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        原花青素B2對(duì)高脂膳食小鼠鈣代謝及股骨基因表達(dá)譜的影響

        2022-11-30 08:33:58張方方楊昌銘吳其國(guó)周一鳴周小理
        食品科學(xué) 2022年21期
        關(guān)鍵詞:高脂骨細(xì)胞成骨細(xì)胞

        張方方,肖 瀛,楊昌銘,吳其國(guó),周一鳴,周小理

        (1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418;2.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院,上海 201415)

        高脂膳食是指脂質(zhì)攝入量占總攝入能量30%以上的飲食模式,已被認(rèn)為是導(dǎo)致機(jī)體血脂紊亂和氧化應(yīng)激發(fā)生的重要原因[1-2],進(jìn)而誘發(fā)肥胖、糖尿病等代謝疾病,嚴(yán)重影響正常生活和健康[3]。血脂紊亂和氧化應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生會(huì)介導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能受損,抑制骨形成并促進(jìn)骨吸收,從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[4-5]。骨骼的幾何形狀和微結(jié)構(gòu)以及骨重塑過(guò)程主要受基因表達(dá)控制,外界攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)代謝途徑的蛋白表達(dá)[6]。Cao Xiangchang等[7]研究表明,高脂膳食會(huì)增加大鼠模型的骨質(zhì)流失和骨骼微結(jié)構(gòu)改變程度,抑制成骨細(xì)胞分化和凋亡,同時(shí)增加破骨細(xì)胞的數(shù)量,并降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)水平。此外,高脂膳食已被證實(shí)可造成小鼠基因表達(dá)的變化,導(dǎo)致各種脂質(zhì)代謝過(guò)程和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)編碼RNA異常表達(dá)[8]。

        原花青素是由黃酮類化合物聚合而成的次生代謝產(chǎn)物[9],常見(jiàn)于各種植物的花、堅(jiān)果、果實(shí)、樹(shù)皮和種子中[10-11],已被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)抗氧化、抗菌、抗炎癥及抗糖尿病等多種促健康活性[12-14]。Tenkumo等[15]研究表明,富含原花青素的葡萄籽提取物具有防止骨代謝失衡和促進(jìn)骨愈合、改善骨骼健康的作用。盡管原花青素作為一種天然功能因子其活性研究是食品營(yíng)養(yǎng)與健康領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,然而其對(duì)高脂膳食導(dǎo)致骨骼組織基因表達(dá)的影響鮮見(jiàn)研究報(bào)道。

        隨著基于高通量技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA sequencing,RNA-Seq)由于具備高分辨率、高靈敏度、成本低等優(yōu)勢(shì),逐漸成為基因表達(dá)水平、關(guān)鍵基因的挖掘及調(diào)控機(jī)制研究的重要手段[16]。因此,本研究以高脂膳食誘導(dǎo)血脂代謝紊亂小鼠為模型,評(píng)價(jià)原花青素B2(proanthocyanidin B2,PB2)對(duì)高脂膳食性鈣代謝異常的干預(yù)作用,并通過(guò)RNA-Seq技術(shù)對(duì)小鼠股骨樣本進(jìn)行真核有參轉(zhuǎn)錄組分析,篩選差異表達(dá)基因(differential expression genes,DEGs),同時(shí)進(jìn)行相關(guān)通路的富集分析,為進(jìn)一步分析PB2對(duì)高脂模型小鼠鈣代謝異常干預(yù)作用的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物、材料與試劑

        6 周齡SPF級(jí)C57BL/6健康雄性小鼠27 只,體質(zhì)量(17.3±1.0)g,購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0003;動(dòng)物處理及飼養(yǎng)條件遵照動(dòng)物福利的相關(guān)規(guī)定及《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》實(shí)施。

        實(shí)驗(yàn)飼料為低脂飼料、高脂飼料(Paigen飼料),具體飼料營(yíng)養(yǎng)能量見(jiàn)表1,購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用墊料、飼料均經(jīng)過(guò)輻照殺菌處理,飲用水經(jīng)高壓滅菌處理,符合SPF級(jí)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)。

