唐 亮 陳曉晴 譚偉強(qiáng) 程浣彤 綦向軍

杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種X連鎖隱性遺傳的進(jìn)行性、致死性神經(jīng)肌肉疾病，發(fā)病率為1/(3 500～5 000)活產(chǎn)男嬰[1]。該病由編碼抗肌萎縮蛋白的DMD基因突變所致，女性多為攜帶者，男性患兒通常在2～3歲隱匿起病， 15歲左右喪失行走能力，30歲前因呼吸或心力衰竭而死亡[2]。

由于DMD起病隱匿，其臨床診斷通常延遲。既往由于對DMD缺乏有效的治療方法，使得新生兒DMD篩查的意義難以體現(xiàn)。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使基因治療成為DMD最有希望的療法，目前已有多種基因治療藥物獲批臨床應(yīng)用或進(jìn)入臨床試驗(yàn)[3-5]。在新生兒期進(jìn)行DMD篩查，有利于早期診斷及個(gè)體化精準(zhǔn)治療，延緩疾病進(jìn)展，改善預(yù)后。同時(shí)，隨著我國生育政策的調(diào)整，早期篩查有利于遺傳咨詢和優(yōu)生優(yōu)育，減少DMD患兒的出生。DMD患兒血液中CK顯著升高是早期重要的生化改變[6]。1975年至2011年，全球10個(gè)DMD篩查項(xiàng)目共篩查了180多萬名新生兒，以濾紙干血片樣本CK值為篩查指標(biāo)，以基因檢測或肌肉活檢為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，確診344例DMD患兒，患病率約為1/5 000[7,8]。近年研究發(fā)現(xiàn)CK-MM 在新生兒DMD篩查中具有更高的特異度[6]。2019年12月美國FDA批準(zhǔn)了 Perkin Elmer公司的GSP血清CK-MM 試劑盒用于新生兒DMD篩查，目前國內(nèi)外已逐漸開展相關(guān)的研究工作[6,9-11]。

目前僅見1篇采用CK篩查新生兒DMD的系統(tǒng)評價(jià)/Meta分析[12]，尚無采用CK-MM篩查新生兒DMD的系統(tǒng)評價(jià)。本文檢索國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)評價(jià)以CK或CK-MM篩查新生兒DMD的準(zhǔn)確性，為完善篩查方法、提高篩查準(zhǔn)確性提供證據(jù)。

1 方法

1.1 PIROS的構(gòu)建 P：新生兒，I：血CK或CK-MM，R：基因檢測或肌肉病理，O：診斷參數(shù)，S：診斷準(zhǔn)確性研究。

1.2 檢索策略

1.2.1 檢索數(shù)據(jù)庫 Medline(PubMed)、Embase、Cochrane Library、Web of Science、Scopus、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫和維普中文期刊全文數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 檢索起止時(shí)間 檢索起始時(shí)間均為1975年1月1日，Medline(PubMed)檢索截止時(shí)間為2022 年 11 月5日，其他中英文數(shù)據(jù)庫檢索截止時(shí)間為2022年10月5日。

1.2.3 中英文不同數(shù)據(jù)庫檢索式及截屏 見本文附件1(http://www.cjebp.net/CN/10.3969/j.issn.1673-5501.2022.05.004)。

1.3 文獻(xiàn)篩選 NoteExpress軟件去除不同數(shù)據(jù)庫重復(fù)文獻(xiàn)。①初篩：由唐亮、譚偉強(qiáng)分別閱讀文題和摘要篩選，排除無摘要的論文、學(xué)位論文、會議摘要、傳統(tǒng)綜述(不包括系統(tǒng)評價(jià)/Meta分析)、病例報(bào)告、流行病學(xué)調(diào)查以及與選題明顯不相關(guān)的文獻(xiàn)。②復(fù)篩：由唐亮、譚偉強(qiáng)對經(jīng)過初篩后可能符合納入標(biāo)準(zhǔn)的、已公開發(fā)表的文獻(xiàn)閱讀全文篩選，排除無法獲取全文、全文非中文和英文、與主題不相關(guān)的文獻(xiàn)和不能提取診斷準(zhǔn)確性研究四格表數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)，重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)選擇數(shù)據(jù)最全、最近更新的文獻(xiàn)。③人工篩選：追溯相關(guān)系統(tǒng)評價(jià)/Meta分析及納入研究的參考文獻(xiàn)。

1.4 資料提取 由唐亮、譚偉強(qiáng)提取文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，提取內(nèi)容包括文題、發(fā)表年份、研究起止時(shí)間、國家、篩查方法(CK或CK-MM)及其截?cái)嘀?、篩查人群、篩查年齡、樣本量、診斷金標(biāo)準(zhǔn)、真陽性(TP)例數(shù)、假陽性(FP)例數(shù)、真陰性(TN)例數(shù)、假陰性(FN)例數(shù)。

