張方方，肖 瀛，楊昌銘，吳其國(guó)，周一鳴，周小理

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院，上海 201415）

高脂膳食是指脂質(zhì)攝入量占總攝入能量30%以上的飲食模式，已被認(rèn)為是導(dǎo)致機(jī)體血脂紊亂和氧化應(yīng)激發(fā)生的重要原因[1-2]，進(jìn)而誘發(fā)肥胖、糖尿病等代謝疾病，嚴(yán)重影響正常生活和健康[3]。血脂紊亂和氧化應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生會(huì)介導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能受損，抑制骨形成并促進(jìn)骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[4-5]。骨骼的幾何形狀和微結(jié)構(gòu)以及骨重塑過(guò)程主要受基因表達(dá)控制，外界攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)代謝途徑的蛋白表達(dá)[6]。Cao Xiangchang等[7]研究表明，高脂膳食會(huì)增加大鼠模型的骨質(zhì)流失和骨骼微結(jié)構(gòu)改變程度，抑制成骨細(xì)胞分化和凋亡，同時(shí)增加破骨細(xì)胞的數(shù)量，并降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)水平。此外，高脂膳食已被證實(shí)可造成小鼠基因表達(dá)的變化，導(dǎo)致各種脂質(zhì)代謝過(guò)程和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)編碼RNA異常表達(dá)[8]。

原花青素是由黃酮類化合物聚合而成的次生代謝產(chǎn)物[9]，常見(jiàn)于各種植物的花、堅(jiān)果、果實(shí)、樹(shù)皮和種子中[10-11]，已被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)抗氧化、抗菌、抗炎癥及抗糖尿病等多種促健康活性[12-14]。Tenkumo等[15]研究表明，富含原花青素的葡萄籽提取物具有防止骨代謝失衡和促進(jìn)骨愈合、改善骨骼健康的作用。盡管原花青素作為一種天然功能因子其活性研究是食品營(yíng)養(yǎng)與健康領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，然而其對(duì)高脂膳食導(dǎo)致骨骼組織基因表達(dá)的影響鮮見(jiàn)研究報(bào)道。

隨著基于高通量技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq）由于具備高分辨率、高靈敏度、成本低等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為基因表達(dá)水平、關(guān)鍵基因的挖掘及調(diào)控機(jī)制研究的重要手段[16]。因此，本研究以高脂膳食誘導(dǎo)血脂代謝紊亂小鼠為模型，評(píng)價(jià)原花青素B2（proanthocyanidin B2，PB2）對(duì)高脂膳食性鈣代謝異常的干預(yù)作用，并通過(guò)RNA-Seq技術(shù)對(duì)小鼠股骨樣本進(jìn)行真核有參轉(zhuǎn)錄組分析，篩選差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），同時(shí)進(jìn)行相關(guān)通路的富集分析，為進(jìn)一步分析PB2對(duì)高脂模型小鼠鈣代謝異常干預(yù)作用的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

6 周齡SPF級(jí)C57BL/6健康雄性小鼠27 只，體質(zhì)量（17.3±1.0）g，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0003；動(dòng)物處理及飼養(yǎng)條件遵照動(dòng)物福利的相關(guān)規(guī)定及《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》實(shí)施。

實(shí)驗(yàn)飼料為低脂飼料、高脂飼料（Paigen飼料），具體飼料營(yíng)養(yǎng)能量見(jiàn)表1，購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用墊料、飼料均經(jīng)過(guò)輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，符合SPF級(jí)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)。

表1 飼料營(yíng)養(yǎng)素成分Table 1 Nutrient composition of experimental diets

PB2（純度≥90%） 上海同田生物技術(shù)有限公司；甲醛、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、氯仿、異丙醇等（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、鈣、甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）含量測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；TRIzol裂解液美國(guó)Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TruseqTM RNA sample prep Kit、HiSeq X Reagent Kits、NovaSeq Reagent Kits試劑盒 美國(guó)Illumina公司；QuantiFluor?dsDNA System-核酸提取試劑盒 普洛麥格生物技術(shù)有限公司；Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒 美國(guó)Beckman公司；Oligo（dT）美國(guó)Thermo Fisher公司；末端修復(fù)混合液 美國(guó)Enzymatics公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PURELAB Classic型超純水機(jī) 威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司；MDF-1156型低溫冰箱 日本三洋機(jī)電有限公司；XW-80型混合器 江蘇海門(mén)其林貝爾儀器有限公司；K280R型高速冷凍離心機(jī) 英國(guó)森特恩公司；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；磁力架 美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；E6150型Quantus? Fluorometer生物庫(kù) 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；NanoDrop2000型超微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司；qTOWER 2.2定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；2100型生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；NovaSeq 6000高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理

