王 琨，吳珊珊，黎 攀，肖 南，杜 冰

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

隨著人民生活質量的提高，飲食結構發(fā)生改變，蛋白質及高嘌呤類食物攝入增加，我國高尿酸血癥患者數(shù)量也逐年增加，2017年高尿酸血癥患病率高達13%，且有年輕化趨勢[1]。高尿酸血癥可引起痛風，同時也是高血壓、肥胖、心血管疾病、腎功能衰竭等疾病發(fā)生的誘導因素[2-4]。高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂或尿酸（uric acid，UA）排泄減少導致血液中UA水平增加[5]。人體內約有2/3 UA由腎臟代謝隨尿液排出，而另外1/3 UA則由腸道進行代謝隨糞便排出，也有少量隨汗液排出體外[1]。腸道微生物是腸道重要組成部分，腸道菌群的穩(wěn)定對腸道健康至關重要[6]。因此保證腎臟健康以及腸道菌群穩(wěn)定是緩解高尿酸血癥的有效途徑。目前治療高尿酸血癥常用的藥物有黃嘌呤氧化酶抑制劑、UA抑制劑和重組尿酸酶，然而這些藥物會產生一定的副作用，如別嘌呤醇會引起嚴重的過敏反應和皮疹[7]。因此，亟需尋求更加安全有效的替代療法來預防和治療高尿酸血癥。

食藥用菌是和人們日常生活緊密相關的重要生物資源，自古其就以特殊口感和藥用價值被納入食譜和藥方中[8]。茯苓通常指多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）的干燥菌核，又稱為松柏芋、云苓、伏苓等，是重要的“藥食同源”材料[9]。茯苓具有多種生物學功效，如護肝、抗炎、抗癌、抗氧化等[10]。茯苓中主要的化學成分為多糖類、三萜類化合物，同時還含有甾醇、脂肪酸、揮發(fā)油等物質[11]。植物中的多糖及三萜類物質均被報道具有抗高尿酸血癥活性[12-13]，且防治高尿酸血癥的中醫(yī)藥配方中常添加茯苓[14-15]，基于此，推測茯苓具有防治高尿酸血癥的功效。目前，對于茯苓的降UA功效以及對腸道菌群的影響報道較少。因此，本實驗探討茯苓粉抗高尿酸血癥功效，分析茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腎臟的保護作用及腸道菌群調節(jié)作用，旨在為“藥食同源”原材料、地方特色食品、降UA產品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD雄性大鼠（180～220 g）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002，使用許可證號：SYXK（粵）2018-0137。

茯苓購于安徽省六安市金寨縣，由華南農業(yè)大學肖南實驗師鑒定。

UA試劑盒 廣州市番禺區(qū)華鑫科技有限公司；黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；血清尿素（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）測定試劑盒 上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

7020型全自動生化分析儀 日本Hitachi公司；Excelsior ES全封閉自動脫水機、HistoStar組織包埋機、HM340E切片機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高尿酸血癥大鼠模型的建立

54 只SD雄性大鼠飼養(yǎng)在溫度為20～26 ℃、相對濕度為40%～70%的環(huán)境下，采用10 h/14 h晝夜循環(huán)照明。SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為空白對照組（n＝9）和模型組（n＝45）。空白對照組灌胃生理鹽水，模型組SD大鼠每天灌胃200 mg/kgmb腺嘌呤，各組灌胃體積均為5 mL/kgmb；同時每天灌胃2 h后注射質量濃度15 mg/mL氧嗪酸鉀溶液（100 mg/kgmb）。連續(xù)造模10 d后，眼眶靜脈采血，參照UA試劑盒說明書測定大鼠血清UA濃度，UA濃度高于110 μmol/L即為建模成功[16]，得到高尿酸血癥大鼠。