        表1 飼料營(yíng)養(yǎng)素成分Table 1 Nutrient composition of experimental diets

        PB2(純度≥90%) 上海同田生物技術(shù)有限公司;甲醛、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、氯仿、異丙醇等(分析純)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、鈣、甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)含量測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司;TRIzol裂解液美國(guó)Invitrogen公司;焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;TruseqTM RNA sample prep Kit、HiSeq X Reagent Kits、NovaSeq Reagent Kits試劑盒 美國(guó)Illumina公司;QuantiFluor?dsDNA System-核酸提取試劑盒 普洛麥格生物技術(shù)有限公司;Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒 美國(guó)Beckman公司;Oligo(dT)美國(guó)Thermo Fisher公司;末端修復(fù)混合液 美國(guó)Enzymatics公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        PURELAB Classic型超純水機(jī) 威立雅水處理技術(shù)(上海)有限公司;MDF-1156型低溫冰箱 日本三洋機(jī)電有限公司;XW-80型混合器 江蘇海門(mén)其林貝爾儀器有限公司;K280R型高速冷凍離心機(jī) 英國(guó)森特恩公司;TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;磁力架 美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司;E6150型Quantus? Fluorometer生物庫(kù) 普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;NanoDrop2000型超微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司;qTOWER 2.2定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀德國(guó)耶拿分析儀器股份公司;2100型生物分析儀 美國(guó)Agilent公司;NovaSeq 6000高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

        1.3 方法

        1.3.1 動(dòng)物分組及處理

        6 周齡小鼠同室分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi),所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前需要經(jīng)過(guò)1 周的環(huán)境適應(yīng)期,飼喂AIN93飼料,保持12 h明暗交替光照,溫度20~24 ℃、相對(duì)濕度50%~65%,小鼠可自由攝食和飲水(去離子水)。

        小鼠隨機(jī)分3 組,每組9 只,對(duì)照組(CON組)飼喂低脂飼料、高脂膳食組(HF組)飼喂Paigen飼料、原花青素組(PB2組)飼喂添加0.2%(以飼料質(zhì)量計(jì))PB2的Paigen飼料。本研究采用高脂膳食誘導(dǎo)血脂代謝紊亂模型[17-18],PB2干預(yù)劑量根據(jù)前期研究[19]確定。所有小鼠自由攝食和飲水,持續(xù)飼喂8 周,每天觀察小鼠狀態(tài),每周記錄一次小鼠體質(zhì)量及其食物攝入量。

        1.3.2 血漿、股骨、尿液和糞便樣品采集

        實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 周,每組取9 只小鼠開(kāi)展代謝平衡實(shí)驗(yàn),分別放入代謝籠中,適應(yīng)3 d后,持續(xù)收集尿液和糞便3 d,記錄飼料消耗情況及糞便量和尿液量。

        實(shí)驗(yàn)第8周末,小鼠斷食不斷水12 h,使用無(wú)水乙醚麻醉并稱量體質(zhì)量,通過(guò)摘取眼球取血。血液收集于含有1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%肝素鈉的離心管中,冰浴10 min后于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min,取上清液于1.5 mL離心管中,-80 ℃冰箱保存,待測(cè)。

        眼球取血完畢后,頸椎脫臼處死小鼠,解剖取出完整左股骨,轉(zhuǎn)入裝有5 mL RNAlater試劑離心管中,于-40 ℃保存待提取RNA,右股骨取出后于-20 ℃保存用于骨礦物含量測(cè)定。

        1.3.3 骨礦物含量的測(cè)定

        參考曹靜祥[20]的方法稍加修改,股骨經(jīng)清洗后烘干至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量,每份股骨樣品放入一支瓷舟內(nèi),并將瓷舟并排碼放在一片白色瓷磚上,疊放在馬弗爐中,以200 ℃為起始溫度,間隔100 ℃分段升溫至500 ℃灰化,并在爐溫降至100 ℃以下且灰分恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。

