牛曉輝，佟 童，李雨欣，張 弓，劉 佳，李祖明,*，高麗萍，劉 秀，夏 然，武志超

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.中加健康工程研究院（合肥）有限公司，安徽 合肥 230088；3.國(guó)貿(mào)食品科技（北京）有限公司，北京 102209；4.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

糖尿病是一種代謝疾病，分為1型糖尿病和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）。隨著其發(fā)病率的增加和患者數(shù)量的不斷上升，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的主要公共問(wèn)題之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2017年全球糖尿病患者數(shù)量約4.25億，到2045年患者數(shù)量將上升到7億[2-3]。我國(guó)糖尿病患者數(shù)量約有1億，其中青年患者約占11.6%，而在所有糖尿病患者中T2DM患者約占90%[4]。T2DM是一種以高血糖、高血脂為特征的代謝疾病，主要由胰島素抵抗或胰島素分泌不足引起[5]。T2DM的治療主要是通過(guò)控制飲食、適度運(yùn)動(dòng)、給予降血糖和降脂藥物，但大多數(shù)藥物會(huì)產(chǎn)生一些不良的副作用[6-7]，因此開發(fā)無(wú)副作用的輔助降血糖保健食品十分必要。

益生菌對(duì)維持胃腸道平衡和能量平衡非常重要，并已被證明能夠在預(yù)防和治療代謝綜合征，如肥胖、炎癥、血脂異常和高血糖方面發(fā)揮積極作用[7-8]。高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2DM模型鼠攝入副干酪乳桿菌NL41后，血糖和胰高血糖素水平顯著下降，胰島、肝臟和腎臟的損傷明顯改善，說(shuō)明副干酪乳桿菌NL41能夠預(yù)防由高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2DM[9]。發(fā)酵乳桿菌MCC2759、MCC2760通過(guò)改善葡萄糖和脂質(zhì)狀況，減少肝臟中的促炎癥細(xì)胞因子水平，并改善腸道屏障功能和肌肉組織，在T2DM模型中顯示出有益作用[10]。植物乳桿菌LRCC5314干預(yù)糖尿病模型小鼠后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Glut4和adiponectin的表達(dá)量升高，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6的表達(dá)量降低[11]。植物乳桿菌C88可有效改善T2DM大鼠血糖和血脂代謝紊亂，顯著降低血清中TNF-α、IL-6等炎癥相關(guān)因子水平[12]。但是不同來(lái)源益生菌的作用及其功效并不完全相同，Vemuri等[13]研究發(fā)現(xiàn)相比于植物來(lái)源的植物乳桿菌UALp-05和乳制品來(lái)源的嗜熱鏈球菌UASt-09，只有人源嗜酸乳桿菌DDS-1和動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalisssp.lactis）UABla-12能夠誘導(dǎo)由脂多糖處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞分泌IL-10。

低聚果糖也稱為果寡糖和雙歧因子，是人體不能吸收的腸道益生菌增殖物。具有降低血清膽固醇含量、降低血糖濃度、分解致癌物的作用[14]。菊粉水解后能夠產(chǎn)生低聚果糖[15]。據(jù)報(bào)道，菊粉可通過(guò)抑制炎癥和調(diào)節(jié)腸道微生物群來(lái)改善超重和肥胖成人的胰島素敏感性，從而延緩T2DM的發(fā)展[16-17]。

本研究選取4 株人源乳桿菌（2 株植物乳桿菌和2 株發(fā)酵乳桿菌）分別凍干后混合制成菌劑，考察其聯(lián)合菊粉對(duì)T2DM模型小鼠血糖、血脂、結(jié)腸中炎癥因子、肝臟中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）和絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）相對(duì)表達(dá)水平以及肝臟、腎臟、胰島組織形態(tài)等的影響，探究人源乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)T2DM小鼠的改善效果和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、動(dòng)物、材料與試劑

植物乳桿菌ZLT22（CGMCC No. 18208）、植物乳桿菌ZLT25（CGMCC No. 18209）、發(fā)酵乳桿菌ZLT11（CGMCC No. 18206）、發(fā)酵乳桿菌ZLT305（CGMCC No. 18207）為本課題組前期從健康成人糞便中分離得到，現(xiàn)均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