1.3.2 茯苓粉制備與動物實驗分組

茯苓蒸熟、磨粉后60 ℃干燥，備用。

空白對照（CON）組繼續(xù)灌胃生理鹽水，將上述建模成功的高尿酸血癥大鼠隨機分為5 組（n＝9）：高尿酸血癥模型（HUA）組、模型＋茯苓粉低劑量（HUA＋PCL）組、模型＋茯苓粉中劑量（HUA＋PCM）組、模型＋茯苓粉高劑量（HUA＋PCH）組、模型組＋別嘌呤醇組（HUA＋ALLO）。其中HUA組大鼠每天灌胃生理鹽水，HUA＋PCL、HUA＋PCM和HUA＋PCH組大鼠分別每天灌胃0.50、1.00、2.00 g/kgmb茯苓粉（分別配制質量濃度0.1、0.2、0.4 g/mL茯苓粉混合物），HUA＋ALLO組灌胃0.01 g/kgmb別嘌呤醇（配制質量濃度2 mg/mL別嘌呤醇溶液），灌胃體積均為5 mL/kgmb。實驗過程中每周記錄一次大鼠體質量，給藥4 周后，10%（質量分數(shù)）水合氯醛麻醉后，通過腹部動脈取血采集大鼠的血液標本進行生化指標測定。安樂處死大鼠，收集大鼠肝臟及腎臟，腎臟稱質量，按下式計算腎臟系數(shù)，將大鼠腸道內容物收集于無菌離心管，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 血清生化指標測定

分別按照試劑盒說明書測定大鼠血清中UA、BUN、Cr濃度以及XOD活力。

1.3.4 組織器官生化指標測定

取0.50 g的肝臟組織，按1∶9（m/V）加入冰凍生理鹽水，用全自動勻漿機制成勻漿液，離心（10 000 r/min、10 min）后取上清液，按XOD試劑盒說明書測定肝臟中XOD活力。

1.3.5 腎臟病理學觀察

將收集的大鼠腎臟立即用4%（體積分數(shù)）多聚甲醛溶液固定后制片，石蠟包埋后采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在顯微鏡下對腎小球萎縮、腎小囊擴張、纖維化等病理變化進行觀察。同時對腎小管、間質損傷進行評分。評分的內容包括：1）腎小管上皮細胞空泡化；2）腎小管萎縮、擴張；3）腎小管內蛋白管型、細胞管型；4）腎小管內結晶沉積；5）間質炎細胞浸潤（淋巴細胞浸潤、巨噬細胞聚集、異物肉芽腫反應等）；6）腎間質纖維化。評分標準為：無明顯病變，記0 分；病變范圍不超過1/4，記1 分；病變范圍不超過1/2，記2 分；病變范圍不超過3/4，記3 分；病變范圍超過3/4，記4 分。每只小鼠的腎損傷評分為6 項得分之和。

1.3.6 16S rRNA高通量測序及腸道菌群分析

收集大鼠腸道內容物，送至天津諾禾致源科技股份有限公司進行16S rRNA高通量測序及腸道菌群分析。采用糞便DNA試劑盒提取結腸內容物中的基因組DNA，將各個樣本DNA稀釋至相同濃度并進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增引物序列為515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[17]。采用Illumina MiSeq平臺進行測序，原始測序序列采用Cutadapt軟件對各個樣本進行質量控制。采用Uparse軟件對序列進行聚類分析（97%相似度）得到分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）。利用QIIME（V1.7.0）軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)結果均采用平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，采用t檢驗進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠體質量、血清UA濃度、XOD活力及肝臟XOD活力的影響

血清UA濃度升高是高尿酸血癥的主要特征[18]。如圖1所示，造模10 d后模型組SD大鼠血清中UA濃度均高于110 μmol/L，且與空白對照組相比表現(xiàn)出高度顯著差異（P＜0.001），表明造模成功，可進行后續(xù)實驗[16]。

圖1 建模后各組大鼠血清UA濃度Fig. 1 Serum UA concentration of SD rats in each group

如圖2A所示，干預4 周后各組大鼠的體質量并無顯著性差異（P＞0.05）。如圖2B所示，與HUA組相比，灌胃茯苓粉的大鼠血清UA濃度高度顯著下降（P＜0.001），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明茯苓粉可顯著降低高尿酸血癥大鼠中UA濃度，從而緩解大鼠的高尿酸血癥。此外，干預4 周后HUA組UA濃度低于110 μmol/L，主要是由于干預期間并未給予腺嘌呤和氧嗪酸鉀，從而造成HUA組中的UA濃度低于110 μmol/L，并非造模失敗，此類現(xiàn)象也在多項研究中均有報道[19-20]。XOD主要在肝臟中表達，增加XOD活力可促進血清UA的產生[21]。因此，本實驗進一步測定了血清及肝臟中XOD的活力。結果表明，茯苓粉可顯著降低高尿酸血癥大鼠血清及肝臟中XOD的活力（P＜0.05）。據(jù)此推測，茯苓粉可通過降低XOD的活力從而減少血清UA的產生，達到緩解高尿酸血癥的作用。

圖2 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠體質量（A）、血清UA濃度（B）、血清XOD活力（C）及肝臟XOD活力（D）的影響Fig. 2 Effect of P. cocos powder on body mass (A), serum UA concentration(B), serum XOD activity (C) and liver XOD activity (D) in hyperuricemic rats