6 周齡小鼠同室分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前需要經(jīng)過(guò)1 周的環(huán)境適應(yīng)期，飼喂AIN93飼料，保持12 h明暗交替光照，溫度20～24 ℃、相對(duì)濕度50%～65%，小鼠可自由攝食和飲水（去離子水）。

小鼠隨機(jī)分3 組，每組9 只，對(duì)照組（CON組）飼喂低脂飼料、高脂膳食組（HF組）飼喂Paigen飼料、原花青素組（PB2組）飼喂添加0.2%（以飼料質(zhì)量計(jì)）PB2的Paigen飼料。本研究采用高脂膳食誘導(dǎo)血脂代謝紊亂模型[17-18]，PB2干預(yù)劑量根據(jù)前期研究[19]確定。所有小鼠自由攝食和飲水，持續(xù)飼喂8 周，每天觀察小鼠狀態(tài)，每周記錄一次小鼠體質(zhì)量及其食物攝入量。

1.3.2 血漿、股骨、尿液和糞便樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 周，每組取9 只小鼠開(kāi)展代謝平衡實(shí)驗(yàn)，分別放入代謝籠中，適應(yīng)3 d后，持續(xù)收集尿液和糞便3 d，記錄飼料消耗情況及糞便量和尿液量。

實(shí)驗(yàn)第8周末，小鼠斷食不斷水12 h，使用無(wú)水乙醚麻醉并稱量體質(zhì)量，通過(guò)摘取眼球取血。血液收集于含有1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%肝素鈉的離心管中，冰浴10 min后于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，取上清液于1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存，待測(cè)。

眼球取血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出完整左股骨，轉(zhuǎn)入裝有5 mL RNAlater試劑離心管中，于-40 ℃保存待提取RNA，右股骨取出后于-20 ℃保存用于骨礦物含量測(cè)定。

1.3.3 骨礦物含量的測(cè)定

參考曹靜祥[20]的方法稍加修改，股骨經(jīng)清洗后烘干至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量，每份股骨樣品放入一支瓷舟內(nèi)，并將瓷舟并排碼放在一片白色瓷磚上，疊放在馬弗爐中，以200 ℃為起始溫度，間隔100 ℃分段升溫至500 ℃灰化，并在爐溫降至100 ℃以下且灰分恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。

1.3.4 血脂水平和鈣吸收能力相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

血漿樣品于冰上解凍，股骨在室溫下解凍至室溫。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)相關(guān)操作進(jìn)行血漿血脂指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C）、鈣濃度、PTH質(zhì)量濃度和股骨鈣含量測(cè)定。

采用代謝平衡法評(píng)價(jià)小鼠鈣吸收能力。對(duì)采集飼料和糞便使用HNO3和HClO4（4∶1，V/V）進(jìn)行消化處理，用鈣含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中的鈣含量，依據(jù)公式（1）～（3）分別計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）、鈣凈吸收量和鈣貯留量。

式中：cTC為T(mén)C濃度/（mmol/L）；cHDL-C為HDL-C濃度/（mmol/L）。

1.3.5 mRNA測(cè)序

采用TRIzol法從股骨組織樣品（股骨頭近端）提取總RNA，同組每3 個(gè)樣品等量合并為一份樣本，具體流程如下。取定量股骨加入液氮，研磨后裝入預(yù)冷的加有1 mL TRIzol的離心管中，充分振蕩，裂解5 min；隨后于4 ℃、13 000×g條件下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移入新離心管中，加入200 μL預(yù)冷的氯仿，充分振蕩，靜置5 min；同條件離心15 min后吸取上清液轉(zhuǎn)移入新離心管中，加入與上清液體積相同的預(yù)冷異丙醇，靜置10 min；同條件離心10 min后吸去上清液，加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，吹吸混勻充分；同條件離心5 min后吸去上清液，再次離心數(shù)秒，吸除殘液，靜置3～5 min晾干；加入20～50 μL滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% DEPC溶液溶解。

