王潤東，鄧義佳，張宇昊，李學(xué)鵬，孟玉瓊，馬 睿，勵建榮,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；3.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016）

生食三文魚因具有營養(yǎng)物質(zhì)豐富、無需煮熟、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者的青睞。市場流通的三文魚原料大多為冷鏈進(jìn)口，其在生長水域、長途運(yùn)輸和存儲加工等環(huán)節(jié)極易受到副溶血弧菌的污染[1-3]。為了消減副溶血弧菌等致病菌的威脅，生食三文魚加工中會使用次氯酸鈉對食品原料和生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行消毒[4]，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉能夠誘導(dǎo)大腸桿菌[5]、沙門氏菌[6]、單核細(xì)胞增生李斯特菌[7]和副溶血弧菌[8]等應(yīng)激轉(zhuǎn)化為活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)，處于VBNC狀態(tài)的微生物仍保持一定的新陳代謝活性，且保留毒力基因，常規(guī)方法無法培養(yǎng)，易造成漏檢產(chǎn)品流入市場，一旦環(huán)境適宜生長，VBNC狀態(tài)菌株會迅速復(fù)蘇，成為生食三文魚的新安全隱患[9-11]。

目前針對VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的研究主要集中在檢測方法、誘導(dǎo)條件和復(fù)蘇過程[12-14]方面，對VBNC狀態(tài)菌株致病性的研究較少。Zhong Huamin等[15]采用疊氮溴化丙錠聯(lián)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法證明VBNC狀態(tài)副溶血弧菌仍具有表達(dá)耐熱相關(guān)溶血素（thermostable related hemolysin，trh）和腸毒素能力；Mougin等[16]也證實(shí)副溶血弧菌在VBNC狀態(tài)下能夠表達(dá)生物被膜相關(guān)基因，增加其黏附在食品及其器皿表面的機(jī)率；Wong等[17]研究指出，雖然VBNC狀態(tài)副溶血弧菌產(chǎn)生毒性蛋白和黏附素的能力減弱，但仍能造成腸上皮細(xì)胞模型的組織擦拭性損傷。然而，以上研究都是通過毒力因子和體外實(shí)驗(yàn)評估副溶血弧菌VBNC狀態(tài)的致病性，對于VBNC狀態(tài)菌株在體內(nèi)的真實(shí)危害尚不清楚。機(jī)體感染副溶血弧菌毒力株的典型癥狀是急性胃腸炎，病原菌進(jìn)入宿主腸道后依靠菌體和毒力因子發(fā)揮致病力，菌體黏附在腸壁上具有侵襲力，破壞腸組織結(jié)構(gòu)完整性，代謝產(chǎn)生的溶血毒素、脲酶和毒力蛋白具有細(xì)胞毒性，引發(fā)溶血和炎癥反應(yīng)，最終造成宿主腸道炎性損傷[18-19]。因此，VBNC狀態(tài)副溶血弧菌是否通過上述途徑感染機(jī)體尚待闡明。

本課題組前期從市售生食三文魚中復(fù)蘇分離得到一株副溶血弧菌VpRS1，該菌株耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，tdh）基因陰性，trh基因和不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin，tlh）基因陽性，與標(biāo)準(zhǔn)毒力株ATCC17802攜帶相同的溶血毒素基因家族，具有致病性，但VBNC-VpRS1致病力尚不清楚。因此，本研究以生食三文魚源VBNC-VpRS1菌株為研究對象，Vp17802為致病陽性對照株，分別構(gòu)建副溶血弧菌誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠感染模型，觀察小鼠臨床癥狀，檢測其回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)副溶血弧菌定植量、腸組織形態(tài)和病理變化、腸屏障功能、通透性及細(xì)胞因子等指標(biāo)，探究副溶血弧菌VBNC-VpRS1菌株對小鼠的致病力，識別VBNC狀態(tài)菌株侵襲的靶器官和特征性感染癥狀，旨在為精準(zhǔn)評估生食三文魚安全風(fēng)險和感染病原菌后治療提供理論參考。

