張方方，肖 瀛，楊昌銘，吳其國，周一鳴，周小理

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會關(guān)懷學(xué)院，上海 201415）

高脂膳食是指脂質(zhì)攝入量占總攝入能量30%以上的飲食模式，已被認(rèn)為是導(dǎo)致機體血脂紊亂和氧化應(yīng)激發(fā)生的重要原因[1-2]，進而誘發(fā)肥胖、糖尿病等代謝疾病，嚴(yán)重影響正常生活和健康[3]。血脂紊亂和氧化應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生會介導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能受損，抑制骨形成并促進骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[4-5]。骨骼的幾何形狀和微結(jié)構(gòu)以及骨重塑過程主要受基因表達(dá)控制，外界攝入的營養(yǎng)物質(zhì)可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)代謝途徑的蛋白表達(dá)[6]。Cao Xiangchang等[7]研究表明，高脂膳食會增加大鼠模型的骨質(zhì)流失和骨骼微結(jié)構(gòu)改變程度，抑制成骨細(xì)胞分化和凋亡，同時增加破骨細(xì)胞的數(shù)量，并降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)水平。此外，高脂膳食已被證實可造成小鼠基因表達(dá)的變化，導(dǎo)致各種脂質(zhì)代謝過程和胰島素信號傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)編碼RNA異常表達(dá)[8]。

原花青素是由黃酮類化合物聚合而成的次生代謝產(chǎn)物[9]，常見于各種植物的花、堅果、果實、樹皮和種子中[10-11]，已被發(fā)現(xiàn)具有強抗氧化、抗菌、抗炎癥及抗糖尿病等多種促健康活性[12-14]。Tenkumo等[15]研究表明，富含原花青素的葡萄籽提取物具有防止骨代謝失衡和促進骨愈合、改善骨骼健康的作用。盡管原花青素作為一種天然功能因子其活性研究是食品營養(yǎng)與健康領(lǐng)域的熱點之一，然而其對高脂膳食導(dǎo)致骨骼組織基因表達(dá)的影響鮮見研究報道。

隨著基于高通量技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq）由于具備高分辨率、高靈敏度、成本低等優(yōu)勢，逐漸成為基因表達(dá)水平、關(guān)鍵基因的挖掘及調(diào)控機制研究的重要手段[16]。因此，本研究以高脂膳食誘導(dǎo)血脂代謝紊亂小鼠為模型，評價原花青素B2（proanthocyanidin B2，PB2）對高脂膳食性鈣代謝異常的干預(yù)作用，并通過RNA-Seq技術(shù)對小鼠股骨樣本進行真核有參轉(zhuǎn)錄組分析，篩選差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），同時進行相關(guān)通路的富集分析，為進一步分析PB2對高脂模型小鼠鈣代謝異常干預(yù)作用的分子機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡SPF級C57BL/6健康雄性小鼠27 只，體質(zhì)量（17.3±1.0）g，購自上海靈暢生物科技有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003；動物處理及飼養(yǎng)條件遵照動物福利的相關(guān)規(guī)定及《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質(zhì)量管理辦法》實施。

實驗飼料為低脂飼料、高脂飼料（Paigen飼料），具體飼料營養(yǎng)能量見表1，購于南通特洛菲飼料科技有限公司。實驗所用墊料、飼料均經(jīng)過輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，符合SPF級動物使用標(biāo)準(zhǔn)。

表1 飼料營養(yǎng)素成分Table 1 Nutrient composition of experimental diets

PB2（純度≥90%） 上海同田生物技術(shù)有限公司；甲醛、無水乙醇、無水乙醚、氯仿、異丙醇等（分析純）國藥集團化學(xué)試劑上海有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、鈣、甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）含量測定試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；TRIzol裂解液美國Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TruseqTM RNA sample prep Kit、HiSeq X Reagent Kits、NovaSeq Reagent Kits試劑盒 美國Illumina公司；QuantiFluor?dsDNA System-核酸提取試劑盒 普洛麥格生物技術(shù)有限公司；Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒 美國Beckman公司；Oligo（dT）美國Thermo Fisher公司；末端修復(fù)混合液 美國Enzymatics公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PURELAB Classic型超純水機 威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司；MDF-1156型低溫冰箱 日本三洋機電有限公司；XW-80型混合器 江蘇海門其林貝爾儀器有限公司；K280R型高速冷凍離心機 英國森特恩公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；磁力架 美國英杰生命技術(shù)有限公司；E6150型Quantus? Fluorometer生物庫 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；NanoDrop2000型超微量紫外分光光度計 美國Thermo Fisher公司；qTOWER 2.2定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀德國耶拿分析儀器股份公司；2100型生物分析儀 美國Agilent公司；NovaSeq 6000高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

