1和Rg1能夠顯著降低運(yùn)動(dòng)疲勞模型小鼠MDA含量并發(fā)揮抗運(yùn)動(dòng)性疲勞效應(yīng)。井宏穎等[23]也發(fā)現(xiàn)地黃飲子可以降低疲勞模型小鼠的MDA含量，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)清除自由基和抑制氧化應(yīng)激的能力，具有緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

能量的直接供給來自ATP的水解，ATP水解酶能將ATP水解為二磷酸腺苷。ATP一旦被水解便立即由磷酸肌酸（phosphocreatine，PCr）和二磷酸腺苷重新合成，因此機(jī)體工作時(shí)產(chǎn)生的能量供應(yīng)實(shí)際就是ATP的分解與合成[24]。ATP水解酶活力降低被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)能力下降的重要原因，研究顯示力竭運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟組織中Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-Mg2＋-ATPase和總ATP酶活力均降低，這是因?yàn)锳TP酶活力下降會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性異常，從而出現(xiàn)中樞疲勞。高壓氧治療后，ATP酶活力均升高，并且有效延長(zhǎng)了小鼠的力竭運(yùn)動(dòng)游泳時(shí)間[25-27]。因此，提高ATP水解酶活力對(duì)緩解運(yùn)動(dòng)疲勞、提高運(yùn)動(dòng)能力具有積極作用。王蕾等[28]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣丸可顯著提高疲勞模型小鼠腦組織中Na＋-K＋-ATPase和Ca2＋-ATPase的活力，對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞造成的小鼠腦組織能量代謝紊亂具有保護(hù)作用。外源性PCr干預(yù)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠后，PCr提高了Ca2＋-ATPase活力，保證ATP的供應(yīng)，改善微循環(huán)，增加鈣泵活力，從而發(fā)揮抗疲勞和提高運(yùn)動(dòng)能力作用[29]。李爽等[30]發(fā)現(xiàn)黃芪總苷能夠有效提高運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠骨骼肌中ATP水解酶活力，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用高F值玉米肽可以有效增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠股四頭肌及腓腸肌線粒體中ATP水解酶活力，并且隨劑量增加，ATP水解酶活力逐步提高。

Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，受Keap1調(diào)控，通過與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相互作用促進(jìn)各抗氧化酶的表達(dá)。Nrf2高表達(dá)能夠促進(jìn)機(jī)體的抗氧化作用，降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[31]。Keap1是Nrf2的多區(qū)域抑制蛋白，是Nrf2的高度專一性受體。通常，Nrf2以非活性狀態(tài)存在于胞漿中，與抑制蛋白Keap1高度結(jié)合并處于動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體的氧化應(yīng)激平衡[32]。當(dāng)受到氧化應(yīng)激或親電子物質(zhì)作用時(shí)，Keap1與Nrf2耦聯(lián)作用減弱，Keap1被釋放到胞漿，而游離的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與核轉(zhuǎn)錄因子Maf結(jié)合后啟動(dòng)ARE，形成NRF2-Maf-ARE復(fù)合體，從而最終啟動(dòng)下游抗氧化基因的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力[33]。當(dāng)氧化應(yīng)激產(chǎn)物減少時(shí)，胞漿內(nèi)游離的Keap1又可以進(jìn)入細(xì)胞核，重新與Nrf2結(jié)合形成非活性狀態(tài)的Keap1-Nrf2二聚體形式。在本研究中，長(zhǎng)期服用高F值玉米肽，特別是高劑量高F值玉米肽，能夠明顯上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)量，同時(shí)胞漿內(nèi)游離Keap1水平也增加；同樣地，在服用高F值玉米肽后，運(yùn)動(dòng)疲勞模型大鼠骨骼肌中SOD活力明顯增強(qiáng)，MDA含量減少。綜上，認(rèn)為當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激信息刺激時(shí)，高F值玉米肽可以通過促進(jìn)Keap1-Nrf2二聚體的解離，促進(jìn)Nrf2入核結(jié)合ARE，從而在核內(nèi)激活下游抗氧化基因的表達(dá)，最終發(fā)揮抗氧化功能。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，也是細(xì)胞產(chǎn)生ATP的場(chǎng)所，因此線粒體的數(shù)目與質(zhì)量對(duì)于ATP的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用。Mfn1/2是參與線粒體融合的線粒體外膜蛋白[34]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體之間的聯(lián)系對(duì)于線粒體的融合很關(guān)鍵，而Mfn2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體交界處富集，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體結(jié)合形成線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜具有重要影響[35]。Drp1是哺乳動(dòng)物中線粒體分裂的必需蛋白，主要存在于胞漿，當(dāng)線粒體分裂時(shí)才移位到線粒體表面。Drp1移位到線粒體外膜，并且集聚于線粒體潛在的分裂位點(diǎn)，通過水解三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）并逐漸壓縮線粒體直至斷裂，完成線粒體分裂。Drp1還可以調(diào)節(jié)線粒體微管的分布過程，從而維持線粒體的形態(tài)。Drp1主要通過3 種形式發(fā)揮其功能：其一，與GTP結(jié)合并將其分解為二磷酸鳥苷和磷酸，參與線粒體剪切；其二，發(fā)揮水解酶的功能，可能水解線粒體外膜脂質(zhì)層；其三，與核酸特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)核基因的功能[36]。本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期服用高F值玉米肽可以上調(diào)骨骼肌組織中Mfn2表達(dá)，相反降低線粒體裂解蛋白Drp1的表達(dá)[37]。因此認(rèn)為，高F值玉米肽可以促進(jìn)線粒體的融合，抑制其分裂，從而有利于線粒體保持良好狀態(tài)。

綜上所述，高F值玉米肽能夠加速實(shí)驗(yàn)大鼠血乳酸的清除，延長(zhǎng)力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高運(yùn)動(dòng)能力。其機(jī)制可能在于：一方面，高F值玉米肽通過激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路，增強(qiáng)抗氧化基因表達(dá)，從而減少骨骼肌中MDA的產(chǎn)生，增強(qiáng)SOD活力，降低氧自由基積累對(duì)線粒體的破壞；另一方面，高F值玉米肽可以通過促進(jìn)線粒體融合并抑制其裂解，維持線粒體功能穩(wěn)定；此外還發(fā)現(xiàn)，高F值玉米肽可以增強(qiáng)ATP水解酶活力加速ATP分解，同時(shí)增強(qiáng)ATP合成酶活力促進(jìn)ATP產(chǎn)生。