利用NanoDrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整情況，使用2100型生物分析儀測(cè)定RNA完整值，并使用帶Oligo（dT）的磁珠與ployA進(jìn)行配對(duì)，分離出mRNA。在mRNA樣品中加入碎片緩沖液，將其打斷為300 bp左右的片段，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機(jī)引物，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成穩(wěn)定的雙鏈cDNA。隨后加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端，在3’末端加上一個(gè)A堿基，用于連接Y字形的接頭。

純化產(chǎn)物并進(jìn)行片段分選，對(duì)分選片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化并構(gòu)建文庫(kù)。利用QuantiFluor?dsDNA System定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)，在cBot cluster generator上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，生成clusters，隨后進(jìn)行Illumina NovaSeq6000上機(jī)測(cè)序。

1.3.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRTPCR）能夠驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果。提取總RNA后將其轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Taq聚合酶和EvaGreen dye熒光染料，以稀釋后的cDNA為模板擴(kuò)增靶基因，引物序列見(jiàn)表2。通過(guò)溶解度曲線評(píng)估PCR產(chǎn)物的特異性，所有qRT-PCR數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法[21]進(jìn)行分析，并歸一化為β-actin基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.4.1 生化指標(biāo)數(shù)據(jù)分析

小鼠生理生化指標(biāo)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0軟件通過(guò)Duncan’s法進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.2 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

使用SeqPrep和Sickle軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，并對(duì)質(zhì)量修剪前后的序列進(jìn)行數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)以保證后續(xù)分析順利進(jìn)行。

1.4.3 基因表達(dá)量分析

使用RSEM軟件對(duì)待分析數(shù)據(jù)計(jì)算基因表達(dá)情況，揭示基因功能和調(diào)控情況。表達(dá)定量的結(jié)果以每百萬(wàn)讀長(zhǎng)中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物數(shù)（transcripts per kilobase million，Tpm）為單位，對(duì)Tpm均一化使不同樣本中的總表達(dá)量一致。

1.4.4 基因表達(dá)差異分析

使用DESeq2軟件對(duì)CON、HF組和PB2組進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，鑒定出DEGs，并篩選差異共表達(dá)基因，用于后續(xù)研究。

篩選條件為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05、|log2FC|≥1（FC為變化倍數(shù)（fold change）。

1.4.5 差異基因GO富集分析

使用Goatools軟件和基因本體論（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/）進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，按照參與功能對(duì)基因進(jìn)行分類，總共分為生物進(jìn)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析，可以說(shuō)明差異基因的功能富集情況，闡明樣本間DEG在功能水平的異同。為控制計(jì)算的假陽(yáng)性率，使用Bonferroni多重檢驗(yàn)方法對(duì)P值進(jìn)行校正，當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的P≤0.05時(shí)，則說(shuō)明此GO功能存在顯著富集情況。

1.4.6 差異基因通路富集分析

使用KOBAS軟件基于京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行通路富集分析。為控制計(jì)算假陽(yáng)性率，采用BY（FDR）方法矯正P值，矯正P≤0.05時(shí)說(shuō)明此通路為DEGs中顯著富集的KEGG通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量及血漿脂質(zhì)水平的變化

如表3所示，各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量增加，與CON組相比，其他兩組小鼠體質(zhì)量降低顯著，但PB2組小鼠體質(zhì)量顯著高于HF組（P＜0.05）。HF組小鼠血漿TC、LDL-C濃度和AI顯著高于CON組（P＜0.05），PB2組小鼠的上述指標(biāo)與HF組顯著降低（P＜0.05）。此外，PB2組小鼠的TG濃度顯著低于其他兩組小鼠（P＜0.05）。長(zhǎng)期攝入高脂膳食可使體內(nèi)游離脂肪酸釋放進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)[22]，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，血漿TC水平顯著升高，血漿脂蛋白組成向LDL-C轉(zhuǎn)變，從而增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)[23]。已有研究表明，原花青素具有調(diào)節(jié)小鼠脂質(zhì)代謝的能力[24]，本研究結(jié)果也表明PB2可以調(diào)節(jié)高脂膳食介導(dǎo)的脂代謝異常，降低發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 PB2對(duì)小鼠體質(zhì)量和血漿脂質(zhì)水平的影響Table 3 Effect of procyanidin B2 on body mass and plasma lipid levels in mice