        1.3.4 血脂水平和鈣吸收能力相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

        血漿樣品于冰上解凍,股骨在室溫下解凍至室溫。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)相關(guān)操作進(jìn)行血漿血脂指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、鈣濃度、PTH質(zhì)量濃度和股骨鈣含量測(cè)定。

        采用代謝平衡法評(píng)價(jià)小鼠鈣吸收能力。對(duì)采集飼料和糞便使用HNO3和HClO4(4∶1,V/V)進(jìn)行消化處理,用鈣含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中的鈣含量,依據(jù)公式(1)~(3)分別計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)(atherosclerosis index,AI)、鈣凈吸收量和鈣貯留量。

        式中:cTC為T(mén)C濃度/(mmol/L);cHDL-C為HDL-C濃度/(mmol/L)。

        1.3.5 mRNA測(cè)序

        采用TRIzol法從股骨組織樣品(股骨頭近端)提取總RNA,同組每3 個(gè)樣品等量合并為一份樣本,具體流程如下。取定量股骨加入液氮,研磨后裝入預(yù)冷的加有1 mL TRIzol的離心管中,充分振蕩,裂解5 min;隨后于4 ℃、13 000×g條件下離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移入新離心管中,加入200 μL預(yù)冷的氯仿,充分振蕩,靜置5 min;同條件離心15 min后吸取上清液轉(zhuǎn)移入新離心管中,加入與上清液體積相同的預(yù)冷異丙醇,靜置10 min;同條件離心10 min后吸去上清液,加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液,吹吸混勻充分;同條件離心5 min后吸去上清液,再次離心數(shù)秒,吸除殘液,靜置3~5 min晾干;加入20~50 μL滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% DEPC溶液溶解。

        利用NanoDrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度,瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整情況,使用2100型生物分析儀測(cè)定RNA完整值,并使用帶Oligo(dT)的磁珠與ployA進(jìn)行配對(duì),分離出mRNA。在mRNA樣品中加入碎片緩沖液,將其打斷為300 bp左右的片段,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,利用隨機(jī)引物,以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成穩(wěn)定的雙鏈cDNA。隨后加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端,在3’末端加上一個(gè)A堿基,用于連接Y字形的接頭。

        純化產(chǎn)物并進(jìn)行片段分選,對(duì)分選片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,純化并構(gòu)建文庫(kù)。利用QuantiFluor?dsDNA System定量,按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī),在cBot cluster generator上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增,生成clusters,隨后進(jìn)行Illumina NovaSeq6000上機(jī)測(cè)序。

        1.3.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定

        實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRTPCR)能夠驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果。提取總RNA后將其轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用Taq聚合酶和EvaGreen dye熒光染料,以稀釋后的cDNA為模板擴(kuò)增靶基因,引物序列見(jiàn)表2。通過(guò)溶解度曲線評(píng)估PCR產(chǎn)物的特異性,所有qRT-PCR數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法[21]進(jìn)行分析,并歸一化為β-actin基因的相對(duì)表達(dá)量。

        表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for qRT-PCR

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        1.4.1 生化指標(biāo)數(shù)據(jù)分析

        小鼠生理生化指標(biāo)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 22.0軟件通過(guò)Duncan’s法進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        1.4.2 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

        使用SeqPrep和Sickle軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,并對(duì)質(zhì)量修剪前后的序列進(jìn)行數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì),得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)以保證后續(xù)分析順利進(jìn)行。

        1.4.3 基因表達(dá)量分析

        使用RSEM軟件對(duì)待分析數(shù)據(jù)計(jì)算基因表達(dá)情況,揭示基因功能和調(diào)控情況。表達(dá)定量的結(jié)果以每百萬(wàn)讀長(zhǎng)中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物數(shù)(transcripts per kilobase million,Tpm)為單位,對(duì)Tpm均一化使不同樣本中的總表達(dá)量一致。

        1.4.4 基因表達(dá)差異分析

        使用DESeq2軟件對(duì)CON、HF組和PB2組進(jìn)行基因表達(dá)差異分析,鑒定出DEGs,并篩選差異共表達(dá)基因,用于后續(xù)研究。

