張方方，肖 瀛，楊昌銘，吳其國，周一鳴，周小理

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海城建職業(yè)學院健康與社會關懷學院，上海 201415）

高脂膳食是指脂質攝入量占總攝入能量30%以上的飲食模式，已被認為是導致機體血脂紊亂和氧化應激發(fā)生的重要原因[1-2]，進而誘發(fā)肥胖、糖尿病等代謝疾病，嚴重影響正常生活和健康[3]。血脂紊亂和氧化應激狀態(tài)的產(chǎn)生會介導成骨細胞和破骨細胞功能受損，抑制骨形成并促進骨吸收，從而導致骨質疏松癥[4-5]。骨骼的幾何形狀和微結構以及骨重塑過程主要受基因表達控制，外界攝入的營養(yǎng)物質可通過調節(jié)基因表達來影響成骨細胞和破骨細胞相關代謝途徑的蛋白表達[6]。Cao Xiangchang等[7]研究表明，高脂膳食會增加大鼠模型的骨質流失和骨骼微結構改變程度，抑制成骨細胞分化和凋亡，同時增加破骨細胞的數(shù)量，并降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達水平。此外，高脂膳食已被證實可造成小鼠基因表達的變化，導致各種脂質代謝過程和胰島素信號傳導途徑的蛋白質編碼RNA異常表達[8]。

原花青素是由黃酮類化合物聚合而成的次生代謝產(chǎn)物[9]，常見于各種植物的花、堅果、果實、樹皮和種子中[10-11]，已被發(fā)現(xiàn)具有強抗氧化、抗菌、抗炎癥及抗糖尿病等多種促健康活性[12-14]。Tenkumo等[15]研究表明，富含原花青素的葡萄籽提取物具有防止骨代謝失衡和促進骨愈合、改善骨骼健康的作用。盡管原花青素作為一種天然功能因子其活性研究是食品營養(yǎng)與健康領域的熱點之一，然而其對高脂膳食導致骨骼組織基因表達的影響鮮見研究報道。

隨著基于高通量技術的發(fā)展，轉錄組測序技術（RNA sequencing，RNA-Seq）由于具備高分辨率、高靈敏度、成本低等優(yōu)勢，逐漸成為基因表達水平、關鍵基因的挖掘及調控機制研究的重要手段[16]。因此，本研究以高脂膳食誘導血脂代謝紊亂小鼠為模型，評價原花青素B2（proanthocyanidin B2，PB2）對高脂膳食性鈣代謝異常的干預作用，并通過RNA-Seq技術對小鼠股骨樣本進行真核有參轉錄組分析，篩選差異表達基因（differential expression genes，DEGs），同時進行相關通路的富集分析，為進一步分析PB2對高脂模型小鼠鈣代謝異常干預作用的分子機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡SPF級C57BL/6健康雄性小鼠27 只，體質量（17.3±1.0）g，購自上海靈暢生物科技有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003；動物處理及飼養(yǎng)條件遵照動物福利的相關規(guī)定及《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理辦法》實施。

實驗飼料為低脂飼料、高脂飼料（Paigen飼料），具體飼料營養(yǎng)能量見表1，購于南通特洛菲飼料科技有限公司。實驗所用墊料、飼料均經(jīng)過輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，符合SPF級動物使用標準。

表1 飼料營養(yǎng)素成分Table 1 Nutrient composition of experimental diets

PB2（純度≥90%） 上海同田生物技術有限公司；甲醛、無水乙醇、無水乙醚、氯仿、異丙醇等（分析純）國藥集團化學試劑上海有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、鈣、甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）含量測定試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；TRIzol裂解液美國Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TruseqTM RNA sample prep Kit、HiSeq X Reagent Kits、NovaSeq Reagent Kits試劑盒 美國Illumina公司；QuantiFluor?dsDNA System-核酸提取試劑盒 普洛麥格生物技術有限公司；Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒 美國Beckman公司；Oligo（dT）美國Thermo Fisher公司；末端修復混合液 美國Enzymatics公司。