SPF級(jí)以C57BLKS/JNju為背景培育的6 周齡T2DM模型db/db小鼠和同窩wt/wt小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2020-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0038。

動(dòng)物飼料 江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；菊粉柳州宏旭生物科技有限公司；MRS（De Man, Rogosa,Sharpe）肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；檸檬酸（pH 6.0）抗原修復(fù)液、RNA提取液、乙二胺四乙酸脫鈣液、4%多聚甲醛、Servicebio?RT First Strand cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）、引物、抗體、磷酸化蛋白酶抑制劑、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、β-actin、HyPure TMMolecular Biology Grade Water、化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）檢測(cè)試劑盒武漢塞維爾生物科技有限公司；HY60046糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）試劑盒、HY-10069胰島素放免試劑盒、葡萄糖試劑盒 北京華英生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5840R型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；AccU-Chekhov Active血糖儀 德國(guó)羅氏診斷公司；Selectra-E-Plus型全自動(dòng)生化儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；酶標(biāo)儀 瑞士Rayto公司；超微量分光光度計(jì) 德國(guó)Thermo公司；脫水機(jī) 意大利DIAPATH公司；包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)上海徠卡儀器有限公司；LightCycler480型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀瑞士Rotkreuz公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及干預(yù)

12 只wt/wt小鼠和36 只db/db小鼠在北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測(cè)中心SPF動(dòng)物室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～22 ℃、相對(duì)濕度40%～60%，明暗交替12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后分組，每組12 只。12 只wt/wt小鼠作為正常對(duì)照組（NC組），db/db小鼠隨機(jī)分為模型組（MC組），人源乳桿菌灌胃組（L組）和人源乳桿菌灌胃聯(lián)合菊粉飼養(yǎng)組（LI組），每組12 只。NC組、MC組和L組飼喂基礎(chǔ)飼料（酪蛋白（80 目、20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同））、玉米淀粉（39.75%）、麥芽糊精（葡萄糖當(dāng)量值為10%）（13.20%）、蔗糖（10.00%）、纖維素（5.00%）、大豆油（7.00%）、復(fù)合礦物質(zhì)（3.50%）、復(fù)合維生素（1.00%）），LI組飼喂含5%菊粉的基礎(chǔ)飼料（委托江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司加工）。取等質(zhì)量植物乳桿菌ZLT22、植物乳桿菌ZLT25、發(fā)酵乳桿菌ZLT11、發(fā)酵乳桿菌ZLT305凍干菌粉溶于去離子水，調(diào)整各菌液的活菌數(shù)約為1.0×109CFU/mL，得到人源乳桿菌菌劑。L組和LI組小鼠灌胃10 mL/（kgmb·d）人源乳桿菌菌劑。NC組、MC組灌胃10 mL/（kgmb·d）無(wú)菌生理鹽水，連續(xù)灌胃12 周，小鼠自由取食和飲水。干預(yù)12 周后斷食不斷水12 h，眼眶取血后頸椎脫臼處死小鼠，解剖收集臟器。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量、攝食量與空腹血糖濃度測(cè)定

干預(yù)期間每周記錄小鼠體質(zhì)量，每周稱量小鼠飼料質(zhì)量以計(jì)算每只小鼠每周的攝食量。每周在小鼠禁食6 h后尾尖采血，采用快速血糖儀測(cè)定小鼠空腹血糖濃度。

1.3.3 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

在干預(yù)第10周末，小鼠禁食12 h后按照1 g/kgmb灌胃40%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）葡萄糖溶液。在灌胃后0、30、60、90、120 min依次進(jìn)行尾尖采血，并用羅氏快速血糖儀測(cè)定血糖濃度。繪制時(shí)間-血糖濃度曲線，并按照式（1）計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）以表示葡萄糖耐量。