1 材料與試劑

1.1 動物、材料與試劑

無特定病原菌級（SPF）7 周齡C57BL/6L小鼠30 只，體質(zhì)量（18±2）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-06073，動物房溫度（22±3）℃、相對濕度（40±5）%，12 h日光燈明暗交替循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

副溶血弧菌：標(biāo)準(zhǔn)毒力株ATCC17802（Vp17802，tdh-/trh＋/tlh＋）和生食三文魚分離株VpRS1（VpRS1，tdh-/trh＋/tlh＋）為渤海大學(xué)大宗水產(chǎn)品貯藏加工與安全控制團(tuán)隊(duì)保存。

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（thiosulfate citrate bile salts sucrous，TCBS）、腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；萘啶酮酸 美國西格瑪公司；pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、氯化鈉（NaCl）、次氯酸鈉（NaClO）、多聚甲醛 北京索萊寶科技有限公司；病理組織染色液、脂多糖測試盒、二胺氧化酶測試盒、D-乳酸試劑盒、免疫組化試劑盒、細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol RNA提取劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-25生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；5804R高速冷凍離心機(jī)、ABI stePone Plus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國艾本德公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；Imark酶標(biāo)儀、CFX96型熒光定量PCR儀 美國伯樂公司；生物組織自動包埋機(jī)、石蠟包埋機(jī)、KD-P組織攤片機(jī)、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī) 湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司；Eclipse E100光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌懸液制備

挑取-80 ℃下凍干管保存的Vp17802和VpRS1菌株分別接種于3% NaCl-BHI培養(yǎng)基，37 ℃活化兩次后，取對數(shù)生長期菌液3 000×g室溫離心20 min，得到菌體沉淀用等體積無菌0.1 mol/L PBS洗滌2 次并重懸，測定菌懸液OD600nm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已測定OD600nm與菌體濃度的相關(guān)性曲線，并用TCBS弧菌培養(yǎng)基平板計數(shù)驗(yàn)證實(shí)際菌量，將Vp17802和VpRS1濃度分別調(diào)整至106CFU/mL和108CFU/mL，其中Vp17802菌液16 ℃貯存?zhèn)溆?，VpRS1菌液用于誘導(dǎo)VBNC狀態(tài)VpRS1。

1.3.2 誘導(dǎo)副溶血弧菌VpRS1進(jìn)入VBNC狀態(tài)

根據(jù)文獻(xiàn)[7]報道并結(jié)合前期研究利用NaClO誘導(dǎo)副溶血弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，并稍加改進(jìn)。取10 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的副溶血弧菌（約108CFU/mL）菌懸液，3 000×g常溫離心20 min，棄上清液，用無菌PBS洗滌菌體2 次并重懸，隨后與5 mL NaClO溶液混合使有效氯終質(zhì)量濃度達(dá)35 μg/mL，避光室溫孵育15 min，每隔5 min晃動1 次，3 000×g常溫離心20 min，棄上清液，沉淀用等體積無菌PBS洗滌2 次并重懸。采用活菌直接計數(shù)法[20]，對重懸液中VpRS1總活菌計數(shù)，利用TCBS弧菌計數(shù)平板對可培養(yǎng)VpRS1計數(shù)，兩者差值為VBNC-VpRS1濃度，最后使用無菌PBS調(diào)整VBNC-VpRS1濃度至106CFU/mL，儲備菌液用于動物實(shí)驗(yàn)。同時采用丙酮酸鈉輔助熱激處理復(fù)蘇VBNC-VpRS1，檢驗(yàn)調(diào)整后菌量是否達(dá)到預(yù)期值，取5 mL儲備菌液與5 mL含20 mmol/L丙酮酸鈉的PBS混合，45 ℃下熱激處理15 s，隨后轉(zhuǎn)至37 ℃振蕩培養(yǎng)箱（120 r/min）恒溫孵育12 h后，通過TCBS弧菌計數(shù)平板觀察并統(tǒng)計可培養(yǎng)菌落數(shù)，即為儲備菌液中VBNC-VpRS1實(shí)際菌量。