        篩選條件為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)<0.05、|log2FC|≥1(FC為變化倍數(shù)(fold change)。

        1.4.5 差異基因GO富集分析

        使用Goatools軟件和基因本體論(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn),按照參與功能對(duì)基因進(jìn)行分類,總共分為生物進(jìn)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析,可以說(shuō)明差異基因的功能富集情況,闡明樣本間DEG在功能水平的異同。為控制計(jì)算的假陽(yáng)性率,使用Bonferroni多重檢驗(yàn)方法對(duì)P值進(jìn)行校正,當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的P≤0.05時(shí),則說(shuō)明此GO功能存在顯著富集情況。

        1.4.6 差異基因通路富集分析

        使用KOBAS軟件基于京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行通路富集分析。為控制計(jì)算假陽(yáng)性率,采用BY(FDR)方法矯正P值,矯正P≤0.05時(shí)說(shuō)明此通路為DEGs中顯著富集的KEGG通路。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 體質(zhì)量及血漿脂質(zhì)水平的變化

        如表3所示,各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量增加,與CON組相比,其他兩組小鼠體質(zhì)量降低顯著,但PB2組小鼠體質(zhì)量顯著高于HF組(P<0.05)。HF組小鼠血漿TC、LDL-C濃度和AI顯著高于CON組(P<0.05),PB2組小鼠的上述指標(biāo)與HF組顯著降低(P<0.05)。此外,PB2組小鼠的TG濃度顯著低于其他兩組小鼠(P<0.05)。長(zhǎng)期攝入高脂膳食可使體內(nèi)游離脂肪酸釋放進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)[22],導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常,血漿TC水平顯著升高,血漿脂蛋白組成向LDL-C轉(zhuǎn)變,從而增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)[23]。已有研究表明,原花青素具有調(diào)節(jié)小鼠脂質(zhì)代謝的能力[24],本研究結(jié)果也表明PB2可以調(diào)節(jié)高脂膳食介導(dǎo)的脂代謝異常,降低發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。

        表3 PB2對(duì)小鼠體質(zhì)量和血漿脂質(zhì)水平的影響Table 3 Effect of procyanidin B2 on body mass and plasma lipid levels in mice

        2.2 鈣吸收、鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)與骨礦物含量的變化

        鈣代謝平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,與CON組相比,高脂膳食小鼠(HF組)鈣攝入量降低,糞鈣排泄量和尿鈣量增加(P>0.05),鈣凈吸收量和鈣貯留量顯著降低(P<0.05)。與HF組相比,PB2組鈣凈吸收和鈣貯留量顯著增加(P<0.05),鈣凈吸收量與鈣貯留量有向CON組水平恢復(fù)的趨勢(shì)。

        表4 PB2對(duì)小鼠鈣吸收的影響Table 4 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium absorption in mice

        PTH是細(xì)胞外鈣和磷的重要調(diào)節(jié)因子,也是機(jī)體的血鈣濃度維持劑,能夠刺激骨細(xì)胞對(duì)骨的重吸收[25]。如圖1所示,血漿鈣濃度在3 組樣本間無(wú)顯著變化(P>0.05),與CON組相比,HF組的PTH質(zhì)量濃度高度顯著提高(P<0.05),與HF組相比,PB2干預(yù)后可以顯著降低高脂膳食小鼠PTH質(zhì)量濃度(P<0.05),部分恢復(fù)到CON組水平。如表5所示,HF組骨礦物含量和股骨鈣含量與CON組相比顯著降低(P<0.05),而PB2攝入可以使含量恢復(fù)至正常水平。因此,綜合鈣吸收、鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨礦物含量的結(jié)果可知,高脂膳食導(dǎo)致的鈣吸收降低可能造成小鼠鈣代謝負(fù)平衡,從而刺激PTH分泌,動(dòng)員骨鈣入血,使骨骼中礦物質(zhì)含量降低,從而維持血鈣濃度穩(wěn)定的水平范圍,而PB2組可以干預(yù)由高脂膳食導(dǎo)致的鈣代謝異常。