1.2 儀器與設備

PURELAB Classic型超純水機 威立雅水處理技術（上海）有限公司；MDF-1156型低溫冰箱 日本三洋機電有限公司；XW-80型混合器 江蘇海門其林貝爾儀器有限公司；K280R型高速冷凍離心機 英國森特恩公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；磁力架 美國英杰生命技術有限公司；E6150型Quantus? Fluorometer生物庫 普洛麥格（北京）生物技術有限公司；NanoDrop2000型超微量紫外分光光度計 美國Thermo Fisher公司；qTOWER 2.2定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀德國耶拿分析儀器股份公司；2100型生物分析儀 美國Agilent公司；NovaSeq 6000高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

6 周齡小鼠同室分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房內，所有小鼠在實驗前需要經(jīng)過1 周的環(huán)境適應期，飼喂AIN93飼料，保持12 h明暗交替光照，溫度20～24 ℃、相對濕度50%～65%，小鼠可自由攝食和飲水（去離子水）。

小鼠隨機分3 組，每組9 只，對照組（CON組）飼喂低脂飼料、高脂膳食組（HF組）飼喂Paigen飼料、原花青素組（PB2組）飼喂添加0.2%（以飼料質量計）PB2的Paigen飼料。本研究采用高脂膳食誘導血脂代謝紊亂模型[17-18]，PB2干預劑量根據(jù)前期研究[19]確定。所有小鼠自由攝食和飲水，持續(xù)飼喂8 周，每天觀察小鼠狀態(tài)，每周記錄一次小鼠體質量及其食物攝入量。

1.3.2 血漿、股骨、尿液和糞便樣品采集

實驗結束前1 周，每組取9 只小鼠開展代謝平衡實驗，分別放入代謝籠中，適應3 d后，持續(xù)收集尿液和糞便3 d，記錄飼料消耗情況及糞便量和尿液量。

實驗第8周末，小鼠斷食不斷水12 h，使用無水乙醚麻醉并稱量體質量，通過摘取眼球取血。血液收集于含有1.5 mL質量分數(shù)0.1%肝素鈉的離心管中，冰浴10 min后于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，取上清液于1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存，待測。

眼球取血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出完整左股骨，轉入裝有5 mL RNAlater試劑離心管中，于-40 ℃保存待提取RNA，右股骨取出后于-20 ℃保存用于骨礦物含量測定。

1.3.3 骨礦物含量的測定

參考曹靜祥[20]的方法稍加修改，股骨經(jīng)清洗后烘干至質量恒定后稱質量，每份股骨樣品放入一支瓷舟內，并將瓷舟并排碼放在一片白色瓷磚上，疊放在馬弗爐中，以200 ℃為起始溫度，間隔100 ℃分段升溫至500 ℃灰化，并在爐溫降至100 ℃以下且灰分恒質量后稱質量。

1.3.4 血脂水平和鈣吸收能力相關指標的測定

血漿樣品于冰上解凍，股骨在室溫下解凍至室溫。按照試劑盒說明書相關操作進行血漿血脂指標（TC、TG、LDL-C、HDL-C）、鈣濃度、PTH質量濃度和股骨鈣含量測定。

采用代謝平衡法評價小鼠鈣吸收能力。對采集飼料和糞便使用HNO3和HClO4（4∶1，V/V）進行消化處理，用鈣含量檢測試劑盒測定樣品中的鈣含量，依據(jù)公式（1）～（3）分別計算動脈硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）、鈣凈吸收量和鈣貯留量。

式中：cTC為TC濃度/（mmol/L）；cHDL-C為HDL-C濃度/（mmol/L）。

1.3.5 mRNA測序

采用TRIzol法從股骨組織樣品（股骨頭近端）提取總RNA，同組每3 個樣品等量合并為一份樣本，具體流程如下。取定量股骨加入液氮，研磨后裝入預冷的加有1 mL TRIzol的離心管中，充分振蕩，裂解5 min；隨后于4 ℃、13 000×g條件下離心5 min，將上清液轉移入新離心管中，加入200 μL預冷的氯仿，充分振蕩，靜置5 min；同條件離心15 min后吸取上清液轉移入新離心管中，加入與上清液體積相同的預冷異丙醇，靜置10 min；同條件離心10 min后吸去上清液，加入1 mL預冷的體積分數(shù)75%乙醇溶液，吹吸混勻充分；同條件離心5 min后吸去上清液，再次離心數(shù)秒，吸除殘液，靜置3～5 min晾干；加入20～50 μL滅菌的質量分數(shù)0.1% DEPC溶液溶解。