1.3.3 動物實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)期結(jié)束后，將30 只雌雄各半小鼠隨機(jī)分為3 組：對照組、標(biāo)準(zhǔn)毒力株感染組（Vp17802組）和VBNC感染組（VBNC-VpRS1組）。實(shí)驗(yàn)前12 h，各組小鼠禁食不禁水，對照組小鼠灌胃0.1 mL無菌PBS，標(biāo)準(zhǔn)毒力株感染組和VBNC感染組小鼠依據(jù)副溶血弧菌食物中毒劑量105CFU，分別灌胃0.1 mL上述保存的Vp17802和VBNC-VpRS1菌懸液，感染周期72 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，采用二氧化碳麻醉小鼠，摘眼球取血，1 500×g、4 ℃離心10 min分離血清，采用頸椎脫臼法迅速處死小鼠，解剖收集回腸、盲腸和結(jié)腸組織及其內(nèi)容物，用于檢測腸道炎性損傷指標(biāo)和病原菌定植量。所有程序遵循中國小動物保護(hù)協(xié)會的要求（CSAPA-3685）。

1.3.4 一般行為學(xué)指標(biāo)檢測

感染期間，觀察并記錄各組小鼠的活動、飲食、精神狀況、糞便形態(tài)和體質(zhì)量變化等指標(biāo)，并在解剖后分析小鼠腹腔臟器差異。參考文獻(xiàn)[21]中疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評價標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合體質(zhì)量下降百分比、糞便形態(tài)和臟器出血3 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評分。

1.3.5 腸組織中副溶血弧菌定植量檢測

分別將1 g回腸、盲腸或結(jié)腸內(nèi)容物與9 mL無菌PBS混勻，采用10 倍稀釋法，取3 個連續(xù)適宜稀釋度（10-3、10-4、10-5）分別涂布于TCBS弧菌計數(shù)培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計菌落數(shù)。平板菌落計數(shù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué)觀察

各組小鼠解剖后，取距離肛門2 cm處結(jié)腸組織，將靠近盲腸端的腸組織用大頭針固定于測量紙，結(jié)腸部分輕輕拉直，測量其長度。隨后結(jié)腸組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中室溫浸泡固定24 h，經(jīng)酒精脫水和石蠟包埋后用轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度5 μm。常規(guī)脫蠟復(fù)水、經(jīng)蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性。參照文獻(xiàn)[22]采用盲法檢查結(jié)腸組織潰爛程度、水腫和炎性細(xì)胞浸潤范圍，進(jìn)行組織病理學(xué)評分。

1.3.7 結(jié)腸組織屏障功能檢測

利用結(jié)腸組織緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）和閉合蛋白（Occludin）表達(dá)量，血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）含量作為評價結(jié)腸屏障功能和通透性的指標(biāo)。

采用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)量，按照1.3.6節(jié)方法制備結(jié)腸石蠟切片。根據(jù)IHC試劑盒說明書操作，結(jié)腸石蠟切片經(jīng)雙氧水封閉、熱原修復(fù)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%胎牛血清封閉，滴加ZO-1和Occludin一抗（ZO-1稀釋比例1∶500；Occuldin稀釋比例1∶400），4 ℃過夜。次日PBS洗滌3 次，加入超敏兔鼠通用二抗，室溫孵育50 min，PBS液洗滌，滴加新鮮配制DAB顯色液，顯微鏡下觀察，ZO-1和Occludin蛋白陽性表達(dá)為棕黃色，陰性為藍(lán)色。

