楊洋 張健 林俊

腎移植是終末期腎病的最佳治療方法，與透析相比，腎移植能提高患者生存率，改善生活質(zhì)量[1]。隨著眾多新型免疫抑制劑的出現(xiàn)和使用，術后移植腎短期存活率明顯提高，但長期存活率并未顯著改善[2]。急性排斥反應（acute rejection，AR）和慢性排斥反應（chronic rejection，CR）仍是影響移植腎長期存活，導致移植腎失功最關鍵因素[2]。隨著移植術后時間的延長，移植腎排斥反應發(fā)生率不斷增加。免疫抑制不足會增加AR或CR導致的不可逆慢性移植腎失功的風險。然而，術后長期過量應用免疫抑制劑有腎毒性，增加心血管事件、感染和惡性疾病發(fā)生的風險，同樣影響腎移植受者長期的結局和移植腎存活率。因此，只有更好地對移植術后排斥反應進行早期診斷與監(jiān)測，才能做到個體化免疫抑制應用，減少移植腎過早丟失，提高受者的生存率。

供者來源性細胞游離DNA（donor-derived cellfree DNA，dd-cfDNA）是指器官移植術后受者循環(huán)體液中來源于凋亡或壞死供者細胞的游離DNA，其水平升高往往提示細胞更新和死亡的增加。因此在排斥反應受者體內(nèi)，dd-cfDNA含量會顯著升高。目前，病理學活組織檢查（活檢）是排斥反應診斷的“金標準”，但由于是有創(chuàng)檢查，有著并發(fā)癥的潛在危險和診斷的滯后性。而通過血清肌酐、尿蛋白、尿量等臨床指標反映腎功能同樣存在滯后性、靈敏度低、特異度不足等局限。隨著近年來對dd-cfDNA研究的不斷深入，dd-cfDNA因其具有無創(chuàng)性、靈敏度高和能夠?qū)χ委熜ЧM行實時評估等優(yōu)點受到廣泛關注，有望成為器官移植術后新型生物標志物而廣泛應用于臨床。本文將對目前dd-cfDNA在腎移植中的檢測方法，腎移植術后動態(tài)變化及其在移植物功能延遲恢復（delayed graft function，DGF）、不同類型排斥反應、BK病毒相關性腎?。˙K virus-associated nephropathy，BKVAN）和多種病理生理變化等方面的研究進展與應用進行探討，為dd-cfDNA未來在腎移植術后的研究與廣泛應用提供參考。

1 dd-cfDNA的檢測

目前，器官移植中dd-cfDNA的常用檢測方法包括實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、液滴數(shù)字PCR和二代測序等[3]。其原理是基于個體間單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）不同的高概率進行檢測評估，因此，在沒有供、受者基因分型的情況下也可完成dd-cfDNA含量的測定。通過分析SNP的差異，利用二代測序方法區(qū)分受者細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）和dd-cfDNA，計算dd-cfDNA含量占總cfDNA含量比例的方法稱為濃度法。而液滴數(shù)字PCR則可進行cfDNA總量的絕對定量[以每毫升血漿中DNA拷貝數(shù)（copies/mL）為單位]，隨后用于計算每毫升血漿中dd-cfDNA片段的絕對濃度稱為絕對定量法[4]。當前還沒有公認的用于器官移植特異性靶向SNP的標準化檢測方案，現(xiàn)有研究主要使用的幾種商品化的檢測方法包括AlloSure、Prospera、TRAC等[5]。最近在腎移植受者中進行的一項研究比較了AlloSure和Prospera兩種檢測方法，發(fā)現(xiàn)兩者在預測AR的效力上差異無統(tǒng)計學意義[3]。

2 dd-cfDNA在腎移植術后的動態(tài)變化

已有多項研究證實腎移植術后dd-cfDNA呈現(xiàn)時間依賴性的動態(tài)變化。Gielis等[6]發(fā)現(xiàn)在腎移植術后1 d時中位dd-cfDNA濃度為10.2%，范圍在2.6%～41.9%，隨后呈指數(shù)下降，術后10 d平均值降至0.46%。Shen等[7]比較了7例活體移植受者和14例死亡捐獻移植受者術后的dd-cfDNA動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)移植術后3 h平均dd-cfDNA濃度為20.69%，至16 h為5.22%，術后2 d為1.98%，到術后7 d為0.85%。在腎移植術后的初始階段和術后7 d內(nèi)，死亡捐獻移植受者中dd-cfDNA的濃度均顯著高于活體移植受者（初始階段45%比10%，術后7 d 1.11%比0.59%），這種差異反映了活體供者環(huán)境中腎臟缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）較輕，因此由IRI導致的dd-cfDNA產(chǎn)生也較少，表明IRI會增加血漿中dd-cfDNA水平，這也與活體移植結局優(yōu)于死亡捐獻移植相關。