利用NanoDrop2000檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整情況，使用2100型生物分析儀測定RNA完整值，并使用帶Oligo（dT）的磁珠與ployA進行配對，分離出mRNA。在mRNA樣品中加入碎片緩沖液，將其打斷為300 bp左右的片段，在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mRNA為模板反轉合成穩(wěn)定的雙鏈cDNA。隨后加入End Repair Mix將其補成平末端，在3’末端加上一個A堿基，用于連接Y字形的接頭。

純化產(chǎn)物并進行片段分選，對分選片段進行PCR擴增，純化并構建文庫。利用QuantiFluor?dsDNA System定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機，在cBot cluster generator上進行橋式PCR擴增，生成clusters，隨后進行Illumina NovaSeq6000上機測序。

1.3.6 定量逆轉錄聚合酶鏈式反應測定

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRTPCR）能夠驗證RNA測序結果。提取總RNA后將其轉錄成cDNA，采用Taq聚合酶和EvaGreen dye熒光染料，以稀釋后的cDNA為模板擴增靶基因，引物序列見表2。通過溶解度曲線評估PCR產(chǎn)物的特異性，所有qRT-PCR數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCt相對定量法[21]進行分析，并歸一化為β-actin基因的相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.4.1 生化指標數(shù)據(jù)分析

小鼠生理生化指標均以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件通過Duncan’s法進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4.2 原始測序數(shù)據(jù)質控

使用SeqPrep和Sickle軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾，并對質量修剪前后的序列進行數(shù)據(jù)量統(tǒng)計，得到高質量的測序數(shù)據(jù)以保證后續(xù)分析順利進行。

1.4.3 基因表達量分析

使用RSEM軟件對待分析數(shù)據(jù)計算基因表達情況，揭示基因功能和調控情況。表達定量的結果以每百萬讀長中來自于某基因每千堿基長度的轉錄產(chǎn)物數(shù)（transcripts per kilobase million，Tpm）為單位，對Tpm均一化使不同樣本中的總表達量一致。

1.4.4 基因表達差異分析

使用DESeq2軟件對CON、HF組和PB2組進行基因表達差異分析，鑒定出DEGs，并篩選差異共表達基因，用于后續(xù)研究。

篩選條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05、|log2FC|≥1（FC為變化倍數(shù)（fold change）。

1.4.5 差異基因GO富集分析

使用Goatools軟件和基因本體論（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/）進行Fisher精確檢驗，按照參與功能對基因進行分類，總共分為生物進程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。對差異基因進行GO功能顯著性富集分析，可以說明差異基因的功能富集情況，闡明樣本間DEG在功能水平的異同。為控制計算的假陽性率，使用Bonferroni多重檢驗方法對P值進行校正，當經(jīng)過校正的P≤0.05時，則說明此GO功能存在顯著富集情況。

1.4.6 差異基因通路富集分析

使用KOBAS軟件基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫使用Fisher精確檢驗進行通路富集分析。為控制計算假陽性率，采用BY（FDR）方法矯正P值，矯正P≤0.05時說明此通路為DEGs中顯著富集的KEGG通路。

2 結果與分析

2.1 體質量及血漿脂質水平的變化

如表3所示，各組小鼠在實驗期間體質量增加，與CON組相比，其他兩組小鼠體質量降低顯著，但PB2組小鼠體質量顯著高于HF組（P＜0.05）。HF組小鼠血漿TC、LDL-C濃度和AI顯著高于CON組（P＜0.05），PB2組小鼠的上述指標與HF組顯著降低（P＜0.05）。此外，PB2組小鼠的TG濃度顯著低于其他兩組小鼠（P＜0.05）。長期攝入高脂膳食可使體內游離脂肪酸釋放進入機體循環(huán)系統(tǒng)[22]，導致脂質代謝異常，血漿TC水平顯著升高，血漿脂蛋白組成向LDL-C轉變，從而增加動脈粥樣硬化風險[23]。已有研究表明，原花青素具有調節(jié)小鼠脂質代謝的能力[24]，本研究結果也表明PB2可以調節(jié)高脂膳食介導的脂代謝異常，降低發(fā)生動脈粥樣硬化的風險。