        圖1 PB2對(duì)小鼠鈣穩(wěn)態(tài)的影響Fig. 1 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium homeostasis in mice

        表5 PB2對(duì)小鼠骨礦物含量、股骨鈣含量的影響Table 5 Effect of proanthocyanidin B2 on bone mineral content and femoral calcium content in mice

        2.3 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估

        對(duì)3 組小鼠股骨提取的mRNA進(jìn)行RNA-Seq,如表6所示,測(cè)序共獲得557 782 130 條序列,質(zhì)量過(guò)濾質(zhì)控后CON組測(cè)得181 626 736 條序列,HF組測(cè)得172 345 898 條序列,PB2組測(cè)得193 498 872 條序列。測(cè)序過(guò)濾后所得數(shù)據(jù)整體質(zhì)量較高,測(cè)序錯(cuò)誤率均在0.012%左右,Q20(Phred數(shù)值大于20的堿基占總堿基的百分比)在98.29%以上,Q30(Phred數(shù)值大于30的堿基占總堿基的百分比)超過(guò)94.86%,GC相對(duì)含量(堿基G和C數(shù)目總和占總堿基數(shù)目的百分比)均在52.5%以上,表明堿基G與C含量大致相等。

        表6 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 6 Statistics of sequencing data

        2.4 差異基因表達(dá)分析

        為了研究不同組中基因表達(dá)情況,本研究采用RSEM 1.2.31軟件,以Tpm為衡量表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異量表達(dá)分析。樣本間基因主成分分析(principal components analysis,PCA)結(jié)果如圖2所示,CON、HF、PB2組在貢獻(xiàn)度最高的PC1和PC2上離散明顯,PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為96.78%和2.29%。高脂膳食攝入使得HF組顯著遠(yuǎn)離CON組樣本,而PB2組能夠改善這一偏移情況,與HF組相比,PB2組距離CON組更為接近。

        為了進(jìn)一步研究不同組間存在差異的基因表達(dá),本研究采用DESeq 2 1.10.1分析,選取|FC|≥2且P<0.05的基因作為組間差異基因,分別對(duì)HF組/CON組和PB2組/HF組進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示。HF組/CON組總共鑒定出436 個(gè)差異基因,差異統(tǒng)計(jì)火山圖表明,高脂膳食攝入導(dǎo)致其中204 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),232 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào);PB2組/HF組總共鑒定出176 個(gè)差異基因,PB2組攝入使得其中65 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),111 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。

        此外,對(duì)3 組中共表達(dá)的差異基因進(jìn)行篩選,共篩選出49 個(gè)基因,與CON組基因表達(dá)情況相比,高脂膳食攝入使得38 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),11 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào),PB2組攝入可以使其中1 個(gè)基因表達(dá)保持繼續(xù)下調(diào),顯著改善高脂膳食導(dǎo)致的其余48 個(gè)基因表達(dá)異常(P<0.05)。

        圖2 樣本間基因PCAFig. 2 Principal components analysis of genes between samples

        圖3 基因表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)火山圖Fig. 3 Volcano plot for the expression of differential genes

        2.5 差異共表達(dá)基因的富集分析

        對(duì)于PB2組/HF組鑒別出的176 個(gè)差異基因進(jìn)行了直接與鈣代謝相關(guān)的通路的篩選分析,發(fā)現(xiàn)主要涉及破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)-受體相互作用、細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)、細(xì)胞周期和鈣信號(hào)通路(表7),基因表達(dá)變化總體呈現(xiàn)PB2對(duì)破骨細(xì)胞活性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)并對(duì)膠原合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)。

        表7 骨代謝相關(guān)通路基因表達(dá)的影響Table 7 Changes in gene expression associated with bone metabolismrelated pathways