DGF是腎移植術后早期常見的并發(fā)癥之一，術后預測DGF的發(fā)生有助于臨床早期鑒別診斷與治療。目前發(fā)現(xiàn)，雖然早期DGF受者與非DGF受者在dd-cfDNA水平上差異無統(tǒng)計學意義，但DGF受者的dd-cfDNA水平下降更為緩慢[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，捐獻前供者線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）可作為DGF發(fā)生的生物標志物，是DGF發(fā)生的獨立危險因素[8]。捐獻前供者血漿中mtDNA水平越高，腎移植術后受者發(fā)生DGF的可能性就越大，并且基于供者mtDNA的DGF預測模型曲線下面積（area under the curve，AUC）高達0.93，模型的靈敏度為1.00，特異度為0.78[8]。同時也有研究證實尿中mtDNA水平在DGF患者中也會顯著升高[9]。

而在腎移植術后的穩(wěn)定階段，dd-cfDNA水平增高可能與AR及引起急性腎損傷的其他原因相關，包括急性腎小管壞死、感染及原腎病復發(fā)等[10-13]。并且由于個體之間的變異，即使組織學正常的不同腎移植受者之間dd-cfDNA的基線水平也有差異。有研究顯示在腎移植術后2周，dd-cfDNA通常降低至基線水平，中位基線dd-cfDNA濃度為0.21%～0.46%[4,13]。而另一項研究基于腎移植術后97.5%穩(wěn)定患者的百分位數(shù)，設定dd-cfDNA濃度的異常臨界閾值為1.2%[14]。一項在303例穩(wěn)定腎移植受者中進行的dd-cfDNA時程前瞻性系統(tǒng)研究報道，腎移植術后5年內(nèi)dd-cfDNA濃度可從0.8%增加至2.1%[15]。由于dd-cfDNA存在這種時間依賴性變化，提示我們在腎移植術后不同的時間點應考慮設置不同的dd-cfDNA臨界閾值進行臨床應用。

3 dd-cfDNA在排斥反應中的研究進展與應用

3.1 dd-cfDNA可作為AR診斷的生物標志物

目前研究普遍認為，血漿中dd-cfDNA濃度為1%時可作為AR受者和穩(wěn)定受者的檢測臨界閾值。Sigdel等[16]使用Prospera檢測平臺回顧性分析了217例穿刺活檢匹配的dd-cfDNA樣本，其中38例有活動性排斥反應，該方法的AUC為0.87，顯著優(yōu)于估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）＜60 mL/（min·1.73 m2） 時 得到的AUC（0.74），診斷靈敏度、特異度、陽性預測值（positive predictive value，PPV）和陰性預測值（negative predictive value，NPV）分別為0.89、0.73、0.52和0.95。另一項前瞻性多中心研究在107例穿刺活檢樣本中使用AlloSure檢測平臺評價了dd-cfDNA對于腎移植術后排斥反應的診斷性能[11]。研究發(fā)現(xiàn)AR組患者血漿中位dd-cfDNA濃度為1.6%，高于穩(wěn)定組的0.3%（P＜0.001），以1% dd-cfDNA為閾值診斷AR時AUC為0.74，靈敏度為0.59，特異度為0.85，PPV為0.61，NPV為0.84，而血清肌酐診斷AR的AUC為0.54。值得注意的是，抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）的中位dd-cfDNA濃度為2.9%，而T細胞介導的排斥反應（T cell-mediated rejection，TCMR）的 Banff分級＞ⅠA級時為1.2%；ⅠA級TCMR的平均dd-cfDNA濃度為0.2%，與穩(wěn)定組相近，遠低于1%的檢測臨界閾值。因此dd-cfDNA對于AMR的診斷性能更好，AUC為0.87，靈敏度為0.81，特異度為0.83，PPV為0.44，NPV為0.96。

鑒于PPV的效能，當dd-cfDNA高于閾值時有可能導致不必要的穿刺活檢。但值得肯定的是，較高的NPV保證了dd-cfDNA低于診斷閾值時基本可以排除排斥反應，有助于臨床中避免由于血清肌酐升高而進行的陰性活檢，體現(xiàn)了dd-cfDNA作為生物標志物具有良好的病理穿刺活檢的指導價值。