表3 PB2對小鼠體質量和血漿脂質水平的影響Table 3 Effect of procyanidin B2 on body mass and plasma lipid levels in mice

2.2 鈣吸收、鈣內穩(wěn)態(tài)與骨礦物含量的變化

鈣代謝平衡實驗結果如表4所示，與CON組相比，高脂膳食小鼠（HF組）鈣攝入量降低，糞鈣排泄量和尿鈣量增加（P＞0.05），鈣凈吸收量和鈣貯留量顯著降低（P＜0.05）。與HF組相比，PB2組鈣凈吸收和鈣貯留量顯著增加（P＜0.05），鈣凈吸收量與鈣貯留量有向CON組水平恢復的趨勢。

表4 PB2對小鼠鈣吸收的影響Table 4 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium absorption in mice

PTH是細胞外鈣和磷的重要調節(jié)因子，也是機體的血鈣濃度維持劑，能夠刺激骨細胞對骨的重吸收[25]。如圖1所示，血漿鈣濃度在3 組樣本間無顯著變化（P＞0.05），與CON組相比，HF組的PTH質量濃度高度顯著提高（P＜0.05），與HF組相比，PB2干預后可以顯著降低高脂膳食小鼠PTH質量濃度（P＜0.05），部分恢復到CON組水平。如表5所示，HF組骨礦物含量和股骨鈣含量與CON組相比顯著降低（P＜0.05），而PB2攝入可以使含量恢復至正常水平。因此，綜合鈣吸收、鈣內穩(wěn)態(tài)和骨礦物含量的結果可知，高脂膳食導致的鈣吸收降低可能造成小鼠鈣代謝負平衡，從而刺激PTH分泌，動員骨鈣入血，使骨骼中礦物質含量降低，從而維持血鈣濃度穩(wěn)定的水平范圍，而PB2組可以干預由高脂膳食導致的鈣代謝異常。

圖1 PB2對小鼠鈣穩(wěn)態(tài)的影響Fig. 1 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium homeostasis in mice

表5 PB2對小鼠骨礦物含量、股骨鈣含量的影響Table 5 Effect of proanthocyanidin B2 on bone mineral content and femoral calcium content in mice

2.3 RNA-seq測序數(shù)據(jù)評估

對3 組小鼠股骨提取的mRNA進行RNA-Seq，如表6所示，測序共獲得557 782 130 條序列，質量過濾質控后CON組測得181 626 736 條序列，HF組測得172 345 898 條序列，PB2組測得193 498 872 條序列。測序過濾后所得數(shù)據(jù)整體質量較高，測序錯誤率均在0.012%左右，Q20（Phred數(shù)值大于20的堿基占總堿基的百分比）在98.29%以上，Q30（Phred數(shù)值大于30的堿基占總堿基的百分比）超過94.86%，GC相對含量（堿基G和C數(shù)目總和占總堿基數(shù)目的百分比）均在52.5%以上，表明堿基G與C含量大致相等。

表6 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 6 Statistics of sequencing data

2.4 差異基因表達分析

為了研究不同組中基因表達情況，本研究采用RSEM 1.2.31軟件，以Tpm為衡量表達水平的標準進行差異量表達分析。樣本間基因主成分分析（principal components analysis，PCA）結果如圖2所示，CON、HF、PB2組在貢獻度最高的PC1和PC2上離散明顯，PC1和PC2貢獻率分別為96.78%和2.29%。高脂膳食攝入使得HF組顯著遠離CON組樣本，而PB2組能夠改善這一偏移情況，與HF組相比，PB2組距離CON組更為接近。

為了進一步研究不同組間存在差異的基因表達，本研究采用DESeq 2 1.10.1分析，選取|FC|≥2且P＜0.05的基因作為組間差異基因，分別對HF組/CON組和PB2組/HF組進行分析，結果如圖3所示。HF組/CON組總共鑒定出436 個差異基因，差異統(tǒng)計火山圖表明，高脂膳食攝入導致其中204 個基因表達顯著上調，232 個基因表達顯著下調；PB2組/HF組總共鑒定出176 個差異基因，PB2組攝入使得其中65 個基因表達顯著上調，111 個基因表達顯著下調（P＜0.05）。