式中：G0/30/60/90/120分別表示灌胃后0、30、60、90、120 min時(shí)小鼠血糖濃度/（mmol/L）；0.5表示測(cè)定時(shí)間間隔0.5 h。

1.3.4 胰島素耐受實(shí)驗(yàn)

胰島素耐受實(shí)驗(yàn)在小鼠干預(yù)第11周末進(jìn)行。小鼠禁食6 h后，腹腔注射0.75 U/kgmb胰島素。在注射后0、30、60、90、120 min依次進(jìn)行尾尖采血，并用羅氏快速血糖儀測(cè)定血糖濃度。繪制時(shí)間-血糖濃度曲線，計(jì)算AUC以表征胰島素抵抗程度。

1.3.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠干預(yù)12 周后，取小鼠血液離心（4 ℃、4 000 r/min、10 min）后收集上清液。采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和總膽固醇（total cholesterol，TC）濃度。分別參考糖化血GSP試劑盒、葡萄糖試劑盒、胰島素放免試劑盒測(cè)定說(shuō)明書測(cè)定血清中GSP、血糖和胰島素濃度，并按式（2）計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）。

1.3.6 組織病理學(xué)觀察

將小鼠的肝臟、腎臟和胰腺固定在4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中24 h，然后進(jìn)行脫水、包埋、切片，最后用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)400 倍。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)腸組織炎癥因子水平

在勻漿管中加入1 mL RNA提取液，冰上預(yù)冷。然后加入100 mg結(jié)腸組織研磨至無(wú)可見塊狀組織。離心（4 ℃、12 000 r/min、10 min）取上清液，獲得總RNA。采用Servicebio?RT First Strand cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42 ℃保溫60 min，然后70 ℃保溫5 min。采用2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性（95 ℃、10 min）、變性（95 ℃、15 s）、退火/延伸（60 ℃、60 s），40 個(gè)循環(huán)，溶解曲線60～95 ℃，每15 s溫度提升0.3 ℃。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)熒光定量引物序列如表1所示。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特定基因引物Table 1 Specific primers used for real-time quantitative PCR

1.3.8 Western blot分析肝臟中PI3K和AKT相對(duì)表達(dá)水平

取肝臟組織用PBS沖洗，然后加入RAPI裂解液提取蛋白質(zhì)。參照BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。采用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的脫脂牛奶在脫色搖床上室溫封閉1 h。在4 ℃下將PVDF膜與一抗（稀釋度1∶1 000）孵育12 h，隨后將PVDF膜與二抗（稀釋度1∶3 000）室溫孵育30 min。采用ECL檢測(cè)試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參，采用Image J軟件測(cè)定目標(biāo)蛋白條帶灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著性。采用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

干預(yù)期間小鼠體質(zhì)量變化如圖1A所示，糖尿病小鼠體質(zhì)量明顯高于正常小鼠。在干預(yù)開始時(shí)MC組和LI組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，MC組小鼠體質(zhì)量不斷增加，而LI組小鼠體質(zhì)量變化不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，L組和LI組小鼠體質(zhì)量均低于MC組但無(wú)明顯差異。結(jié)果表明乳桿菌聯(lián)合菊粉可以抑制T2DM小鼠體質(zhì)量增加，但效果不明顯。

如圖1B所示，干預(yù)期間MC組小鼠攝食量相比于NC組顯著增加（P＜0.05）。干預(yù)3 周后，與MC組相比，L組小鼠攝食量顯著下降（P＜0.05）。干預(yù)期間LI組小鼠攝食量顯著低于MC組小鼠，說(shuō)明食用添加5%菊粉的飼料和乳桿菌干預(yù)均可顯著抑制糖尿病小鼠攝食量的增加（P＜0.05），其中乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)的抑制效果更明顯。

圖1 小鼠體質(zhì)量（A）和攝食量（B）變化Fig. 1 Changes in body mass (A) and food intake (B) in mice