3.2 不同排斥反應類型dd-cfDNA的差異

以上研究提示不同排斥反應類型的受者dd-cfDNA的水平并不相同。目前研究普遍認可AMR受者dd-cfDNA的水平顯著高于穩(wěn)定組受者，急性與慢性AMR的dd-cfDNA水平差異無統(tǒng)計學意義[12,17]；但是TCMR受者與穩(wěn)定組受者的dd-cfDNA差異并不明確，中位dd-cfDNA濃度在TCMR組（0.27%）與穩(wěn)定組（0.38%）之間差異無統(tǒng)計學意義[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)AMR、TCMR和AMR合并TCMR的ddcfDNA濃度分別為2.2%、2.7%、2.6%，三組間差異無統(tǒng)計學意義[16]。最新薈萃分析也證實在疑似移植腎功能不全的受者中，dd-cfDNA作為診斷AMR生物標志物的效能明顯優(yōu)于TCMR，同時dd-cfDNA對排斥反應（AMR、TCMR或AMR合并TCMR）鑒別的準確性尚有待進一步研究證實[19-20]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是不同排斥反應類型的損傷部位并不一致，AMR主要損傷微血管，其造成血管內(nèi)皮細胞凋亡后產(chǎn)生的dd-cfDNA可以直接進入血液循環(huán)。而TCMR，特別是Ⅰ級排斥反應主要炎癥損傷局限于腎小管間質(zhì)，腎小管上皮細胞凋亡后產(chǎn)生的dd-cfDNA入血需要跨過血管屏障。

因此結合目前研究結論，筆者認為dd-cfDNA在診斷TCMR的準確性低于AMR，但是并不代表完全否定dd-cfDNA在診斷TCMR中的意義。Stites等[21]評價了79例已診斷為臨界或ⅠA級TCMR受者的dd-cfDNA水平，與dd-cfDNA濃度＜0.5%的受者相比，dd-cfDNA濃度≥0.5%的受者eGFR下降的幅度更大，新生供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）產(chǎn)生率更高，隨訪活檢時持續(xù)排斥反應的可能性更高。因此，雖然dd-cfDNA濃度在TCMR中通常不會升高至1%閾值以上，但該研究的意義在于提出dd-cfDNA可作為Banff分級的補充，對活檢證實為臨界或ⅠA級TCMR的受者進行風險分層。因此即使dd-cfDNA在較低水平，也有助于預測排斥反應和輔助臨床決策。同時，對于排斥反應風險的分級和類型的準確診斷與鑒別需要結合其他多種臨床指標進行綜合判斷。例如，有研究發(fā)現(xiàn)dd-cfDNA結合DSA檢測相比于單獨DSA檢測，可以顯著提高診斷AMR的PPV和NPV[22]。也有學者基于dd-cfDNA、甲基化cfDNA、clusterin、CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）10、血清肌酐和總蛋白制定了量化Q評分體系，將對AR的診斷準確性提高至96%，并且在血清肌酐升高之前就能早期診斷AR[23]。

3.3 dd-cfDNA絕對定量法檢測的應用

以上研究結論均是基于二代測序檢測后ddcfDNA占總cfDNA含量比例的濃度法得出，然而這種方法的主要缺點在于dd-cfDNA含量受到受者cfDNA含量變化的影響。受者cfDNA主要來自于循環(huán)中凋亡的白細胞，感染、出血、藥物、運動或心理應激等因素均可導致受者cfDNA含量的變化，從而影響dd-cfDNA的水平[24]。因此，通過液滴數(shù)字PCR對dd-cfDNA進行絕對定量的絕對定量法可消除受者cfDNA濃度變異性的影響。研究發(fā)現(xiàn)絕對定量法可較好地區(qū)分TCMR、AMR以及臨界TCMR的受者，而絕對定量法在鑒別活檢證實的AR的診斷準確性（AUC=0.83）也優(yōu)于濃度法（AUC=0.73）[13]。所以筆者認為dd-cfDNA的絕對定量法檢測可能是急性AMR更特異的標志物，而濃度法檢測可為慢性活動性AMR和重度TCMR提供更多的診斷價值。因此，dd-cfDNA的絕對定量法和濃度法檢測的組合應用可提供更為全面的診斷信息。