        為了從數(shù)量較多的潛在靶基因中篩選出有代表意義的基因進(jìn)行驗(yàn)證,本研究使用Goatools 0.6.5等軟件進(jìn)一步對(duì)49 個(gè)差異共表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析中前20的顯著性GO項(xiàng)結(jié)果表明,差異共表達(dá)基因歸屬于BP和CC兩個(gè)分支,其中包括機(jī)體免疫、機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞吞噬作用、細(xì)胞識(shí)別、補(bǔ)體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、大分子復(fù)合物的組成等(圖4A)。KEGG富集分析結(jié)果展示了主要調(diào)控通路,共有13 條通路顯著富集(P<0.05),分別為腎素分泌、唾液分泌、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G,cGMP-PKG)信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等(圖4B)。

        圖4 差異共表達(dá)基因富集分析Fig. 4 Enrichment analysis of differentially co-expressed genes

        此外,本研究根據(jù)顯著性富集通路對(duì)差異共表達(dá)基因進(jìn)行分析,篩選出5 個(gè)基因作為潛在調(diào)控基因(表8),分別為Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3基因,PB2組干預(yù)可以顯著下調(diào)高脂膳食小鼠Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因的表達(dá)量,分別下調(diào)9.19、3.68、3.61 倍,上調(diào)Aldh1a3和Calml3基因表達(dá)量,分別上調(diào)2.06、3.29 倍(P<0.05)。

        表8 顯著性富集通路篩選的差異共表達(dá)基因Table 8 Differentially co-expressed genes selected by the significant KEGG pathways enriched

        2.6 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

        為了驗(yàn)證差異基因Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3的表達(dá)水平變化結(jié)果,進(jìn)行了qRT-PCR分析(圖5)。與RNA-Seq結(jié)果相比,盡管qRT-PCR測(cè)得基因表達(dá)水平結(jié)果略有不同,但其變化趨勢(shì)保持了一致性,表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

        圖5 qRT-PCR驗(yàn)證差異共表達(dá)基因的變化Fig. 5 qRT-PCR verification of changes in the expression of differentially co-expressed genes

        3 討 論

        近年來(lái),由高脂飲食引起的代謝疾病及其并發(fā)癥是世界主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[26]。已有研究表明,高脂膳食的攝入會(huì)顯著提升小鼠的血漿甘油三酸酯和膽固醇水平,導(dǎo)致血脂紊亂[27]。本研究結(jié)果與先前研究結(jié)果[28-29]一致,與CON組相比,高脂膳食會(huì)導(dǎo)致小鼠TC、LDL-C濃度和AI水平顯著增加(P<0.05)。此外,Bhandi等[25]研究表明,多酚的攝入可顯著降低高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度和AI水平,這與本研究中補(bǔ)充PB2有效降低了高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度、AI水平的結(jié)果相似。長(zhǎng)期攝入高脂膳食導(dǎo)致的血脂紊亂已被證明對(duì)骨骼健康的具有不利影響[30],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,小鼠飼喂高脂膳食會(huì)導(dǎo)致骨密度、骨形成水平降低,骨髓脂肪增加[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)PB2可以顯著增加高脂膳食小鼠的鈣凈吸收和鈣貯留量(P<0.05),顯著降低PTH質(zhì)量濃度(P<0.05),增加骨礦物與骨鈣含量。腸道鈣吸收量的降低是骨鈣含量減少與骨密度下降的重要因素之一[33]。當(dāng)腸道鈣吸收減少時(shí),PTH質(zhì)量濃度的上升可以促使骨鈣重吸收使骨骼中的鈣離子進(jìn)入血液,維持血液中Ca2+濃度的穩(wěn)定,長(zhǎng)期PTH水平增加會(huì)導(dǎo)致骨鈣流失。因此,本研究表明PB2促進(jìn)高脂膳食小鼠鈣吸收,抑制骨鈣的流失,干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常。