2.2 鈣吸收、鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)與骨礦物含量的變化

鈣代謝平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，與CON組相比，高脂膳食小鼠（HF組）鈣攝入量降低，糞鈣排泄量和尿鈣量增加（P＞0.05），鈣凈吸收量和鈣貯留量顯著降低（P＜0.05）。與HF組相比，PB2組鈣凈吸收和鈣貯留量顯著增加（P＜0.05），鈣凈吸收量與鈣貯留量有向CON組水平恢復(fù)的趨勢(shì)。

表4 PB2對(duì)小鼠鈣吸收的影響Table 4 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium absorption in mice

PTH是細(xì)胞外鈣和磷的重要調(diào)節(jié)因子，也是機(jī)體的血鈣濃度維持劑，能夠刺激骨細(xì)胞對(duì)骨的重吸收[25]。如圖1所示，血漿鈣濃度在3 組樣本間無(wú)顯著變化（P＞0.05），與CON組相比，HF組的PTH質(zhì)量濃度高度顯著提高（P＜0.05），與HF組相比，PB2干預(yù)后可以顯著降低高脂膳食小鼠PTH質(zhì)量濃度（P＜0.05），部分恢復(fù)到CON組水平。如表5所示，HF組骨礦物含量和股骨鈣含量與CON組相比顯著降低（P＜0.05），而PB2攝入可以使含量恢復(fù)至正常水平。因此，綜合鈣吸收、鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨礦物含量的結(jié)果可知，高脂膳食導(dǎo)致的鈣吸收降低可能造成小鼠鈣代謝負(fù)平衡，從而刺激PTH分泌，動(dòng)員骨鈣入血，使骨骼中礦物質(zhì)含量降低，從而維持血鈣濃度穩(wěn)定的水平范圍，而PB2組可以干預(yù)由高脂膳食導(dǎo)致的鈣代謝異常。

圖1 PB2對(duì)小鼠鈣穩(wěn)態(tài)的影響Fig. 1 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium homeostasis in mice

表5 PB2對(duì)小鼠骨礦物含量、股骨鈣含量的影響Table 5 Effect of proanthocyanidin B2 on bone mineral content and femoral calcium content in mice

2.3 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估

對(duì)3 組小鼠股骨提取的mRNA進(jìn)行RNA-Seq，如表6所示，測(cè)序共獲得557 782 130 條序列，質(zhì)量過(guò)濾質(zhì)控后CON組測(cè)得181 626 736 條序列，HF組測(cè)得172 345 898 條序列，PB2組測(cè)得193 498 872 條序列。測(cè)序過(guò)濾后所得數(shù)據(jù)整體質(zhì)量較高，測(cè)序錯(cuò)誤率均在0.012%左右，Q20（Phred數(shù)值大于20的堿基占總堿基的百分比）在98.29%以上，Q30（Phred數(shù)值大于30的堿基占總堿基的百分比）超過(guò)94.86%，GC相對(duì)含量（堿基G和C數(shù)目總和占總堿基數(shù)目的百分比）均在52.5%以上，表明堿基G與C含量大致相等。

表6 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 6 Statistics of sequencing data

2.4 差異基因表達(dá)分析

為了研究不同組中基因表達(dá)情況，本研究采用RSEM 1.2.31軟件，以Tpm為衡量表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異量表達(dá)分析。樣本間基因主成分分析（principal components analysis，PCA）結(jié)果如圖2所示，CON、HF、PB2組在貢獻(xiàn)度最高的PC1和PC2上離散明顯，PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為96.78%和2.29%。高脂膳食攝入使得HF組顯著遠(yuǎn)離CON組樣本，而PB2組能夠改善這一偏移情況，與HF組相比，PB2組距離CON組更為接近。

為了進(jìn)一步研究不同組間存在差異的基因表達(dá)，本研究采用DESeq 2 1.10.1分析，選取|FC|≥2且P＜0.05的基因作為組間差異基因，分別對(duì)HF組/CON組和PB2組/HF組進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。HF組/CON組總共鑒定出436 個(gè)差異基因，差異統(tǒng)計(jì)火山圖表明，高脂膳食攝入導(dǎo)致其中204 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，232 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)；PB2組/HF組總共鑒定出176 個(gè)差異基因，PB2組攝入使得其中65 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，111 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