此外，對3 組中共表達的差異基因進行篩選，共篩選出49 個基因，與CON組基因表達情況相比，高脂膳食攝入使得38 個基因表達顯著上調，11 個基因表達顯著下調，PB2組攝入可以使其中1 個基因表達保持繼續(xù)下調，顯著改善高脂膳食導致的其余48 個基因表達異常（P＜0.05）。

圖2 樣本間基因PCAFig. 2 Principal components analysis of genes between samples

圖3 基因表達量差異統(tǒng)計火山圖Fig. 3 Volcano plot for the expression of differential genes

2.5 差異共表達基因的富集分析

對于PB2組/HF組鑒別出的176 個差異基因進行了直接與鈣代謝相關的通路的篩選分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及破骨細胞分化、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）-受體相互作用、細胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）、細胞周期和鈣信號通路（表7），基因表達變化總體呈現(xiàn)PB2對破骨細胞活性相關基因表達下調并對膠原合成相關基因表達上調的趨勢。

表7 骨代謝相關通路基因表達的影響Table 7 Changes in gene expression associated with bone metabolismrelated pathways

為了從數(shù)量較多的潛在靶基因中篩選出有代表意義的基因進行驗證，本研究使用Goatools 0.6.5等軟件進一步對49 個差異共表達基因進行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析中前20的顯著性GO項結果表明，差異共表達基因歸屬于BP和CC兩個分支，其中包括機體免疫、機體應激反應、細胞吞噬作用、細胞識別、補體激活、信號轉導、大分子復合物的組成等（圖4A）。KEGG富集分析結果展示了主要調控通路，共有13 條通路顯著富集（P＜0.05），分別為腎素分泌、唾液分泌、心肌細胞腎上腺素能信號傳導、鳥苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等（圖4B）。

圖4 差異共表達基因富集分析Fig. 4 Enrichment analysis of differentially co-expressed genes

此外，本研究根據(jù)顯著性富集通路對差異共表達基因進行分析，篩選出5 個基因作為潛在調控基因（表8），分別為Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3基因，PB2組干預可以顯著下調高脂膳食小鼠Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因的表達量，分別下調9.19、3.68、3.61 倍，上調Aldh1a3和Calml3基因表達量，分別上調2.06、3.29 倍（P＜0.05）。

表8 顯著性富集通路篩選的差異共表達基因Table 8 Differentially co-expressed genes selected by the significant KEGG pathways enriched

2.6 qRT-PCR驗證結果

為了驗證差異基因Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3的表達水平變化結果，進行了qRT-PCR分析（圖5）。與RNA-Seq結果相比，盡管qRT-PCR測得基因表達水平結果略有不同，但其變化趨勢保持了一致性，表明轉錄組數(shù)據(jù)可靠。

圖5 qRT-PCR驗證差異共表達基因的變化Fig. 5 qRT-PCR verification of changes in the expression of differentially co-expressed genes

3 討 論

近年來，由高脂飲食引起的代謝疾病及其并發(fā)癥是世界主要的公共衛(wèi)生問題之一[26]。已有研究表明，高脂膳食的攝入會顯著提升小鼠的血漿甘油三酸酯和膽固醇水平，導致血脂紊亂[27]。本研究結果與先前研究結果[28-29]一致，與CON組相比，高脂膳食會導致小鼠TC、LDL-C濃度和AI水平顯著增加（P＜0.05）。此外，Bhandi等[25]研究表明，多酚的攝入可顯著降低高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度和AI水平，這與本研究中補充PB2有效降低了高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度、AI水平的結果相似。長期攝入高脂膳食導致的血脂紊亂已被證明對骨骼健康的具有不利影響[30]，動物實驗研究表明，小鼠飼喂高脂膳食會導致骨密度、骨形成水平降低，骨髓脂肪增加[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)PB2可以顯著增加高脂膳食小鼠的鈣凈吸收和鈣貯留量（P＜0.05），顯著降低PTH質量濃度（P＜0.05），增加骨礦物與骨鈣含量。腸道鈣吸收量的降低是骨鈣含量減少與骨密度下降的重要因素之一[33]。當腸道鈣吸收減少時，PTH質量濃度的上升可以促使骨鈣重吸收使骨骼中的鈣離子進入血液，維持血液中Ca2＋濃度的穩(wěn)定，長期PTH水平增加會導致骨鈣流失。因此，本研究表明PB2促進高脂膳食小鼠鈣吸收，抑制骨鈣的流失，干預高脂膳食性鈣代謝異常。