        高脂膳食導(dǎo)致骨吸收和形成之間的平衡改變,隨之引發(fā)骨礦化降低與骨質(zhì)量流失,加劇脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn),這種表觀的骨形態(tài)改變往往與骨基因表達(dá)有關(guān)[34]。本研究對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行PCA,其作為一種能夠有效降低數(shù)據(jù)維度的數(shù)學(xué)工具,能夠?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與樣本之間的關(guān)系可視化[35],對(duì)RNA-Seq結(jié)果的PCA能夠?qū)B2組從HF組中有效分離出來(lái),前2 個(gè)成分(PC1和PC2)分別占比96.78%和2.29%。同時(shí)使用FC和t檢驗(yàn)結(jié)果的火山圖能夠有效減少統(tǒng)計(jì)中的系統(tǒng)誤差[36]?;鹕綀D結(jié)果顯示PB2組/HF組總共鑒定出176 個(gè)差異基因,其中65 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),111 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),分別參與了破骨細(xì)胞分化、ECM-受體相互作用、CAMs、細(xì)胞周期和鈣信號(hào)通路等鈣代謝相關(guān)通路。已有研究表明,ECM大分子以廣泛的膠原家族為代表,參與骨細(xì)胞和骨組織穩(wěn)態(tài)的形成[37];細(xì)胞黏附分子是免疫球蛋白超家族成員,能夠在成骨細(xì)胞成熟過(guò)程中表達(dá),促進(jìn)骨骼發(fā)育[38]。因此,本研究表明PB2能夠有效調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與鈣代謝通路,從而干預(yù)鈣代謝異常。

        本研究進(jìn)一步對(duì)HF組/CON組和PB2組/HF組所涉及的差異基因進(jìn)行分析,共篩選出49 個(gè)有效的差異基因,富集分析結(jié)果表明,它們歸屬于機(jī)體免疫、細(xì)胞吞噬識(shí)別作用、補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑等功能,涉及腎素分泌、腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等信號(hào)通路。機(jī)體的血脂紊亂狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生,進(jìn)而介導(dǎo)相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[39-40]。由破骨細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞的機(jī)體自發(fā)免疫反應(yīng)已被證實(shí)會(huì)促進(jìn)骨分解代謝,導(dǎo)致骨質(zhì)溶解直至骨折的過(guò)程[41]。在炎癥消退期間的細(xì)胞凋亡過(guò)程中,引發(fā)巨噬細(xì)胞或其他吞噬細(xì)胞的識(shí)別和清除,對(duì)于恢復(fù)正常組織結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[42]。此外,補(bǔ)體分子作為一類參與免疫效應(yīng)的大分子,其中一條由抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合C1q啟動(dòng)補(bǔ)體激活的途徑稱為補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典激活途徑。目前,已有研究表明,補(bǔ)體C1q能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt(wingless/integrated)信號(hào)通路,促進(jìn)破骨細(xì)胞融合但不影響成骨細(xì)胞的分化,從而在骨重塑中發(fā)揮重要作用[43]。因此,本研究表明PB2可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞功能干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常。

        成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)受到相關(guān)代謝通路的調(diào)控,腎素屬于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(reninangiotensin-aldosterone system,RAAS),RAAS可在骨組織中刺激破骨細(xì)胞形成和抑制成骨細(xì)胞活性,從而誘導(dǎo)骨質(zhì)流失,引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[44]。成骨細(xì)胞中已被報(bào)道存在β-腎上腺素能受體,其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)抑制骨形成并觸發(fā)核因子κB受體活化因子配體(receptor ctivator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收[45]。Nevola等[46]研究報(bào)道了β-受體阻滯劑能夠使使用者的骨折風(fēng)險(xiǎn)降低、骨礦物密度增加。鈣信號(hào)通路可調(diào)控RANKL-核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)的受體激活劑,參與Ca2+代謝,還可通過(guò)CALM基因間接調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路。MAPK通路是參與誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)骨形成的中心信號(hào)通路之一,MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號(hào)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞基因表達(dá),而抑制MAPK信號(hào)可中間阻斷分化[47]。此外,cAMP和cGMP-PKG信號(hào)通路在骨代謝調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要作用,已有研究報(bào)道,PTH通過(guò)cAMP信號(hào)通路的介導(dǎo),促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的形成,從而對(duì)成骨細(xì)胞骨形成功能調(diào)節(jié)[47-48]。Boguslawski等[49]研究也表明cAMP信號(hào)通路在PTH信號(hào)傳導(dǎo)和骨鈣素表達(dá)調(diào)節(jié)中具有重要作用,而骨鈣素被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)。cGMP-PKG信號(hào)通路的激活也已被報(bào)道參與調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化,在骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[50]。