2.2 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腎功能的影響

如圖3A所示，HUA組大鼠的腎臟系數(shù)相比于CON組高度顯著增加（P＜0.001），即HUA組大鼠的腎臟可能受到損傷，而灌胃茯苓粉后，大鼠的腎臟系數(shù)相比于HUA組顯著下降（P＜0.05）。BUN、Cr濃度是評價腎功能的重要指標[22]。由圖3B、C可知，HUA組的BUN和Cr濃度相比于CON組高度顯著升高（P＜0.001），即由腺嘌呤和氧嗪酸鉀誘導的高尿血癥大鼠腎功能受到損傷。然而，灌胃茯苓粉的高尿酸血癥大鼠BUN、Cr濃度相比于HUA組顯著降低（P＜0.05），推測茯苓粉可以改善由于高尿酸血癥引起的腎功能受損。

圖3 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腎臟系數(shù)（A）及血清BUN（B）、Cr濃度（C）的影響Fig. 3 Effect of P. cocos powder on renal index (A), serum BUN concentration (B) and serum creatinine concentration (C) in hyperuricemic rats

2.3 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腎臟組織形態(tài)的影響

如圖4A所示，CON組大鼠腎臟細胞排列整齊，腎小球及腎小管清晰可見，間質間無炎癥細胞浸潤，組織結構正常。HUA組大鼠腎小管擴張、腎小球萎縮、細胞空泡化，表現(xiàn)為腎臟組織病變。給予低劑量和中劑量茯苓粉的大鼠腎臟組織相比HUA組有明顯的改善，但仍出現(xiàn)細胞空泡化、炎癥細胞浸潤以及輕微的腎小球萎縮。而給予高劑量的茯苓粉后，大鼠腎臟組織病變明顯改善。腎臟組織評分結果如圖4B所示，低劑量樣品組的腎臟損傷評分降低，但與模型組相比無顯著性差異（P＞0.05），然而中劑量與高劑量組大鼠的腎臟損傷評分顯著低于模型組（P＜0.05）。此外，模型組小鼠的腎小球數(shù)目高度顯著低于空白組（P＜0.001），而茯苓粉能夠增加高尿酸血癥大鼠腎臟中腎小球數(shù)量。據(jù)此推測，茯苓粉能夠改善高尿酸血癥大鼠的腎臟組織損傷。

圖4 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腎臟的影響Fig. 4 Effect of P. cocos powder on renal morphology and function in hyperuricemic rats

2.4 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腸道菌群的影響

2.4.1 腸道菌群多樣性

稀釋曲線是對樣本中的序列進行隨機抽取，以抽取的序列數(shù)為橫坐標，以相對應的OTU數(shù)量為縱坐標構建的曲線圖。該曲線可用來評判測試的數(shù)據(jù)量是否合理。當曲線逐漸趨于平坦時，則表明測序的數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息[23]。如圖5A所示，每個樣本采樣的讀取數(shù)足夠大時，曲線逐漸趨于平坦，說明本次實驗取樣量合理，能夠反映出樣本中絕大多數(shù)微生物信息，可進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。由α-多樣性分析可知，各組之間的Shannon指數(shù)有輕微的差異，但無顯著性差異（P＞0.05，圖5B），即各組之間的物種豐富度和多樣性無顯著性差異。

β-多樣性分析可用于研究不同樣本中菌群結構的相似性及差異性，常用的分析方法有樣本層級聚類分析、主坐標分析以及多維尺度分析[24]。本實驗對所有樣本基于Bray_curtis距離算法進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。如圖5C所示，HUA組與CON組分開聚集，差異明顯，即高尿酸血癥大鼠的菌群結構與正常小鼠相比具有一定的差異，而灌胃茯苓粉的高尿酸血癥大鼠坐標向CON組偏移，表明茯苓粉能夠調節(jié)高尿酸血癥大鼠的腸道菌群組成。相似性分析（analysis of similarities，Anosim）和多響應置換過程分析（multi response permutation procedure，MRPP）是基于OTU相對豐度表分析組間微生物群落結構差異是否顯著。如表1所示，灌胃茯苓粉的高尿酸血癥大鼠與HUA組大鼠腸道菌群組成具有顯著性差異（P＜0.05），表明茯苓粉可以改變高尿酸血癥大鼠的腸道菌群結構。以上結果表明茯苓粉能夠調節(jié)高尿酸血癥大鼠的腸道菌群結構。