6 周齡小鼠同室分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，所有小鼠在實驗前需要經(jīng)過1 周的環(huán)境適應(yīng)期，飼喂AIN93飼料，保持12 h明暗交替光照，溫度20～24 ℃、相對濕度50%～65%，小鼠可自由攝食和飲水（去離子水）。

小鼠隨機分3 組，每組9 只，對照組（CON組）飼喂低脂飼料、高脂膳食組（HF組）飼喂Paigen飼料、原花青素組（PB2組）飼喂添加0.2%（以飼料質(zhì)量計）PB2的Paigen飼料。本研究采用高脂膳食誘導(dǎo)血脂代謝紊亂模型[17-18]，PB2干預(yù)劑量根據(jù)前期研究[19]確定。所有小鼠自由攝食和飲水，持續(xù)飼喂8 周，每天觀察小鼠狀態(tài)，每周記錄一次小鼠體質(zhì)量及其食物攝入量。

1.3.2 血漿、股骨、尿液和糞便樣品采集

實驗結(jié)束前1 周，每組取9 只小鼠開展代謝平衡實驗，分別放入代謝籠中，適應(yīng)3 d后，持續(xù)收集尿液和糞便3 d，記錄飼料消耗情況及糞便量和尿液量。

實驗第8周末，小鼠斷食不斷水12 h，使用無水乙醚麻醉并稱量體質(zhì)量，通過摘取眼球取血。血液收集于含有1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%肝素鈉的離心管中，冰浴10 min后于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，取上清液于1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存，待測。

眼球取血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出完整左股骨，轉(zhuǎn)入裝有5 mL RNAlater試劑離心管中，于-40 ℃保存待提取RNA，右股骨取出后于-20 ℃保存用于骨礦物含量測定。

1.3.3 骨礦物含量的測定

參考曹靜祥[20]的方法稍加修改，股骨經(jīng)清洗后烘干至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量，每份股骨樣品放入一支瓷舟內(nèi)，并將瓷舟并排碼放在一片白色瓷磚上，疊放在馬弗爐中，以200 ℃為起始溫度，間隔100 ℃分段升溫至500 ℃灰化，并在爐溫降至100 ℃以下且灰分恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。

1.3.4 血脂水平和鈣吸收能力相關(guān)指標(biāo)的測定

血漿樣品于冰上解凍，股骨在室溫下解凍至室溫。按照試劑盒說明書相關(guān)操作進行血漿血脂指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C）、鈣濃度、PTH質(zhì)量濃度和股骨鈣含量測定。

采用代謝平衡法評價小鼠鈣吸收能力。對采集飼料和糞便使用HNO3和HClO4（4∶1，V/V）進行消化處理，用鈣含量檢測試劑盒測定樣品中的鈣含量，依據(jù)公式（1）～（3）分別計算動脈硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）、鈣凈吸收量和鈣貯留量。

式中：cTC為TC濃度/（mmol/L）；cHDL-C為HDL-C濃度/（mmol/L）。

1.3.5 mRNA測序

采用TRIzol法從股骨組織樣品（股骨頭近端）提取總RNA，同組每3 個樣品等量合并為一份樣本，具體流程如下。取定量股骨加入液氮，研磨后裝入預(yù)冷的加有1 mL TRIzol的離心管中，充分振蕩，裂解5 min；隨后于4 ℃、13 000×g條件下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移入新離心管中，加入200 μL預(yù)冷的氯仿，充分振蕩，靜置5 min；同條件離心15 min后吸取上清液轉(zhuǎn)移入新離心管中，加入與上清液體積相同的預(yù)冷異丙醇，靜置10 min；同條件離心10 min后吸去上清液，加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，吹吸混勻充分；同條件離心5 min后吸去上清液，再次離心數(shù)秒，吸除殘液，靜置3～5 min晾干；加入20～50 μL滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% DEPC溶液溶解。