        目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)多酚作為一種常見(jiàn)的天然活性物質(zhì)可影響骨代謝相關(guān)基因表達(dá),如李子中的多酚類物質(zhì)可上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因(Bmp2和Runx2等)表達(dá),而Runx2基因表達(dá)量的上升和PPARγ基因表達(dá)量的下降有助于骨髓細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,提高骨礦物密度和和骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)[51-53]。本研究報(bào)道了膳食補(bǔ)充PB2對(duì)高脂膳食小鼠骨基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)PB2可調(diào)控高脂膳食小鼠股骨中Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3等基因的表達(dá)。此外,本研究發(fā)現(xiàn)PB2可上調(diào)Calml3和Aldhla3基因表達(dá),Calml3和Aldhla3基因主要參與cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路。最近的研究表明在cGMP-PKG信號(hào)通路中,Calml3基因表達(dá)的上調(diào)可以激活肌球蛋白輕鏈基因表達(dá),增加肌球蛋白分泌量并間接促進(jìn)平滑肌舒張,而肌球蛋白的表達(dá)可影響破骨細(xì)胞的形態(tài)和骨吸收活性[54]。此外,Aldhla3基因表達(dá)量增加,可能通過(guò)參與cAMP信號(hào)通路上調(diào)鈣調(diào)蛋白基因表達(dá)和調(diào)控PTH的分解代謝活動(dòng)[55-56],從而激活鈣信號(hào)通路,調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成。

        本研究還發(fā)現(xiàn)PB2可顯著下調(diào)高脂膳食小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達(dá),其主要參與腎素分泌、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)和cAMP信號(hào)通路。特別是Cdkn2a基因?qū)儆诩?xì)胞周期抑制基因,其與p16蛋白結(jié)合的基因產(chǎn)物p16INK4A可阻斷CyclinD1與CDK4/6結(jié)合,抑制CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物對(duì)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤Rb基因磷酸化,從而參與調(diào)控p53信號(hào)通路,阻斷細(xì)胞周期,使其停止于G1或S期,促使膠質(zhì)細(xì)胞處于周期阻滯狀態(tài)[57],影響骨髓間內(nèi)的成骨細(xì)胞的功能[58],可介導(dǎo)成骨細(xì)胞表觀遺傳發(fā)生變化,抑制其分化和功能[59]。同時(shí),Cdkn2a基因作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,其過(guò)量表達(dá)會(huì)以甲狀旁腺相關(guān)蛋白或RANKL介導(dǎo)的方式刺激破骨細(xì)胞生成和骨吸收[60-61],從而改變正常的骨重塑進(jìn)程,導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)展[62]。Fcgr4基因可調(diào)控激活Fcγ受體,促使組織細(xì)胞釋放活性氧,導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和損傷,而炎癥的發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng),從而導(dǎo)致骨流失[63-64]。此外,Adrb1基因下調(diào)已被發(fā)現(xiàn)可抑制β1-腎上腺素能受體表達(dá)[65]。使用腎素抑制劑可以阻滯RAAS,降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率[66],這可能是成骨細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)被抑制,從而導(dǎo)致動(dòng)物模型中的骨礦物密度增加[67]。因此,本研究發(fā)現(xiàn)Calml3和Aldhla3基因表達(dá)上調(diào)及Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4等基因表達(dá)下調(diào)可能與抑制破骨細(xì)胞活性和促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。

        綜上,本研究表明PB2作為天然原花青素中含量豐富的低聚物,能夠干預(yù)高脂膳食小鼠鈣代謝異常,并下調(diào)小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達(dá),上調(diào)Aldh1a3和Calml3基因表達(dá),參與調(diào)控股骨腎素分泌、腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、cGMP-PKG、Ca2+、cAMP信號(hào)通路等通路。本研究通過(guò)基因表達(dá)譜的變化分析了PB2干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常的可能機(jī)制,為其作為干預(yù)骨質(zhì)疏松的功能因子的開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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