此外，對(duì)3 組中共表達(dá)的差異基因進(jìn)行篩選，共篩選出49 個(gè)基因，與CON組基因表達(dá)情況相比，高脂膳食攝入使得38 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，11 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)，PB2組攝入可以使其中1 個(gè)基因表達(dá)保持繼續(xù)下調(diào)，顯著改善高脂膳食導(dǎo)致的其余48 個(gè)基因表達(dá)異常（P＜0.05）。

圖2 樣本間基因PCAFig. 2 Principal components analysis of genes between samples

圖3 基因表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)火山圖Fig. 3 Volcano plot for the expression of differential genes

2.5 差異共表達(dá)基因的富集分析

對(duì)于PB2組/HF組鑒別出的176 個(gè)差異基因進(jìn)行了直接與鈣代謝相關(guān)的通路的篩選分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）-受體相互作用、細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）、細(xì)胞周期和鈣信號(hào)通路（表7），基因表達(dá)變化總體呈現(xiàn)PB2對(duì)破骨細(xì)胞活性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)并對(duì)膠原合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)。

表7 骨代謝相關(guān)通路基因表達(dá)的影響Table 7 Changes in gene expression associated with bone metabolismrelated pathways

為了從數(shù)量較多的潛在靶基因中篩選出有代表意義的基因進(jìn)行驗(yàn)證，本研究使用Goatools 0.6.5等軟件進(jìn)一步對(duì)49 個(gè)差異共表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析中前20的顯著性GO項(xiàng)結(jié)果表明，差異共表達(dá)基因歸屬于BP和CC兩個(gè)分支，其中包括機(jī)體免疫、機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞吞噬作用、細(xì)胞識(shí)別、補(bǔ)體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、大分子復(fù)合物的組成等（圖4A）。KEGG富集分析結(jié)果展示了主要調(diào)控通路，共有13 條通路顯著富集（P＜0.05），分別為腎素分泌、唾液分泌、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等（圖4B）。

圖4 差異共表達(dá)基因富集分析Fig. 4 Enrichment analysis of differentially co-expressed genes

此外，本研究根據(jù)顯著性富集通路對(duì)差異共表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選出5 個(gè)基因作為潛在調(diào)控基因（表8），分別為Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3基因，PB2組干預(yù)可以顯著下調(diào)高脂膳食小鼠Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因的表達(dá)量，分別下調(diào)9.19、3.68、3.61 倍，上調(diào)Aldh1a3和Calml3基因表達(dá)量，分別上調(diào)2.06、3.29 倍（P＜0.05）。

表8 顯著性富集通路篩選的差異共表達(dá)基因Table 8 Differentially co-expressed genes selected by the significant KEGG pathways enriched

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證差異基因Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3的表達(dá)水平變化結(jié)果，進(jìn)行了qRT-PCR分析（圖5）。與RNA-Seq結(jié)果相比，盡管qRT-PCR測(cè)得基因表達(dá)水平結(jié)果略有不同，但其變化趨勢(shì)保持了一致性，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

圖5 qRT-PCR驗(yàn)證差異共表達(dá)基因的變化Fig. 5 qRT-PCR verification of changes in the expression of differentially co-expressed genes

3 討 論

近年來(lái)，由高脂飲食引起的代謝疾病及其并發(fā)癥是世界主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[26]。已有研究表明，高脂膳食的攝入會(huì)顯著提升小鼠的血漿甘油三酸酯和膽固醇水平，導(dǎo)致血脂紊亂[27]。本研究結(jié)果與先前研究結(jié)果[28-29]一致，與CON組相比，高脂膳食會(huì)導(dǎo)致小鼠TC、LDL-C濃度和AI水平顯著增加（P＜0.05）。此外，Bhandi等[25]研究表明，多酚的攝入可顯著降低高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度和AI水平，這與本研究中補(bǔ)充PB2有效降低了高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度、AI水平的結(jié)果相似。長(zhǎng)期攝入高脂膳食導(dǎo)致的血脂紊亂已被證明對(duì)骨骼健康的具有不利影響[30]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，小鼠飼喂高脂膳食會(huì)導(dǎo)致骨密度、骨形成水平降低，骨髓脂肪增加[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)PB2可以顯著增加高脂膳食小鼠的鈣凈吸收和鈣貯留量（P＜0.05），顯著降低PTH質(zhì)量濃度（P＜0.05），增加骨礦物與骨鈣含量。腸道鈣吸收量的降低是骨鈣含量減少與骨密度下降的重要因素之一[33]。當(dāng)腸道鈣吸收減少時(shí)，PTH質(zhì)量濃度的上升可以促使骨鈣重吸收使骨骼中的鈣離子進(jìn)入血液，維持血液中Ca2＋濃度的穩(wěn)定，長(zhǎng)期PTH水平增加會(huì)導(dǎo)致骨鈣流失。因此，本研究表明PB2促進(jìn)高脂膳食小鼠鈣吸收，抑制骨鈣的流失，干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常。