按照LPS、DAO和D-LA測試盒說明書操作，測定血清中各指標(biāo)含量。

1.3.8 結(jié)腸組織和血清中細(xì)胞因子含量分析

采用TRIzol RNA提取法制備小鼠結(jié)腸組織總RNA，經(jīng)RNA純度和質(zhì)量濃度檢測后，保留高品質(zhì)RNA樣本。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃、15 min；85 ℃、5 s。利用特異性引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，以小鼠β-actin為內(nèi)參基因，檢測先天免疫受體4（toll-like reporter 4，TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA相對表達(dá)量。引物由上海生物工程有限公司合成，序列見表1。各基因相對表達(dá)量按照2-ΔΔCt方法計算。

表1 實(shí)時熒光定量PCR檢測的基因引物序列Table 1 Sequences of primers used for RT-PCR

按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

Microsoft Excel軟件整理原始數(shù)據(jù)，使用One-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)差異分析。根據(jù)Bartlett’s檢驗(yàn)差異是否具有顯著性，進(jìn)而選擇Dunnett’s或Tukey’s進(jìn)行各組間的比較檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)P＜0.05時，表示組間存在顯著差異；采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，采用Image J 1.8.0軟件統(tǒng)計分析緊密連接蛋白陽性成像圖片的積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌對小鼠一般行為學(xué)的影響

DAI是評價食源性致病菌誘導(dǎo)腸道損傷的典型指標(biāo)之一[21]。C57BL/6J小鼠分別灌胃感染VBNC-VpRS1菌株和Vp17802菌株后的自發(fā)活動行為、腹腔臟器損傷情況和DAI評分如圖1所示。感染4 h，Vp17802組小鼠出現(xiàn)明顯的萎靡不振、震顫、被毛凌亂等臨床癥狀，VBNCVpRS1組小鼠則在感染10 h出現(xiàn)類似癥狀，VBNC-VpRS1組小鼠較Vp17802組延遲6 h出現(xiàn)感染癥狀，但程度更劇烈。感染終點(diǎn)72 h，Vp17802組鼠籠中有少量黃色稀便，小鼠身體虛弱，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)腸系組織有黃色積液；VBNC-VpRS1組鼠籠中有大量膿便和一定量的血便，小鼠扎堆聚集，解剖觀察腸組織有出血性積液，在此期間對照組小鼠未見任何異常。Vp17802組和VBNCVpRS1組DAI評分分別為6.78±0.43和8.99±0.35，均高度顯著高于對照組（P＜0.001），且VBNC-VpRS1組與Vp17802組組間存在顯著差異（P＜0.05）。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，VBNC狀態(tài)微生物的細(xì)胞受損，生理活性低，宿主的胃酸和缺氧環(huán)境會限制其生長，VBNC狀態(tài)菌株只能在體外復(fù)蘇，體內(nèi)無致病力[23]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然VBNC-VpRS1菌株在小鼠體內(nèi)需要更長時間復(fù)蘇并產(chǎn)生臨床感染癥狀，但其造成的腹腔臟器損傷遠(yuǎn)比標(biāo)準(zhǔn)毒力菌株嚴(yán)重。Cappelie等[24]指出初代VBNC狀態(tài)單核細(xì)胞增生李斯特菌無明顯致病力，經(jīng)卵黃培養(yǎng)后感染小鼠比標(biāo)準(zhǔn)菌致病性強(qiáng)，這與卵黃中卵磷脂營養(yǎng)素促進(jìn)VBNC狀態(tài)菌復(fù)蘇產(chǎn)生更多溶血毒素密切相關(guān)。因此，VBNCVpRS1菌株在小鼠體內(nèi)攝取足夠營養(yǎng)和復(fù)蘇后，可能代謝產(chǎn)生更多溶血毒素，進(jìn)而造成比Vp17802菌株更劇烈的感染損傷。

圖1 副溶血弧菌對C57BL/6J小鼠活動、腹腔感染和疾病活動指數(shù)評分的影響Fig. 1 Effect of Vibrio parahemolyticus on behavior, abdominal infection and DAI score of C57BL/6J mice