2.2 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠空腹血糖濃度的影響

各組小鼠干預(yù)期間空腹血糖濃度變化如圖2A所示，MC組小鼠空腹血糖濃度顯著高于正常小鼠（P＜0.05）。MC組小鼠的空腹血糖濃度在干預(yù)前期呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，干預(yù)5 周后一直保持較高水平。與MC組相比，L組和LI組小鼠的空腹血糖濃度也在干預(yù)前期呈總體增長(zhǎng)趨勢(shì)，但并未達(dá)到MC組的水平。且經(jīng)過(guò)12 周干預(yù)后，L組和LI組小鼠空腹血糖濃度顯著低于MC組（P＜0.05）。各組小鼠GSP濃度變化如圖2B所示，MC組小鼠GSP濃度極顯著高于NC組（P＜0.01）；干預(yù)12 周后，L組和LI組小鼠GSP濃度顯著低于MC組（P＜0.05）。

圖2 小鼠空腹血糖濃度（A）和GSP濃度（B）的變化Fig. 2 Changes in fasting blood glucose (A) and GSP (B) levels in mice

2.3 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠葡萄糖耐量的影響

如圖3A所示，在灌胃葡萄糖后30 min，各組小鼠血糖濃度均達(dá)到最大值，然后逐漸下降。在120 min時(shí)，NC組小鼠血糖濃度與0 min時(shí)無(wú)明顯差異；L組和LI組小鼠在120 min時(shí)的血糖濃度高于0 min，但低于MC組。如圖3B所示，MC組AUC分別顯著和極顯著大于L組和LI組（P＜0.05、P＜0.01）。AUC越大表示糖耐受能力越弱。可見，MC組小鼠糖耐受能力極顯著弱于NC組（P＜0.01），LI組小鼠糖耐受能力極顯著強(qiáng)于MC組（P＜0.01）；且LI組糖耐受能力強(qiáng)于L組，但無(wú)明顯差異。

圖3 小鼠葡萄糖耐量變化Fig. 3 Changes in glucose tolerance in mice

2.4 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠胰島素抵抗的影響

如圖4A所示，NC組小鼠在注射胰島素30 min后血糖濃度達(dá)到最小值，在120 min時(shí)略低于初始血糖濃度。MC組小鼠在注射胰島素60 min后血糖濃度達(dá)到最小值，120 min時(shí)低于初始血糖濃度。L組和LI組小鼠血糖濃度在注射胰島素30 min后達(dá)到最小值，隨后逐漸上升，120 min時(shí)血糖濃度均低于MC組。如圖4B所示，MC組AUC極顯著大于L組和LI組（P＜0.01），且LI組AUC極顯著小于L組（P＜0.01）。AUC越大表示胰島素抵抗程度越強(qiáng)，因此MC組小鼠胰島素抵抗程度極顯著高于NC組，而LI組極顯著低于MC組和L組（P＜0.01）。各組小鼠干預(yù)后HOMA-IR的變化情況如圖4C所示，與NC組相比，MC組、L組和LI組小鼠HOMA-IR明顯升高；干預(yù)12 周后，與MC組相比，L組和LI組小鼠HOMA-IR顯著降低（P＜0.05、P＜0.01）。與L組相比，LI組小鼠HOMA-IR顯著降低（P＜0.05），與胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果相印證。

圖4 胰島素抵抗的變化Fig. 4 Changes in insulin resistance

2.5 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠血清中血脂指標(biāo)的影響

干預(yù)12 周后小鼠血清中血脂指標(biāo)如圖5所示。與NC組相比，MC組小鼠LDL-C、TG和TC濃度均明顯升高；與MC組相比，L組和LI組小鼠這3 項(xiàng)指標(biāo)顯著或極顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。與NC組相比，MC組小鼠HDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01）；與MC組相比，LI組小鼠HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01）。與L組相比，LI組小鼠LDL-C、TG濃度顯著或極顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。