利用NanoDrop2000檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整情況，使用2100型生物分析儀測定RNA完整值，并使用帶Oligo（dT）的磁珠與ployA進行配對，分離出mRNA。在mRNA樣品中加入碎片緩沖液，將其打斷為300 bp左右的片段，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機引物，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成穩(wěn)定的雙鏈cDNA。隨后加入End Repair Mix將其補成平末端，在3’末端加上一個A堿基，用于連接Y字形的接頭。

純化產(chǎn)物并進行片段分選，對分選片段進行PCR擴增，純化并構(gòu)建文庫。利用QuantiFluor?dsDNA System定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機，在cBot cluster generator上進行橋式PCR擴增，生成clusters，隨后進行Illumina NovaSeq6000上機測序。

1.3.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRTPCR）能夠驗證RNA測序結(jié)果。提取總RNA后將其轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Taq聚合酶和EvaGreen dye熒光染料，以稀釋后的cDNA為模板擴增靶基因，引物序列見表2。通過溶解度曲線評估PCR產(chǎn)物的特異性，所有qRT-PCR數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCt相對定量法[21]進行分析，并歸一化為β-actin基因的相對表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.4.1 生化指標(biāo)數(shù)據(jù)分析

小鼠生理生化指標(biāo)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0軟件通過Duncan’s法進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4.2 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

使用SeqPrep和Sickle軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾，并對質(zhì)量修剪前后的序列進行數(shù)據(jù)量統(tǒng)計，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)以保證后續(xù)分析順利進行。

1.4.3 基因表達(dá)量分析

使用RSEM軟件對待分析數(shù)據(jù)計算基因表達(dá)情況，揭示基因功能和調(diào)控情況。表達(dá)定量的結(jié)果以每百萬讀長中來自于某基因每千堿基長度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物數(shù)（transcripts per kilobase million，Tpm）為單位，對Tpm均一化使不同樣本中的總表達(dá)量一致。

1.4.4 基因表達(dá)差異分析

使用DESeq2軟件對CON、HF組和PB2組進行基因表達(dá)差異分析，鑒定出DEGs，并篩選差異共表達(dá)基因，用于后續(xù)研究。

篩選條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05、|log2FC|≥1（FC為變化倍數(shù)（fold change）。

1.4.5 差異基因GO富集分析

使用Goatools軟件和基因本體論（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/）進行Fisher精確檢驗，按照參與功能對基因進行分類，總共分為生物進程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。對差異基因進行GO功能顯著性富集分析，可以說明差異基因的功能富集情況，闡明樣本間DEG在功能水平的異同。為控制計算的假陽性率，使用Bonferroni多重檢驗方法對P值進行校正，當(dāng)經(jīng)過校正的P≤0.05時，則說明此GO功能存在顯著富集情況。

1.4.6 差異基因通路富集分析

使用KOBAS軟件基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫使用Fisher精確檢驗進行通路富集分析。為控制計算假陽性率，采用BY（FDR）方法矯正P值，矯正P≤0.05時說明此通路為DEGs中顯著富集的KEGG通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量及血漿脂質(zhì)水平的變化

如表3所示，各組小鼠在實驗期間體質(zhì)量增加，與CON組相比，其他兩組小鼠體質(zhì)量降低顯著，但PB2組小鼠體質(zhì)量顯著高于HF組（P＜0.05）。HF組小鼠血漿TC、LDL-C濃度和AI顯著高于CON組（P＜0.05），PB2組小鼠的上述指標(biāo)與HF組顯著降低（P＜0.05）。此外，PB2組小鼠的TG濃度顯著低于其他兩組小鼠（P＜0.05）。長期攝入高脂膳食可使體內(nèi)游離脂肪酸釋放進入機體循環(huán)系統(tǒng)[22]，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，血漿TC水平顯著升高，血漿脂蛋白組成向LDL-C轉(zhuǎn)變，從而增加動脈粥樣硬化風(fēng)險[23]。已有研究表明，原花青素具有調(diào)節(jié)小鼠脂質(zhì)代謝的能力[24]，本研究結(jié)果也表明PB2可以調(diào)節(jié)高脂膳食介導(dǎo)的脂代謝異常，降低發(fā)生動脈粥樣硬化的風(fēng)險。

表3 PB2對小鼠體質(zhì)量和血漿脂質(zhì)水平的影響Table 3 Effect of procyanidin B2 on body mass and plasma lipid levels in mice