3.4 AR治療與dd-cfDNA水平的動態(tài)變化

由于cfDNA半衰期較短，一般在0.5～2.0 h即可被機體清除，因此可以對dd-cfDNA進行實時監(jiān)測，從而反映受者治療后對藥物反應的實時狀態(tài)[4]。在一項包含5例AMR和23例TCMR受者的研究中發(fā)現(xiàn)，dd-cfDNA水平在糖皮質(zhì)激素靜脈滴注的3 d內(nèi)穩(wěn)定下降，而在治療后1、3和6個月后，dd-cfDNA的下降水平與eGFR的改善密切相關[25]。另一項關于兒童腎移植的研究表明，雖然治療后所有排斥反應類型的dd-cfDNA均會下降，但下降程度因排斥反應類型會有所差別；在AMR和混合排斥反應中，中位dd-cfDNA濃度仍高于1.0%，但在TCMR中可降至0.28%[26]。AR治療后血漿dd-cfDNA水平迅速下降，表明連續(xù)動態(tài)的dd-cfDNA監(jiān)測可作為排斥反應治療預后的評價指標應用于臨床，以預測移植腎的結局。但針對不同排斥反應類型應用不同的治療方案后，dd-cfDNA的動態(tài)變化規(guī)律仍需更多的研究來揭示。

3.5 dd-cfDNA檢測的適用范圍與時間點

dd-cfDNA檢測在腎移植中適用于大部分的受者，但是由于dd-cfDNA檢測原理的特殊性及局限性，目前暫不支持在如多器官聯(lián)合移植、未滿18歲、既往有骨髓移植、同卵雙胞胎移植的受者中使用。需要在移植腎穿刺活檢前獲得用于dd-cfDNA檢測的體液標本，因為穿刺活檢本身可以增加dd-cfDNA的水平。一項包括16例成人腎移植受者的研究表明，與活檢前水平相比，活檢后20 min和2 h時 dd-cfDNA水平均顯著增加[27]。而由于cfDNA的半衰期很短，在活檢后24～48 h，dd-cfDNA濃度可以恢復到活檢前的基線水平。

4 dd-cfDNA在其他腎損傷及移植類型中的研究進展與應用

4.1 dd-cfDNA與BKVAN

BKVAN是導致移植腎功能喪失的常見原因，目前基于尿液和血液的BK病毒DNA載量檢測對BKVAN的診斷價值有限。在10例活檢和配對dd-cfDNA樣本的BK病毒血癥或BKVAN患者的研究中發(fā)現(xiàn)，與BK病毒血癥患者相比，BKVAN患者的dd-cfDNA水平更高（0.58%比3.38%，P=0.001）；并且dd-cfDNA水平與BK病毒載量及BKVAN的組織病理有較好的相關性[28]。也有研究報道了BK病毒感染受者的尿液dd-cfDNA水平升高，并且dd-cfDNA相較于血漿BK病毒載量能更好地用于區(qū)分組織學證實或排除的BKVAN[10]。SV40染色為陰性時，對BKVAN和Ⅰ型TCMR之間的鑒別較為困難，因為兩者在組織病理學上存在相似性。有研究發(fā)現(xiàn)BKVAN患者尿液中dd-cfDNA的絕對值及濃度均顯著高于Ⅰ型TCMR受者（10.4 ng/mL比6.1 ng/mL，P＜0.001；68.4%比55.3%，P=0.013）；當尿液dd-cfDNA為7.81 ng/mL作為診斷閾值時，可以將已證實的BKVAN與Ⅰ型TCMR進行有效鑒別（AUC=0.848）[29]。

這些研究結果表明，血液及尿液dd-cfDNA有望作為一種可靠的標志物，聯(lián)合BK病毒DNA載量檢測共同對BKVAN及TCMR進行無創(chuàng)性的診斷，以指導免疫抑制在這兩類患者中應用的矛盾。但這仍需要一項前瞻性研究來確定dd-cfDNA是否可以在檢測到腎功能下降之前作為BKVAN診斷的早期標志物，以及BK病毒感染期間dd-cfDNA是否可以指導治療和改變移植物的結局。

4.2 dd-cfDNA與再次腎移植

再次腎移植受者的排斥反應和移植腎丟失的風險將顯著增加[30]，因此與單次腎移植受者相比，再次腎移植受者的基線dd-cfDNA水平對于在此類受者中使用該生物標志物至關重要。一項研究顯示雖然再次腎移植受者的基線dd-cfDNA濃度略高于單次腎移植受者（0.29%比 0.19%，P＜0.001），但兩組的濃度仍顯著低于1%的診斷閾值[5]。此外，再次腎移植受者中有排斥反應組dd-cfDNA濃度高于無排斥反應組（1.36%比 0.41%，P=0.009），但與單次腎移植排斥反應受者之間的差異無統(tǒng)計學意義。因此，dd-cfDNA也可作為再次腎移植受者的生物標志物應用于臨床診斷。