2.2 副溶血弧菌對小鼠回腸、盲腸和結(jié)腸定植量的影響

胃腸道是副溶血弧菌侵染的主要部位，腸道中病原菌載量決定損傷的嚴(yán)重程度[25]。兩株副溶血弧菌在C57BL/6J小鼠回腸、盲腸和結(jié)腸定植量如圖2所示，對照組小鼠腸道內(nèi)溶物未檢出副溶血弧菌，Vp17802組和VBNCVpRS1組小鼠回腸和盲腸中副溶血弧菌檢出量較低，結(jié)腸中菌量最高，分別為（3.31±0.10）（lg（CFU/g））和（4.98±0.14）（lg（CFU/g）），均極顯著高于對照組（P＜0.01）。VBNC-VpRS1菌株在小鼠結(jié)腸中定植量顯著高于Vp17802菌株（P＜0.05）。研究表明，VBNCVpRS1菌株和Vp17802菌株在小鼠回腸和盲腸的定植力弱，主要聚集在結(jié)腸內(nèi)，VBNC狀態(tài)菌株的結(jié)腸定植力強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)毒力菌株。Gu Dan等[26]研究表明結(jié)腸內(nèi)酸堿度近中性且含有少量氧氣，適宜副溶血弧菌定植并發(fā)揮致病力。全局應(yīng)答因子RNA聚合酶σ因子是細(xì)菌逆環(huán)境生存的關(guān)鍵蛋白，在微生物VBNC狀態(tài)形成和復(fù)蘇過程中發(fā)揮重要作用，VBNC狀態(tài)菌株普遍存在RpoS因子過表達(dá)情況，且RpoS表達(dá)量與菌體黏附作用呈正相關(guān)[27]。因此，VBNC-VpRS1菌株比Vp17802菌株具有更強(qiáng)的結(jié)腸定植力，可能與其細(xì)胞內(nèi)RpoS因子含量密切相關(guān)，未來需要對VBNC-VpRS1菌株的RpoS蛋白開展深入研究。

圖2 副溶血弧菌在C57BL/6J小鼠回腸、盲腸和結(jié)腸定植量Fig. 2 Vibrio parahemolyticus loads in the ileum, cecum and colon of C57BL/6J mice

2.3 副溶血弧菌對小鼠結(jié)腸組織的影響

食源性致病菌具有破壞腸組織結(jié)構(gòu)完整性，引發(fā)宿主全身感染的風(fēng)險[28]。小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結(jié)腸充血腫脹（圖3A），結(jié)腸長度較對照組極顯著或高度顯著縮短（P＜0.01、P＜0.001）（圖3B）。對結(jié)腸損傷情況定量分析，與對照組比較，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結(jié)腸病理損傷評分高度顯著升高（P＜0.001）（圖3C），其中VBNC-VpRS1組病理評分顯著高于Vp17802組（P＜0.05）。結(jié)腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，對照組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整、光滑，腺體清晰，未見糜爛和炎性細(xì)胞浸潤，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結(jié)腸黏膜上皮糜爛，腺體隱窩結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細(xì)胞減少或消失，伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤，VBNCVpRS1組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)缺損和中性粒細(xì)胞浸潤區(qū)域多于Vp17802組（圖3D）。結(jié)果表明，VBNC-VpRS1菌株與Vp17802菌株均可造成小鼠結(jié)腸組織形態(tài)損傷和病理評分增加，VBNC狀態(tài)菌株比標(biāo)準(zhǔn)毒力菌株具有更強(qiáng)的結(jié)腸組織破壞力和誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤。Yoon等[29]指出，小鼠腸道內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境會促進(jìn)VBNC狀態(tài)弧菌感染，特別是腸內(nèi)液體能夠滋養(yǎng)VBNC狀態(tài)弧菌，有利于其破壞腸系黏膜細(xì)胞。由此推測VBNC-VpRS1菌株借助腸積液增加對結(jié)腸黏膜層的侵襲，從而表現(xiàn)出比Vp17802菌株更強(qiáng)的結(jié)腸損傷效應(yīng)。這一推論在小鼠腹腔臟器觀察（圖1）中得到證實(shí)，VBNC-VpRS1組小鼠結(jié)腸內(nèi)出現(xiàn)大量血樣積液，而Vp17802組小鼠結(jié)腸內(nèi)積液量較少。