2.2 鈣吸收、鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)與骨礦物含量的變化

鈣代謝平衡實驗結(jié)果如表4所示，與CON組相比，高脂膳食小鼠（HF組）鈣攝入量降低，糞鈣排泄量和尿鈣量增加（P＞0.05），鈣凈吸收量和鈣貯留量顯著降低（P＜0.05）。與HF組相比，PB2組鈣凈吸收和鈣貯留量顯著增加（P＜0.05），鈣凈吸收量與鈣貯留量有向CON組水平恢復(fù)的趨勢。

表4 PB2對小鼠鈣吸收的影響Table 4 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium absorption in mice

PTH是細(xì)胞外鈣和磷的重要調(diào)節(jié)因子，也是機體的血鈣濃度維持劑，能夠刺激骨細(xì)胞對骨的重吸收[25]。如圖1所示，血漿鈣濃度在3 組樣本間無顯著變化（P＞0.05），與CON組相比，HF組的PTH質(zhì)量濃度高度顯著提高（P＜0.05），與HF組相比，PB2干預(yù)后可以顯著降低高脂膳食小鼠PTH質(zhì)量濃度（P＜0.05），部分恢復(fù)到CON組水平。如表5所示，HF組骨礦物含量和股骨鈣含量與CON組相比顯著降低（P＜0.05），而PB2攝入可以使含量恢復(fù)至正常水平。因此，綜合鈣吸收、鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨礦物含量的結(jié)果可知，高脂膳食導(dǎo)致的鈣吸收降低可能造成小鼠鈣代謝負(fù)平衡，從而刺激PTH分泌，動員骨鈣入血，使骨骼中礦物質(zhì)含量降低，從而維持血鈣濃度穩(wěn)定的水平范圍，而PB2組可以干預(yù)由高脂膳食導(dǎo)致的鈣代謝異常。

圖1 PB2對小鼠鈣穩(wěn)態(tài)的影響Fig. 1 Effect of proanthocyanidin B2 on calcium homeostasis in mice

表5 PB2對小鼠骨礦物含量、股骨鈣含量的影響Table 5 Effect of proanthocyanidin B2 on bone mineral content and femoral calcium content in mice

2.3 RNA-seq測序數(shù)據(jù)評估

對3 組小鼠股骨提取的mRNA進行RNA-Seq，如表6所示，測序共獲得557 782 130 條序列，質(zhì)量過濾質(zhì)控后CON組測得181 626 736 條序列，HF組測得172 345 898 條序列，PB2組測得193 498 872 條序列。測序過濾后所得數(shù)據(jù)整體質(zhì)量較高，測序錯誤率均在0.012%左右，Q20（Phred數(shù)值大于20的堿基占總堿基的百分比）在98.29%以上，Q30（Phred數(shù)值大于30的堿基占總堿基的百分比）超過94.86%，GC相對含量（堿基G和C數(shù)目總和占總堿基數(shù)目的百分比）均在52.5%以上，表明堿基G與C含量大致相等。

表6 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 6 Statistics of sequencing data

2.4 差異基因表達(dá)分析

為了研究不同組中基因表達(dá)情況，本研究采用RSEM 1.2.31軟件，以Tpm為衡量表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)進行差異量表達(dá)分析。樣本間基因主成分分析（principal components analysis，PCA）結(jié)果如圖2所示，CON、HF、PB2組在貢獻度最高的PC1和PC2上離散明顯，PC1和PC2貢獻率分別為96.78%和2.29%。高脂膳食攝入使得HF組顯著遠(yuǎn)離CON組樣本，而PB2組能夠改善這一偏移情況，與HF組相比，PB2組距離CON組更為接近。

為了進一步研究不同組間存在差異的基因表達(dá)，本研究采用DESeq 2 1.10.1分析，選取|FC|≥2且P＜0.05的基因作為組間差異基因，分別對HF組/CON組和PB2組/HF組進行分析，結(jié)果如圖3所示。HF組/CON組總共鑒定出436 個差異基因，差異統(tǒng)計火山圖表明，高脂膳食攝入導(dǎo)致其中204 個基因表達(dá)顯著上調(diào)，232 個基因表達(dá)顯著下調(diào)；PB2組/HF組總共鑒定出176 個差異基因，PB2組攝入使得其中65 個基因表達(dá)顯著上調(diào)，111 個基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