4.3 dd-cfDNA與多器官移植

目前在腎臟聯(lián)合其他多器官移植的受者中應用dd-cfDNA檢測的報道并不多，因為在多器官移植受者中應用dd-cfDNA最大的難點在于無法確定dd-cfDNA來源的器官。在對穩(wěn)定的胰腎聯(lián)合移植受者和心腎聯(lián)合移植受者進行的兩項前期研究中，dd-cfDNA的平均濃度分別為0.19%和0.52%，顯著低于1%的診斷閾值[31-32]。而由于肝臟的體積較大，即使在沒有移植物排斥反應的情況下，肝移植或者肝腎聯(lián)合移植受者的dd-cfDNA水平也很高[33]，未來還需更多的研究數(shù)據(jù)來指導dd-cfDNA在多器官移植受者中的應用。

4.4 dd-cfDNA與其他臨床事件

dd-cfDNA與移植物的損傷密切相關，而腎移植術后感染往往可造成移植腎損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，相比于穩(wěn)定組受者，存在泌尿系統(tǒng)感染或腎盂腎炎、局部或全身性細菌、真菌、病毒等感染受者的血漿ddcfDNA水平均會升高[34-35]。而在急性腎小管損傷受者中觀察到的dd-cfDNA升高的幅度則小得多[11,35]，且無法區(qū)分正常和慢性組織學異常，如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的毒性或間質(zhì)纖維化或腎小管萎縮等[36]；而尿液中dd-cfDNA水平與蛋白/肌酐比值（r=0.48，P＜0.05）和腎小球濾過指數(shù)（r=0.52，P＜0.05）相關，對急性移植腎損傷最為敏感，因此研究者指出尿液dd-cfDNA檢測可能是移植腎急性損傷敏感的生物標志物[36]。

也有研究關注dd-cfDNA與長期移植腎功能的相關性，Goh等[37]發(fā)現(xiàn)腎移植受者出院時dd-cfDNA水平與1年后血清肌酐水平呈正相關。同樣，Zhang等[38]也在移植術后12個月時發(fā)現(xiàn)早期dd-cfDNA水平與移植物功能障礙之間的關系，特別是移植術后早期dd-cfDNA水平出現(xiàn)多峰值變化與長期移植物功能障礙相關，這表明急性移植物損傷的反復發(fā)作可能損害長期移植腎功能。

Yang等[39]使用上文提到的量化Q評分體系研究了34例IgA腎病患者的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)該評分體系有助于區(qū)分健康患者和IgA腎病患者，同時ddcfDNA是最佳的預測因子。較多腎移植受者在術后面臨IgA腎病復發(fā)的問題，因此該研究提示dd-cfDNA也能作為有效的生物標志物，應用于腎移植術后IgA腎病乃至其他多種腎小球病變復發(fā)的監(jiān)測。

5 小 結

不可否認，dd-cfDNA作為一種無創(chuàng)、敏感，且可反復檢測的生物標志物在腎移植術后移植物損傷評估和監(jiān)測方面有著重要的臨床應用價值[40-47]。由于dd-cfDNA較高的靈敏度與NPV，其在排斥反應的早期識別與診斷方面具有優(yōu)勢，可避免過度活檢，讓診斷與治療的時間窗提前，可使得臨床醫(yī)師更有針對性地制定個體化免疫抑制劑方案并進行實時監(jiān)測調(diào)整，從而有可能改善腎移植受者的長期預后。然而也正是由于其較高的靈敏度導致多種移植后的病理生理改變均可影響dd-cfDNA的水平，使得dd-cfDNA目前廣泛應用于臨床還存在諸多局限性。因此進行臨床決策時，dd-cfDNA還需結合包括DSA、非人類白細胞抗原抗體、血清肌酐、尿蛋白等指標進行綜合分析判斷[48-50]。未來我國及世界范圍內(nèi)仍需要大量的前瞻性多中心隨機對照研究來確定最佳的dd-cfDNA檢測方法、不同疾病狀態(tài)的診斷閾值、不同免疫抑制劑的影響、與其他生物標志物聯(lián)合診斷的價值，以及對移植腎和受者長期結局的影響。