圖5 血清中血脂指標(biāo)的變化Fig. 5 Changes in serum lipid indexes

2.6 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠肝臟、腎臟和胰腺組織的影響

干預(yù)12 周后小鼠臟器HE染色結(jié)果如圖6所示，NC組小鼠肝臟、腎臟和胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰且完整。MC組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)無(wú)規(guī)則、排列紊亂、產(chǎn)生許多空泡（如箭頭處所示，其他臟器同）；腎小球萎縮、腎小管排列松散、空泡數(shù)量增多；胰腺組織松散、組織細(xì)胞腫大、胰島細(xì)胞萎縮不規(guī)則，由圓形變?yōu)楸馄綘?，?shù)量減少。與MC組相比，L組和LI組小鼠肝臟中不規(guī)則細(xì)胞和空泡數(shù)量減少；腎小球較飽滿、空泡數(shù)量減少、腎小管排列緊密；雖然胰島中還有一些不正常細(xì)胞，但是正常細(xì)胞數(shù)量有所增加。與L組相比，LI組小鼠肝臟中的空泡數(shù)量減少；腎小管排列更為緊密。

圖6 小鼠肝臟（A）、腎臟（B）和胰腺（C）組織形態(tài)的變化Fig. 6 Histopathological changes in the liver (A), kidney (B) and pancreas (C) tissues of mice

2.7 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠結(jié)腸中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

如圖7所示，與NC組相比，MC組小鼠IL-6、IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著增加（P＜0.01），IL-10mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01）；與MC組相比，L組IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），IL-10相對(duì)表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.05）；與MC組相比，LI組小鼠IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），IL-10mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01）。與L組相比，LI組IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），IL-10mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著上升（P＜0.01）。

圖7 結(jié)腸中炎癥因子IL-6（A）、IL-1β（B）、IL-10（C）mRNA相對(duì)表達(dá)水平變化Fig. 7 Changes in mRNA relative expression levels of inflammatory factors IL-6 (A), IL-1β (B) and IL-10 (C) in colon

2.8 乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)小鼠PI3K和AKT相對(duì)表達(dá)水平的影響

肝臟中PI3K和AKT相對(duì)表達(dá)水平如圖8所示。與NC組相比，MC組小鼠PI3K和AKT相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01）；與MC組相比，L組AKT相對(duì)表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），LI組小鼠PI3K和AKT相對(duì)表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）。與L組相比，LI組中PI3K相對(duì)表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。

圖8 PI3K、AKT相對(duì)表達(dá)水平Fig. 8 Relative expression levels of PI3K and AKT proteins

3 討 論

T2DM的主要特征是胰島β細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)肥胖、高血糖、高脂血癥等癥狀[18-19]。目前T2DM患者主要采用注射胰島素的方法，但長(zhǎng)期注射胰島素可能會(huì)造成低血糖等并發(fā)癥[20]，因此開發(fā)無(wú)副作用的輔助降血糖保健食品具有重要意義。

糖尿病常見的癥狀有高血糖濃度，高血糖濃度可使患者出現(xiàn)昏迷、休克、意識(shí)喪失等病癥，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡[21-22]。可見控制血糖濃度在預(yù)防和治療T2DM中尤為重要。本研究中，MC組小鼠血糖濃度最高可達(dá)到（33.11±0.89）mmol/L，且血糖濃度在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中長(zhǎng)期高于30 mmol/L，明顯高于NC組小鼠血糖濃度（6.74～7.87 mmol/L）；而人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)12 周后，小鼠血糖濃度顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)具有降血糖作用。糖尿病的確診可以口服葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)[23-24]。胰島素抵抗是指胰島素靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性的降低，導(dǎo)致葡萄糖被組織吸收減少?gòu)亩鹧巧遊25]，因此預(yù)防和治療T2DM不但要降低血糖濃度，而且要改善胰島素抵抗。在本研究中，口服葡萄糖耐量試驗(yàn)、胰島素耐受試驗(yàn)和HOMA-IR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人源乳桿菌聯(lián)合菊粉可以有效改善T2DM小鼠的葡萄糖耐量和胰島素抵抗，極顯著降低HOMA-IR（P＜0.01）；同時(shí)，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉對(duì)T2DM小鼠的GSP濃度也有顯著改善效果（P＜0.05）。Lee等[26]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌HAC01顯著降低血糖和GSP水平，改善葡萄糖耐量和HOMA-IR，從而減緩糖尿病的發(fā)展，本研究結(jié)果與其相似。先前研究中鼠李糖乳桿菌GG不能降低HOMA-IR[27]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其不同。