高脂膳食導致骨吸收和形成之間的平衡改變，隨之引發(fā)骨礦化降低與骨質量流失，加劇脆性骨折的風險，這種表觀的骨形態(tài)改變往往與骨基因表達有關[34]。本研究對基因表達譜進行PCA，其作為一種能夠有效降低數(shù)據(jù)維度的數(shù)學工具，能夠將實驗數(shù)據(jù)與樣本之間的關系可視化[35]，對RNA-Seq結果的PCA能夠將PB2組從HF組中有效分離出來，前2 個成分（PC1和PC2）分別占比96.78%和2.29%。同時使用FC和t檢驗結果的火山圖能夠有效減少統(tǒng)計中的系統(tǒng)誤差[36]。火山圖結果顯示PB2組/HF組總共鑒定出176 個差異基因，其中65 個基因表達顯著上調（P＜0.05），111 個基因表達顯著下調（P＜0.05），分別參與了破骨細胞分化、ECM-受體相互作用、CAMs、細胞周期和鈣信號通路等鈣代謝相關通路。已有研究表明，ECM大分子以廣泛的膠原家族為代表，參與骨細胞和骨組織穩(wěn)態(tài)的形成[37]；細胞黏附分子是免疫球蛋白超家族成員，能夠在成骨細胞成熟過程中表達，促進骨骼發(fā)育[38]。因此，本研究表明PB2能夠有效調控相關基因表達參與鈣代謝通路，從而干預鈣代謝異常。

本研究進一步對HF組/CON組和PB2組/HF組所涉及的差異基因進行分析，共篩選出49 個有效的差異基因，富集分析結果表明，它們歸屬于機體免疫、細胞吞噬識別作用、補體經(jīng)典激活途徑等功能，涉及腎素分泌、腎上腺素能信號傳導、cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路等信號通路。機體的血脂紊亂狀態(tài)會導致慢性炎癥反應的發(fā)生，進而介導相關免疫調節(jié)機制[39-40]。由破骨細胞作為效應細胞的機體自發(fā)免疫反應已被證實會促進骨分解代謝，導致骨質溶解直至骨折的過程[41]。在炎癥消退期間的細胞凋亡過程中，引發(fā)巨噬細胞或其他吞噬細胞的識別和清除，對于恢復正常組織結構和功能至關重要[42]。此外，補體分子作為一類參與免疫效應的大分子，其中一條由抗原-抗體復合物結合C1q啟動補體激活的途徑稱為補體系統(tǒng)的經(jīng)典激活途徑。目前，已有研究表明，補體C1q能夠通過調節(jié)Wnt（wingless/integrated）信號通路，促進破骨細胞融合但不影響成骨細胞的分化，從而在骨重塑中發(fā)揮重要作用[43]。因此，本研究表明PB2可能通過調控相關細胞功能干預高脂膳食性鈣代謝異常。

成骨細胞和破骨細胞的分化調節(jié)受到相關代謝通路的調控，腎素屬于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS），RAAS可在骨組織中刺激破骨細胞形成和抑制成骨細胞活性，從而誘導骨質流失，引發(fā)骨質疏松癥[44]。成骨細胞中已被報道存在β-腎上腺素能受體，其介導的信號傳導會抑制骨形成并觸發(fā)核因子κB受體活化因子配體（receptor ctivator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）介導的破骨細胞生成和骨吸收[45]。Nevola等[46]研究報道了β-受體阻滯劑能夠使使用者的骨折風險降低、骨礦物密度增加。鈣信號通路可調控RANKL-核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）的受體激活劑，參與Ca2＋代謝，還可通過CALM基因間接調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路。MAPK通路是參與誘導骨細胞分化和調節(jié)骨形成的中心信號通路之一，MAPK/細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號可誘導成骨細胞基因表達，而抑制MAPK信號可中間阻斷分化[47]。此外，cAMP和cGMP-PKG信號通路在骨代謝調節(jié)中也發(fā)揮了重要作用，已有研究報道，PTH通過cAMP信號通路的介導，促進成骨細胞特異性轉錄因子的形成，從而對成骨細胞骨形成功能調節(jié)[47-48]。Boguslawski等[49]研究也表明cAMP信號通路在PTH信號傳導和骨鈣素表達調節(jié)中具有重要作用，而骨鈣素被認為是成骨細胞分化的指標。cGMP-PKG信號通路的激活也已被報道參與調節(jié)骨轉換、破骨細胞和成骨細胞的分化，在骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[50]。