圖5 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腸道菌群多樣性的影響Fig. 5 Effect of P. cocos powder on gut microbiota diversity in hyperuricemic rats

表1 大鼠腸道菌群Anosim和MRPP結果Table 1 Analysis of similarities and multi response permutation procedure of gut microbiota in rats

2.4.2 腸道菌群組成

為了進一步探究茯苓粉對高尿酸血癥腸道菌群的影響，本實驗分析了茯苓粉對大鼠腸道菌群門水平優(yōu)勢菌群的影響。如圖6A所示，不同組別中大鼠的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），占菌落總數(shù)的90%以上。與CON組相比，HUA組大鼠中Firmicutes的相對豐度增加，Bacteroidetes的相對豐度減少，而灌胃茯苓粉的高尿酸血癥大鼠中Firmicutes與Bacteroidetes的相對豐度與CON組相近。Firmicutes與Bacteroidetes相對豐度比（F/B）被認為是判斷腸道菌群紊亂的重要指標[25]。如圖6B所示，HUA組的F/B值顯著高于CON組（P＜0.05），表明高尿酸血癥大鼠的腸道菌群紊亂，而灌胃茯苓粉可使高尿酸血癥大鼠的F/B值趨于正?；?。因此，茯苓粉可調節(jié)高尿酸血癥大鼠中門水平上的菌群變化。

在屬水平上，各組腸道微生物組成主要是擬桿菌屬（Bacteroides）、未知瘤胃球菌屬（unidentified_Ruminococcaceae）、羅姆布茨菌（Romboutsia）、未知毛螺旋菌屬（unidentified_Lachnospiraceae）、蘇黎世桿菌（Turicibacter）、普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）、乳桿菌屬（Lactobacillus），其中Bacteroides、unidentified_Ruminococcaceae為優(yōu)勢菌群（圖6C）。與CON組相比，HUA組Turicibacter、布勞特氏菌屬（Blautia）、棒桿菌科某屬（unidentified_Corynebacteriaceae）等菌群的相對豐度增加，Bacteroides、另枝桿菌屬（Alistipes）、副桿菌屬（Parabacteroides）、顫桿菌克屬（Oscillibacter）等菌群的相對豐度減少。與HUA組相比，茯苓粉灌胃后，Bacteroides、Alistipes、Parabacteroides、Oscillibacter和羅氏菌屬（Roseburia）的相對豐度增加，Romboutsia、Turicibacter、Blautia和unidentified_Corynebacteriaceae的相對豐度減少，表明灌胃茯苓粉可調節(jié)高尿酸血癥大鼠腸道菌群屬水平上的菌群變化。

圖6 茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腸道菌群門水平和屬水平的影響Fig. 6 Effect of P. cocos powder on gut microbiota composition at the phylum and genus levels in hyperuricemic rats

2.4.3 腸道菌群組成差異性分析結果

采用LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析篩選出組間具有顯著性差異的菌群（LDA值大于3），結果如圖7A所示，柱狀圖越長表示差異越顯著。門水平上具有顯著性差異的菌屬如圖7B、C所示，HUA組大鼠的Firmicute相對豐度極顯著高于CON組（P＜0.01），灌胃不同劑量的茯苓粉后，高尿酸血癥大鼠中Firmicute相對豐度均高度顯著降低（P＜0.001）。與Firmicute的趨勢相反，HUA組大鼠的Bacteroidetes相對豐度顯著低于CON組（P＜0.05），而灌胃茯苓粉后，高尿酸血癥大鼠中Firmicute相對豐度高度顯著升高（P＜0.001），其他研究中也有相似的報道[2]。屬水平上具有顯著性差異的菌屬如圖7D～G所示，HUA組大鼠中Bacteroides、Alistipes和Parabacteroides的相對豐度顯著下降（P＜0.05），相似結果也在其他研究中有報道[26-27]。而低、中、高劑量組的茯苓粉均可增加高尿酸血癥大鼠中的Bacteroides、Alistipes和Parabacteroides的相對豐度。

圖7 高尿酸血癥大鼠腸道菌群LEfSe分析結果Fig. 7 Linear discriminant analysis effect size of gut microbiota in hyperuricemic rats