T2DM患者大多會(huì)伴隨著血脂指標(biāo)失衡的病狀[28]。血脂異常一般表現(xiàn)為TC、TG、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平異常[29]。糖脂代謝之間關(guān)系密切，控制血糖和控制血脂同等重要。本研究中MC組小鼠的TC、TG、LDL-C濃度與NC組相比均極顯著增加（P＜0.01），經(jīng)過(guò)人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)后這些指標(biāo)均極顯著降低（P＜0.01）；MC組小鼠的HDL-C濃度與NC相比極顯著降低（P＜0.01），而與MC組相比，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)極顯著增加了小鼠血清HDL-C濃度（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠灌胃植物乳桿菌A7（KC 355240）發(fā)酵的益生菌豆奶和草本精油的混合物后，TC和LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高[30]，本研究結(jié)果與之相似。以上結(jié)果表明人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)對(duì)T2DM小鼠的血脂指標(biāo)具有明顯的改善效果。

糖代謝紊亂引起的高血糖可導(dǎo)致肝臟、腎臟和胰島結(jié)構(gòu)損傷[31-33]。肝臟在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用[34]。胰島可以分泌對(duì)調(diào)整血糖非常重要的胰高血糖素和胰島素。糖尿病常伴隨著腎臟的損傷[35]。本研究中HE染色結(jié)果表明模型組小鼠肝臟、腎臟細(xì)胞出現(xiàn)萎縮；胰島細(xì)胞數(shù)量大量減少，進(jìn)而導(dǎo)致各種激素分泌不足，對(duì)糖代謝失去調(diào)控作用。而人源乳桿菌聯(lián)合菊粉明顯抑制了肝臟、腎臟和胰腺組織中細(xì)胞的損傷。Zeng Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌NL41可以同時(shí)減輕肝臟、腎臟和胰腺細(xì)胞損傷，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。

炎癥在糖尿病等代謝疾病中起到至關(guān)重要的作用[36]。腸道持續(xù)慢性炎癥會(huì)引起胰島素抵抗，進(jìn)而誘發(fā)糖尿病[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，MC組小鼠促炎因子IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)水平極顯著增加（P＜0.01），而抑炎因子IL-10mRNA表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01）；與MC組相比，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)極顯著抑制IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)（P＜0.01），極顯著促進(jìn)IL-10mRNA表達(dá)（P＜0.01）。Liu等[38]研究表明植物乳桿菌可以顯著降低IL-6、IL-1β的mRNA水平從而緩解糖尿病，本研究結(jié)果與之相似。以上結(jié)果表明，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)通過(guò)抑制小鼠腸道炎癥反應(yīng)來(lái)緩解糖尿病癥狀。

PI3K/AKT是調(diào)節(jié)胰島素的重要通路，其參與包括糖代謝在內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)，是胰島素調(diào)節(jié)血糖的關(guān)鍵通路之一，該通路的紊亂是糖尿病發(fā)生的重要原因[39]。本研究采用Western blot分析小鼠肝臟中PI3K和AKT的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與MC組相比，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)能夠顯著上調(diào)PI3K和AKT相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05）。相似地，Parichart等[40]研究表明副干酪乳桿菌HII01通過(guò)改善PI3K/AKT信號(hào)通路，提高糖尿病模型鼠的骨骼肌葡萄糖攝取率，從而降低血液中葡萄糖含量。以上結(jié)果表明，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)通過(guò)改善PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)緩解T2DM癥狀。

綜上所述，人源乳桿菌聯(lián)合菊粉干預(yù)通過(guò)改善葡萄糖耐受、恢復(fù)胰島素敏感性、減輕組織損傷、改善血清炎癥因子和血脂水平、調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)等改善了T2DM模型鼠的高血糖濃度等癥狀。本研究可為人源乳桿菌聯(lián)合菊粉作為輔助降血糖保健食品提供理論依據(jù)。