目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)多酚作為一種常見的天然活性物質可影響骨代謝相關基因表達，如李子中的多酚類物質可上調骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號傳導相關基因（Bmp2和Runx2等）表達，而Runx2基因表達量的上升和PPARγ基因表達量的下降有助于骨髓細胞分化為成骨細胞，提高骨礦物密度和和骨微結構參數(shù)[51-53]。本研究報道了膳食補充PB2對高脂膳食小鼠骨基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)PB2可調控高脂膳食小鼠股骨中Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3等基因的表達。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PB2可上調Calml3和Aldhla3基因表達，Calml3和Aldhla3基因主要參與cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路和鈣信號通路。最近的研究表明在cGMP-PKG信號通路中，Calml3基因表達的上調可以激活肌球蛋白輕鏈基因表達，增加肌球蛋白分泌量并間接促進平滑肌舒張，而肌球蛋白的表達可影響破骨細胞的形態(tài)和骨吸收活性[54]。此外，Aldhla3基因表達量增加，可能通過參與cAMP信號通路上調鈣調蛋白基因表達和調控PTH的分解代謝活動[55-56]，從而激活鈣信號通路，調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、促進成骨細胞形成。

本研究還發(fā)現(xiàn)PB2可顯著下調高脂膳食小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達，其主要參與腎素分泌、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導和cAMP信號通路。特別是Cdkn2a基因屬于細胞周期抑制基因，其與p16蛋白結合的基因產(chǎn)物p16INK4A可阻斷CyclinD1與CDK4/6結合，抑制CyclinD1-CDK4/6復合物對成視網(wǎng)膜細胞瘤Rb基因磷酸化，從而參與調控p53信號通路，阻斷細胞周期，使其停止于G1或S期，促使膠質細胞處于周期阻滯狀態(tài)[57]，影響骨髓間內的成骨細胞的功能[58]，可介導成骨細胞表觀遺傳發(fā)生變化，抑制其分化和功能[59]。同時，Cdkn2a基因作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，其過量表達會以甲狀旁腺相關蛋白或RANKL介導的方式刺激破骨細胞生成和骨吸收[60-61]，從而改變正常的骨重塑進程，導致骨骼疾病的發(fā)展[62]。Fcgr4基因可調控激活Fcγ受體，促使組織細胞釋放活性氧，導致局部炎癥反應和損傷，而炎癥的發(fā)生會誘導破骨細胞活性增強，從而導致骨流失[63-64]。此外，Adrb1基因下調已被發(fā)現(xiàn)可抑制β1-腎上腺素能受體表達[65]。使用腎素抑制劑可以阻滯RAAS，降低骨質疏松性骨折的發(fā)生率[66]，這可能是成骨細胞中的腎上腺素能信號傳導被抑制，從而導致動物模型中的骨礦物密度增加[67]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)Calml3和Aldhla3基因表達上調及Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4等基因表達下調可能與抑制破骨細胞活性和促進成骨細胞的活性的調節(jié)有關。

綜上，本研究表明PB2作為天然原花青素中含量豐富的低聚物，能夠干預高脂膳食小鼠鈣代謝異常，并下調小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達，上調Aldh1a3和Calml3基因表達，參與調控股骨腎素分泌、腎上腺素能信號傳導、cGMP-PKG、Ca2＋、cAMP信號通路等通路。本研究通過基因表達譜的變化分析了PB2干預高脂膳食性鈣代謝異常的可能機制，為其作為干預骨質疏松的功能因子的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。