此外，對3 組中共表達(dá)的差異基因進行篩選，共篩選出49 個基因，與CON組基因表達(dá)情況相比，高脂膳食攝入使得38 個基因表達(dá)顯著上調(diào)，11 個基因表達(dá)顯著下調(diào)，PB2組攝入可以使其中1 個基因表達(dá)保持繼續(xù)下調(diào)，顯著改善高脂膳食導(dǎo)致的其余48 個基因表達(dá)異常（P＜0.05）。

圖2 樣本間基因PCAFig. 2 Principal components analysis of genes between samples

圖3 基因表達(dá)量差異統(tǒng)計火山圖Fig. 3 Volcano plot for the expression of differential genes

2.5 差異共表達(dá)基因的富集分析

對于PB2組/HF組鑒別出的176 個差異基因進行了直接與鈣代謝相關(guān)的通路的篩選分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）-受體相互作用、細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）、細(xì)胞周期和鈣信號通路（表7），基因表達(dá)變化總體呈現(xiàn)PB2對破骨細(xì)胞活性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)并對膠原合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的趨勢。

表7 骨代謝相關(guān)通路基因表達(dá)的影響Table 7 Changes in gene expression associated with bone metabolismrelated pathways

為了從數(shù)量較多的潛在靶基因中篩選出有代表意義的基因進行驗證，本研究使用Goatools 0.6.5等軟件進一步對49 個差異共表達(dá)基因進行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析中前20的顯著性GO項結(jié)果表明，差異共表達(dá)基因歸屬于BP和CC兩個分支，其中包括機體免疫、機體應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞吞噬作用、細(xì)胞識別、補體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、大分子復(fù)合物的組成等（圖4A）。KEGG富集分析結(jié)果展示了主要調(diào)控通路，共有13 條通路顯著富集（P＜0.05），分別為腎素分泌、唾液分泌、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號傳導(dǎo)、鳥苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等（圖4B）。

圖4 差異共表達(dá)基因富集分析Fig. 4 Enrichment analysis of differentially co-expressed genes

此外，本研究根據(jù)顯著性富集通路對差異共表達(dá)基因進行分析，篩選出5 個基因作為潛在調(diào)控基因（表8），分別為Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3基因，PB2組干預(yù)可以顯著下調(diào)高脂膳食小鼠Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因的表達(dá)量，分別下調(diào)9.19、3.68、3.61 倍，上調(diào)Aldh1a3和Calml3基因表達(dá)量，分別上調(diào)2.06、3.29 倍（P＜0.05）。

表8 顯著性富集通路篩選的差異共表達(dá)基因Table 8 Differentially co-expressed genes selected by the significant KEGG pathways enriched

2.6 qRT-PCR驗證結(jié)果

為了驗證差異基因Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3的表達(dá)水平變化結(jié)果，進行了qRT-PCR分析（圖5）。與RNA-Seq結(jié)果相比，盡管qRT-PCR測得基因表達(dá)水平結(jié)果略有不同，但其變化趨勢保持了一致性，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

圖5 qRT-PCR驗證差異共表達(dá)基因的變化Fig. 5 qRT-PCR verification of changes in the expression of differentially co-expressed genes

3 討 論

近年來，由高脂飲食引起的代謝疾病及其并發(fā)癥是世界主要的公共衛(wèi)生問題之一[26]。已有研究表明，高脂膳食的攝入會顯著提升小鼠的血漿甘油三酸酯和膽固醇水平，導(dǎo)致血脂紊亂[27]。本研究結(jié)果與先前研究結(jié)果[28-29]一致，與CON組相比，高脂膳食會導(dǎo)致小鼠TC、LDL-C濃度和AI水平顯著增加（P＜0.05）。此外，Bhandi等[25]研究表明，多酚的攝入可顯著降低高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度和AI水平，這與本研究中補充PB2有效降低了高脂膳食小鼠TC、TG、LDL-C濃度、AI水平的結(jié)果相似。長期攝入高脂膳食導(dǎo)致的血脂紊亂已被證明對骨骼健康的具有不利影響[30]，動物實驗研究表明，小鼠飼喂高脂膳食會導(dǎo)致骨密度、骨形成水平降低，骨髓脂肪增加[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)PB2可以顯著增加高脂膳食小鼠的鈣凈吸收和鈣貯留量（P＜0.05），顯著降低PTH質(zhì)量濃度（P＜0.05），增加骨礦物與骨鈣含量。腸道鈣吸收量的降低是骨鈣含量減少與骨密度下降的重要因素之一[33]。當(dāng)腸道鈣吸收減少時，PTH質(zhì)量濃度的上升可以促使骨鈣重吸收使骨骼中的鈣離子進入血液，維持血液中Ca2＋濃度的穩(wěn)定，長期PTH水平增加會導(dǎo)致骨鈣流失。因此，本研究表明PB2促進高脂膳食小鼠鈣吸收，抑制骨鈣的流失，干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常。