高脂膳食導(dǎo)致骨吸收和形成之間的平衡改變，隨之引發(fā)骨礦化降低與骨質(zhì)量流失，加劇脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，這種表觀的骨形態(tài)改變往往與骨基因表達(dá)有關(guān)[34]。本研究對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行PCA，其作為一種能夠有效降低數(shù)據(jù)維度的數(shù)學(xué)工具，能夠?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與樣本之間的關(guān)系可視化[35]，對(duì)RNA-Seq結(jié)果的PCA能夠?qū)B2組從HF組中有效分離出來(lái)，前2 個(gè)成分（PC1和PC2）分別占比96.78%和2.29%。同時(shí)使用FC和t檢驗(yàn)結(jié)果的火山圖能夠有效減少統(tǒng)計(jì)中的系統(tǒng)誤差[36]?；鹕綀D結(jié)果顯示PB2組/HF組總共鑒定出176 個(gè)差異基因，其中65 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），111 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），分別參與了破骨細(xì)胞分化、ECM-受體相互作用、CAMs、細(xì)胞周期和鈣信號(hào)通路等鈣代謝相關(guān)通路。已有研究表明，ECM大分子以廣泛的膠原家族為代表，參與骨細(xì)胞和骨組織穩(wěn)態(tài)的形成[37]；細(xì)胞黏附分子是免疫球蛋白超家族成員，能夠在成骨細(xì)胞成熟過(guò)程中表達(dá)，促進(jìn)骨骼發(fā)育[38]。因此，本研究表明PB2能夠有效調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與鈣代謝通路，從而干預(yù)鈣代謝異常。

本研究進(jìn)一步對(duì)HF組/CON組和PB2組/HF組所涉及的差異基因進(jìn)行分析，共篩選出49 個(gè)有效的差異基因，富集分析結(jié)果表明，它們歸屬于機(jī)體免疫、細(xì)胞吞噬識(shí)別作用、補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑等功能，涉及腎素分泌、腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等信號(hào)通路。機(jī)體的血脂紊亂狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而介導(dǎo)相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[39-40]。由破骨細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞的機(jī)體自發(fā)免疫反應(yīng)已被證實(shí)會(huì)促進(jìn)骨分解代謝，導(dǎo)致骨質(zhì)溶解直至骨折的過(guò)程[41]。在炎癥消退期間的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，引發(fā)巨噬細(xì)胞或其他吞噬細(xì)胞的識(shí)別和清除，對(duì)于恢復(fù)正常組織結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[42]。此外，補(bǔ)體分子作為一類參與免疫效應(yīng)的大分子，其中一條由抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合C1q啟動(dòng)補(bǔ)體激活的途徑稱為補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典激活途徑。目前，已有研究表明，補(bǔ)體C1q能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt（wingless/integrated）信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞融合但不影響成骨細(xì)胞的分化，從而在骨重塑中發(fā)揮重要作用[43]。因此，本研究表明PB2可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞功能干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常。

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)受到相關(guān)代謝通路的調(diào)控，腎素屬于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS），RAAS可在骨組織中刺激破骨細(xì)胞形成和抑制成骨細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)骨質(zhì)流失，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[44]。成骨細(xì)胞中已被報(bào)道存在β-腎上腺素能受體，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)抑制骨形成并觸發(fā)核因子κB受體活化因子配體（receptor ctivator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收[45]。Nevola等[46]研究報(bào)道了β-受體阻滯劑能夠使使用者的骨折風(fēng)險(xiǎn)降低、骨礦物密度增加。鈣信號(hào)通路可調(diào)控RANKL-核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）的受體激活劑，參與Ca2＋代謝，還可通過(guò)CALM基因間接調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路。MAPK通路是參與誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)骨形成的中心信號(hào)通路之一，MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號(hào)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞基因表達(dá)，而抑制MAPK信號(hào)可中間阻斷分化[47]。此外，cAMP和cGMP-PKG信號(hào)通路在骨代謝調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要作用，已有研究報(bào)道，PTH通過(guò)cAMP信號(hào)通路的介導(dǎo)，促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的形成，從而對(duì)成骨細(xì)胞骨形成功能調(diào)節(jié)[47-48]。Boguslawski等[49]研究也表明cAMP信號(hào)通路在PTH信號(hào)傳導(dǎo)和骨鈣素表達(dá)調(diào)節(jié)中具有重要作用，而骨鈣素被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)。cGMP-PKG信號(hào)通路的激活也已被報(bào)道參與調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化，在骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[50]。