圖3 副溶血弧菌誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠結(jié)腸組織損傷Fig. 3 Morphological and histological changes in the colon of C57BL/6J mice induced by Vibrio parahemolyticus

2.4 副溶血弧菌對小鼠結(jié)腸屏障功能的影響

腸黏膜機(jī)械屏障是腸系屏障中最重要的部分，由黏膜上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸壁通透性、阻止食源性致病菌感染擴(kuò)張和內(nèi)毒素外溢的作用[30]。如圖4A所示，對照組中ZO-1和Occludin的陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)中（紅色箭頭所示區(qū)域），呈棕黃色，而在Vp17802組和VBNC-VpRS1組中很少有陽性產(chǎn)物，呈藍(lán)色。由圖4B可知，對照組ZO-1和Occludin的IOD最高，表明小鼠處于健康水平；與對照組比較，Vp17802組和VBNC-VpRS1組ZO-1和Occludin的IOD均極顯著或高度顯著減少（P＜0.01、P＜0.001），且Vp17802組兩種緊密連接蛋白IOD顯著低于VBNCVpRS1組（P＜0.05），說明兩株副溶血弧菌感染均抑制小鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)量，導(dǎo)致小鼠結(jié)腸組織緊密連接結(jié)構(gòu)異常。血清檢測結(jié)果顯示，兩組副溶血弧菌感染的小鼠血清LPS、DAO質(zhì)量濃度和D-LA濃度顯著高于對照組（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.01），Vp17802組的LPS、DAO質(zhì)量濃度和D-LA濃度分別為對照組的1.7、1.2、1.4 倍，VBNC-VpRS1組分別是對照組的1.8、1.1、1.3 倍，Vp17802組和VBNC-VpRS1組組間無顯著差異（P＞0.05）（圖4C）。綜上說明，VBNCVpRS1菌株和Vp17802菌株破壞小鼠腸屏障功能異常，造成了腸通透性增加誘發(fā)內(nèi)毒素移位，這也解釋了感染組小鼠胃部、脾臟和肝臟有出血性損傷（圖1）可能與副溶血弧菌菌體和LPS等有害物的擴(kuò)散有關(guān)。Li Yan等[31]研究指出腸屏障功能發(fā)生障礙時，病原菌及其代謝物等可以侵入深層組織和血液，誘導(dǎo)腎臟和脾臟等腹腔臟器多位點(diǎn)損傷。雖然，VBNC-VpRS1菌株對結(jié)腸屏障功能破壞力弱于Vp17802菌株，但也會造成結(jié)腸通透性異常，增加全身感染的風(fēng)險，其致病力不容忽視，提示食品安全監(jiān)管部門應(yīng)該把VBNC狀態(tài)副溶血弧菌納為常規(guī)檢測項(xiàng)目，尤其在即食食品安全監(jiān)控中。

圖4 副溶血弧菌誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠結(jié)腸屏障功能異常Fig. 4 Colonic barrier dysfunction in C57BL/6J mice induced by Vibrio parahemolyticus