高脂膳食導(dǎo)致骨吸收和形成之間的平衡改變，隨之引發(fā)骨礦化降低與骨質(zhì)量流失，加劇脆性骨折的風(fēng)險，這種表觀的骨形態(tài)改變往往與骨基因表達(dá)有關(guān)[34]。本研究對基因表達(dá)譜進行PCA，其作為一種能夠有效降低數(shù)據(jù)維度的數(shù)學(xué)工具，能夠?qū)嶒灁?shù)據(jù)與樣本之間的關(guān)系可視化[35]，對RNA-Seq結(jié)果的PCA能夠?qū)B2組從HF組中有效分離出來，前2 個成分（PC1和PC2）分別占比96.78%和2.29%。同時使用FC和t檢驗結(jié)果的火山圖能夠有效減少統(tǒng)計中的系統(tǒng)誤差[36]?；鹕綀D結(jié)果顯示PB2組/HF組總共鑒定出176 個差異基因，其中65 個基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），111 個基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），分別參與了破骨細(xì)胞分化、ECM-受體相互作用、CAMs、細(xì)胞周期和鈣信號通路等鈣代謝相關(guān)通路。已有研究表明，ECM大分子以廣泛的膠原家族為代表，參與骨細(xì)胞和骨組織穩(wěn)態(tài)的形成[37]；細(xì)胞黏附分子是免疫球蛋白超家族成員，能夠在成骨細(xì)胞成熟過程中表達(dá)，促進骨骼發(fā)育[38]。因此，本研究表明PB2能夠有效調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與鈣代謝通路，從而干預(yù)鈣代謝異常。

本研究進一步對HF組/CON組和PB2組/HF組所涉及的差異基因進行分析，共篩選出49 個有效的差異基因，富集分析結(jié)果表明，它們歸屬于機體免疫、細(xì)胞吞噬識別作用、補體經(jīng)典激活途徑等功能，涉及腎素分泌、腎上腺素能信號傳導(dǎo)、cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路等信號通路。機體的血脂紊亂狀態(tài)會導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而介導(dǎo)相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機制[39-40]。由破骨細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞的機體自發(fā)免疫反應(yīng)已被證實會促進骨分解代謝，導(dǎo)致骨質(zhì)溶解直至骨折的過程[41]。在炎癥消退期間的細(xì)胞凋亡過程中，引發(fā)巨噬細(xì)胞或其他吞噬細(xì)胞的識別和清除，對于恢復(fù)正常組織結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[42]。此外，補體分子作為一類參與免疫效應(yīng)的大分子，其中一條由抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合C1q啟動補體激活的途徑稱為補體系統(tǒng)的經(jīng)典激活途徑。目前，已有研究表明，補體C1q能夠通過調(diào)節(jié)Wnt（wingless/integrated）信號通路，促進破骨細(xì)胞融合但不影響成骨細(xì)胞的分化，從而在骨重塑中發(fā)揮重要作用[43]。因此，本研究表明PB2可能通過調(diào)控相關(guān)細(xì)胞功能干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常。

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)受到相關(guān)代謝通路的調(diào)控，腎素屬于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS），RAAS可在骨組織中刺激破骨細(xì)胞形成和抑制成骨細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)骨質(zhì)流失，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[44]。成骨細(xì)胞中已被報道存在β-腎上腺素能受體，其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)會抑制骨形成并觸發(fā)核因子κB受體活化因子配體（receptor ctivator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收[45]。Nevola等[46]研究報道了β-受體阻滯劑能夠使使用者的骨折風(fēng)險降低、骨礦物密度增加。鈣信號通路可調(diào)控RANKL-核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）的受體激活劑，參與Ca2＋代謝，還可通過CALM基因間接調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路。MAPK通路是參與誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)骨形成的中心信號通路之一，MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞基因表達(dá)，而抑制MAPK信號可中間阻斷分化[47]。此外，cAMP和cGMP-PKG信號通路在骨代謝調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要作用，已有研究報道，PTH通過cAMP信號通路的介導(dǎo)，促進成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的形成，從而對成骨細(xì)胞骨形成功能調(diào)節(jié)[47-48]。Boguslawski等[49]研究也表明cAMP信號通路在PTH信號傳導(dǎo)和骨鈣素表達(dá)調(diào)節(jié)中具有重要作用，而骨鈣素被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)。cGMP-PKG信號通路的激活也已被報道參與調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化，在骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[50]。