目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)多酚作為一種常見(jiàn)的天然活性物質(zhì)可影響骨代謝相關(guān)基因表達(dá)，如李子中的多酚類物質(zhì)可上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因（Bmp2和Runx2等）表達(dá)，而Runx2基因表達(dá)量的上升和PPARγ基因表達(dá)量的下降有助于骨髓細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，提高骨礦物密度和和骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)[51-53]。本研究報(bào)道了膳食補(bǔ)充PB2對(duì)高脂膳食小鼠骨基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)PB2可調(diào)控高脂膳食小鼠股骨中Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3等基因的表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PB2可上調(diào)Calml3和Aldhla3基因表達(dá)，Calml3和Aldhla3基因主要參與cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路。最近的研究表明在cGMP-PKG信號(hào)通路中，Calml3基因表達(dá)的上調(diào)可以激活肌球蛋白輕鏈基因表達(dá)，增加肌球蛋白分泌量并間接促進(jìn)平滑肌舒張，而肌球蛋白的表達(dá)可影響破骨細(xì)胞的形態(tài)和骨吸收活性[54]。此外，Aldhla3基因表達(dá)量增加，可能通過(guò)參與cAMP信號(hào)通路上調(diào)鈣調(diào)蛋白基因表達(dá)和調(diào)控PTH的分解代謝活動(dòng)[55-56]，從而激活鈣信號(hào)通路，調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成。

本研究還發(fā)現(xiàn)PB2可顯著下調(diào)高脂膳食小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達(dá)，其主要參與腎素分泌、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)和cAMP信號(hào)通路。特別是Cdkn2a基因?qū)儆诩?xì)胞周期抑制基因，其與p16蛋白結(jié)合的基因產(chǎn)物p16INK4A可阻斷CyclinD1與CDK4/6結(jié)合，抑制CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物對(duì)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤Rb基因磷酸化，從而參與調(diào)控p53信號(hào)通路，阻斷細(xì)胞周期，使其停止于G1或S期，促使膠質(zhì)細(xì)胞處于周期阻滯狀態(tài)[57]，影響骨髓間內(nèi)的成骨細(xì)胞的功能[58]，可介導(dǎo)成骨細(xì)胞表觀遺傳發(fā)生變化，抑制其分化和功能[59]。同時(shí)，Cdkn2a基因作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，其過(guò)量表達(dá)會(huì)以甲狀旁腺相關(guān)蛋白或RANKL介導(dǎo)的方式刺激破骨細(xì)胞生成和骨吸收[60-61]，從而改變正常的骨重塑進(jìn)程，導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)展[62]。Fcgr4基因可調(diào)控激活Fcγ受體，促使組織細(xì)胞釋放活性氧，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和損傷，而炎癥的發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致骨流失[63-64]。此外，Adrb1基因下調(diào)已被發(fā)現(xiàn)可抑制β1-腎上腺素能受體表達(dá)[65]。使用腎素抑制劑可以阻滯RAAS，降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率[66]，這可能是成骨細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)被抑制，從而導(dǎo)致動(dòng)物模型中的骨礦物密度增加[67]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)Calml3和Aldhla3基因表達(dá)上調(diào)及Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4等基因表達(dá)下調(diào)可能與抑制破骨細(xì)胞活性和促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上，本研究表明PB2作為天然原花青素中含量豐富的低聚物，能夠干預(yù)高脂膳食小鼠鈣代謝異常，并下調(diào)小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達(dá)，上調(diào)Aldh1a3和Calml3基因表達(dá)，參與調(diào)控股骨腎素分泌、腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、cGMP-PKG、Ca2＋、cAMP信號(hào)通路等通路。本研究通過(guò)基因表達(dá)譜的變化分析了PB2干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常的可能機(jī)制，為其作為干預(yù)骨質(zhì)疏松的功能因子的開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。