3 討 論

高尿酸血癥是導致痛風及其他相關疾病的誘導因素，嚴重危害人們的生命健康。茯苓作為重要的“藥食同源”材料，富含多糖、三萜類等多種生物學活性物質[28]，但是對于茯苓降低UA濃度以及腸道菌群方面的研究甚少。因此，為了響應“健康中國”戰(zhàn)略，開發(fā)利用“藥食同源”材料，改善人體健康，本實驗探究了茯苓粉降UA效果，分析了茯苓粉對高尿酸血癥大鼠腎臟及腸道菌群的影響，為茯苓相關產品的開發(fā)利用以及為緩解高尿酸血癥提供新的途徑。

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂或UA排泄減少而造成機體內UA水平高于正常值的代謝疾病[5]。UA是嘌呤代謝的最終產物，主要以尿酸鹽陰離子的形式存在于體內循環(huán)中，且UA不能通過食物直接獲取，而是攝入含有嘌呤類食物最終通過嘌呤代謝途徑生成。XOD是嘌呤代謝過程中的關鍵酶，催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，黃嘌呤進而氧化為UA，因此抑制XOD的活力能夠有效降低血清中UA水平[29]。Qi Xiaofeng等[30]報道乳清蛋白水解物可通過抑制血清和肝臟中XOD的活力來阻止UA的生成。本實驗研究結果表明，茯苓粉可降低高尿血癥大鼠血清中的UA濃度，同時也能夠降低血清和肝臟中XOD的活力。因此，推測茯苓粉可通過抑制XOD的活力從而減少UA的生成，達到降UA的效果。

此外，高尿酸血癥發(fā)生的同時也會導致腎臟功能受損，然而機體內約有2/3的UA通過腎臟代謝隨尿液排出，因此保證腎臟的健康對促進UA排泄至關重要[6]。本實驗結果表明，茯苓粉能夠顯著改善腎臟功能，同時病理學觀察也發(fā)現(xiàn)茯苓粉能顯著改善高尿酸血癥大鼠的腎小球萎縮、腎小管擴張以及炎癥細胞浸潤。因此推測茯苓粉可以通過改善腎臟損傷來促進UA的排泄。

除了從腎臟代謝外，約有1/3的UA在腸道代謝并隨糞便排出。腸道菌群作為腸道的重要組成，參與消化、代謝等多種生理學活動。腸道菌群的穩(wěn)定對腸道健康至關重要，腸道健康可促使機體的UA正常排泄[6]。血液中UA濃度的增加會影響腸道環(huán)境，從而引起腸道菌群的變化，反過來腸道菌群的變化也會影響UA的代謝，進一步影響高尿酸血癥[6]。研究報道高尿酸血癥可導致腸道菌群的結構組成發(fā)生改變[31]，這與本實驗中β-多樣性分析結果一致。Firmicute和Bacteroidetes是腸道菌群中的優(yōu)勢菌群，F(xiàn)/B值是判斷腸道菌群紊亂的重要指標[25]。Li Xiaoqing等[2]報道高尿酸血癥大鼠中F/B值顯著性增加，而綠藻滸苔多糖干預后，大鼠腸道菌群的F/B值顯著降低。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌群為Firmicute和Bacteroidetes，高尿酸血癥大鼠中F/B值顯著升高，而給予茯苓組高尿酸血癥大鼠的F/B值顯著降低，且與空白組相比無顯著性差異，與Li Xiaoqing等[2]的報道結果一致，表明茯苓可調節(jié)高尿酸血癥大鼠的腸道菌群結構。Bacteroidetes可抑制有害菌在腸道菌群的定植以及增強機體對病毒的抵抗力，對保證腸道健康至關重要[32]，灌胃茯苓粉的高尿酸血癥大鼠中Bacteroidetes顯著性升高，即茯苓粉可上調腸道菌群中Bacteroidetes的相對豐度。Parabacteroides可將碳水化合物代謝成丁酸，為腸道菌群代謝提供能量，同時可通過分泌細菌素抵御病原體的入侵[33]。Alistipes具有較強的抗炎作用，能夠改善腸道炎癥，達到保護腸道健康的作用[34]。茯苓粉均可上調Alistipes及Parabacteroides的相對豐度，這與Gao Yan等[27]的結果一致。Lactobacillus是腸道中重要的有益菌，然而灌胃茯苓粉高尿酸血癥大鼠中Lactobacillus相對豐度并未明顯升高，這可能是由于Lactobacillus不是茯苓粉作用的靶細菌。

綜上所述，推測茯苓粉可以通過抑制肝臟和血清中XOD的活力來阻礙UA的產生，以及通過改善腎臟損傷和調節(jié)腸道菌群的結構來促進高尿酸血癥大鼠的UA排泄，從而降低高尿酸血癥大鼠血清中UA濃度，最終達到緩解高尿酸血癥的作用。