目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)多酚作為一種常見的天然活性物質(zhì)可影響骨代謝相關(guān)基因表達(dá)，如李子中的多酚類物質(zhì)可上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號傳導(dǎo)相關(guān)基因（Bmp2和Runx2等）表達(dá)，而Runx2基因表達(dá)量的上升和PPARγ基因表達(dá)量的下降有助于骨髓細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，提高骨礦物密度和和骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)[51-53]。本研究報道了膳食補充PB2對高脂膳食小鼠骨基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)PB2可調(diào)控高脂膳食小鼠股骨中Cdkn2a、Adrb1、Fcgr4、Aldh1a3和Calml3等基因的表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PB2可上調(diào)Calml3和Aldhla3基因表達(dá)，Calml3和Aldhla3基因主要參與cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路和鈣信號通路。最近的研究表明在cGMP-PKG信號通路中，Calml3基因表達(dá)的上調(diào)可以激活肌球蛋白輕鏈基因表達(dá)，增加肌球蛋白分泌量并間接促進平滑肌舒張，而肌球蛋白的表達(dá)可影響破骨細(xì)胞的形態(tài)和骨吸收活性[54]。此外，Aldhla3基因表達(dá)量增加，可能通過參與cAMP信號通路上調(diào)鈣調(diào)蛋白基因表達(dá)和調(diào)控PTH的分解代謝活動[55-56]，從而激活鈣信號通路，調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、促進成骨細(xì)胞形成。

本研究還發(fā)現(xiàn)PB2可顯著下調(diào)高脂膳食小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達(dá)，其主要參與腎素分泌、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)和cAMP信號通路。特別是Cdkn2a基因?qū)儆诩?xì)胞周期抑制基因，其與p16蛋白結(jié)合的基因產(chǎn)物p16INK4A可阻斷CyclinD1與CDK4/6結(jié)合，抑制CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物對成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤Rb基因磷酸化，從而參與調(diào)控p53信號通路，阻斷細(xì)胞周期，使其停止于G1或S期，促使膠質(zhì)細(xì)胞處于周期阻滯狀態(tài)[57]，影響骨髓間內(nèi)的成骨細(xì)胞的功能[58]，可介導(dǎo)成骨細(xì)胞表觀遺傳發(fā)生變化，抑制其分化和功能[59]。同時，Cdkn2a基因作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，其過量表達(dá)會以甲狀旁腺相關(guān)蛋白或RANKL介導(dǎo)的方式刺激破骨細(xì)胞生成和骨吸收[60-61]，從而改變正常的骨重塑進程，導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)展[62]。Fcgr4基因可調(diào)控激活Fcγ受體，促使組織細(xì)胞釋放活性氧，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和損傷，而炎癥的發(fā)生會誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性增強，從而導(dǎo)致骨流失[63-64]。此外，Adrb1基因下調(diào)已被發(fā)現(xiàn)可抑制β1-腎上腺素能受體表達(dá)[65]。使用腎素抑制劑可以阻滯RAAS，降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率[66]，這可能是成骨細(xì)胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)被抑制，從而導(dǎo)致動物模型中的骨礦物密度增加[67]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)Calml3和Aldhla3基因表達(dá)上調(diào)及Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4等基因表達(dá)下調(diào)可能與抑制破骨細(xì)胞活性和促進成骨細(xì)胞的活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上，本研究表明PB2作為天然原花青素中含量豐富的低聚物，能夠干預(yù)高脂膳食小鼠鈣代謝異常，并下調(diào)小鼠股骨Cdkn2a、Adrb1和Fcgr4基因表達(dá)，上調(diào)Aldh1a3和Calml3基因表達(dá)，參與調(diào)控股骨腎素分泌、腎上腺素能信號傳導(dǎo)、cGMP-PKG、Ca2＋、cAMP信號通路等通路。本研究通過基因表達(dá)譜的變化分析了PB2干預(yù)高脂膳食性鈣代謝異常的可能機制，為其作為干預(yù)骨質(zhì)疏松的功能因子的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。