2.5 副溶血弧菌對小鼠結(jié)腸和血清細(xì)胞因子水平的影響

細(xì)胞因子包括促炎和抗炎因子，二者相互制約，在機(jī)體炎癥反應(yīng)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。如圖5A所示，與對照組相比，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結(jié)腸組織TLR4和NF-κB的mRNA表達(dá)量高度顯著升高（P＜0.001），促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA相對表達(dá)量也高度顯著增加（P＜0.001）；IL-10是典型的Th2型細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的抗炎作用，Vp17802組和VBNC-VpRS1組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相較于對照組被高度顯著抑制（P＜0.001），分別為對照組的0.45 倍和0.66 倍（圖5B）。小鼠血清細(xì)胞因子結(jié)果表明，Vp17802組和VBNC-VpRS1組血清IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度分別為（410.12±28.74）、（243.65±10.33）、（318.59±17.31）pg/mL和（341.45±18.35）、（210.02±8.89）、（269.12±12.99）pg/mL，均極顯著高于對照組（IL-1β質(zhì)量濃度（210.14±19.40）pg/mL、IL-6質(zhì)量濃度（138.45±10.12）pg/mL、TNF-α質(zhì)量濃度（110.23±7.62）pg/mL）（P＜0.01）（圖5C）；Vp17802組和VBNC-VpRS1組血清IL-10質(zhì)量濃度分別為（68.73±5.91）pg/mL和（73.21±9.28）pg/mL，均顯著低于對照組（（102.07±11.41）pg/mL）（P＜0.05）（圖5C）。Vp17802組促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平均顯著高于VBNC-VpRS1組（P＜0.05），而抑炎因子（IL-10）水平無明顯差異（P＞0.05）。腸道炎癥反應(yīng)受TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，NF-κB作為TLR4信號通路下游重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，激活后調(diào)控機(jī)體炎癥水平、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[33]。活化的NF-κB可促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子表達(dá)，進(jìn)而反饋激活NF-κB表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)，炎性因子通常對病原菌無害，反而可以增加腸組織血液供應(yīng)進(jìn)而為致病菌提供額外的營養(yǎng)，有助于其競爭腸系生存空間[34]。因此，VBNC-VpRS1菌株和Vp17802菌株是通過激活結(jié)腸組織TLR4/NF-κB途徑介導(dǎo)炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時抑制抗炎因子IL-10活性，誘導(dǎo)結(jié)腸過度炎癥反應(yīng)，值得注意的是VBNC-VpRS1菌株致結(jié)腸炎癥能力弱于Vp17802菌株，且在血清細(xì)胞因子中具有相同規(guī)律。綜上，兩株副溶血弧菌均能誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，VBNC狀態(tài)菌株的致炎性弱于標(biāo)準(zhǔn)毒力菌株。此外，VBNC狀態(tài)弧菌胞內(nèi)全局應(yīng)答因子（RpoS）、重組組蛋白樣類核結(jié)構(gòu)蛋白和LuxR家族調(diào)控蛋白等參與致病菌的毒力形成[35]。在進(jìn)一步研究中，挖掘具有調(diào)控VBNC狀態(tài)副溶血弧菌致病力的關(guān)鍵因子是亟待解決的問題。

圖5 副溶血弧菌誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠結(jié)腸和血清炎癥反應(yīng)Fig. 5 Colonic and serum inflammatory responses in C57BL/6J mice induced by Vibrio parahemolyticus

3 結(jié) 論

生食三文魚源VBNC-VpRS1菌株通過定植在C57BL/6J小鼠結(jié)腸，破壞腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整性，抑制緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)，造成腸屏障功能障礙，LPS、DAO和D-LA等有害物趁機(jī)移位，激活TLR4/NF-κB途徑及其調(diào)控的促炎因子過度釋放，誘導(dǎo)小鼠腸道炎性損傷。雖然VBNC狀態(tài)菌株引起臨床感染癥狀較標(biāo)準(zhǔn)毒力株滯后，但其具有更強(qiáng)的結(jié)腸定植力和腸組織破壞性，且影響腸功能和促進(jìn)炎癥，威脅機(jī)體健康。食品中VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的致病力應(yīng)當(dāng)引起足夠重視。由于VBNC狀態(tài)菌株誘導(dǎo)的腸道損傷特征與標(biāo)準(zhǔn)毒力株不同，未來應(yīng)該深入探究二者的致病力差異。