1.5 文獻(xiàn)偏倚風(fēng)險(xiǎn)和臨床適用性評價(jià) 采用 QUADAS-2評價(jià)工具[13]，從4個(gè)領(lǐng)域的11個(gè)條目對納入文獻(xiàn)按“是”、“否”和“不確定”進(jìn)行評價(jià)。4個(gè)領(lǐng)域中≥3個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)(LR)和高風(fēng)險(xiǎn)(HR)分別為高質(zhì)量和低質(zhì)量，2個(gè)LR+1個(gè)HR即為低質(zhì)量，2個(gè)LR+2個(gè)不確定(UR)即為中等質(zhì)量，1個(gè)LR+3個(gè)UR或 4個(gè)UR即為低質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Stata 15.0和Meta-Disc 1.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。異質(zhì)性檢驗(yàn)采用I2檢驗(yàn)，I2>50%認(rèn)為異質(zhì)性較大，行閾值效應(yīng)及非閾值效應(yīng)檢測，若為閾值效應(yīng)引起異質(zhì)性，則繪制綜合受試者工作特征曲線(SROC)并計(jì)算AUC；若為非閾值效應(yīng)引起異質(zhì)性，則通過Meta回歸分析及亞組分析探尋潛在的異質(zhì)性來源，并采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并敏感度、特異度、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)、診斷比值比(DOR)、AUC和Q指數(shù)值?！?0篇文獻(xiàn)則通過Deeks漏斗圖進(jìn)行發(fā)表偏倚檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05 時(shí)，認(rèn)為存在顯著的發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果 圖1顯示，共檢索到229篇相關(guān)文獻(xiàn)，人工篩選到2篇文獻(xiàn)，共計(jì)231篇。剔除重復(fù)文獻(xiàn)115篇，并經(jīng)過閱讀文題和摘要排除89篇，27篇進(jìn)入全文閱讀，其中11篇被排除，最終納入16篇文獻(xiàn)。其中CK-MM篩查文獻(xiàn)5篇[14-18]，CK篩查文獻(xiàn)11篇[19-29]。

圖1 文獻(xiàn)篩查流程及結(jié)果

2.2 納入文獻(xiàn)一般特征

2.2.1 CK-MM 表1顯示，5篇文獻(xiàn)[14-18]發(fā)表于2020至2022年，中文和英文分別為2篇[17,18]和3篇[14-16]；中國4篇(大陸3篇[14,17,18]，臺灣1篇[15])，美國1篇[16]。3篇[14-16]篩查人群為新生兒，2篇[17,18]為新生男嬰；共篩查156 547例；CK-MM初篩截?cái)嘀稻?00 ng·mL-1，1篇[16]設(shè)置了不同年齡區(qū)間動態(tài)值，1篇[15]考慮了胎齡因素；診斷金標(biāo)準(zhǔn)均為基因檢測，真陽性15例，假陽性45例，假陰性0例，真陰性156 487例。

表1 DMD篩查納入文獻(xiàn)一般特征

2.2.2 CK 表1顯示，11篇[19-29]文獻(xiàn)發(fā)表于1979至2015年，中文和英文分別為1篇[19]和10篇[20-29]；英國[20,28]、美國[21,25]各2篇(其中1篇為與巴西合作的多中心研究)，加拿大[24]、法國[26]、德國[27]、比利時(shí)[22]、新西蘭[29]、塞浦路斯[23]、中國[19]各1篇。共篩查1 351 953例，以新生男嬰為主；CK截?cái)嘀?68 ～750 U·L-1；9篇文獻(xiàn)篩查年齡在生后1～8 d，1篇[19]在生后即刻采集臍血，1篇在生后4～6周[27]；診斷金標(biāo)準(zhǔn)為基因檢測或肌肉活檢；真陽性238例(單純基因檢測[19,21]6例、單純肌肉活檢[28,29]2例、基因檢測或肌肉活檢[20,22-27]230例)，假陽性1 257例，假陰性18例，真陰性1 350 440例。

2.3 文獻(xiàn)偏倚風(fēng)險(xiǎn)及臨床適用性評價(jià) 病例選擇(領(lǐng)域1)中12.5%的文獻(xiàn)UR，87.5%的文獻(xiàn)LR，臨床適用性高。待評價(jià)試驗(yàn)(領(lǐng)域2)中37.5%的文獻(xiàn)UR，62.5%的文獻(xiàn)LR，臨床適用性高。金標(biāo)準(zhǔn)(領(lǐng)域3)中，38%的文獻(xiàn)LR，62%的文獻(xiàn)UR，臨床適用性較高。病例流程和進(jìn)展(領(lǐng)域4)中，100%的文獻(xiàn)LR。評價(jià)表見本文附件2(http://www.cjebp.net/CN/10.3969/j.issn.1673-5501.2022.05.004)。

2.4 CK-MM篩查新生兒DMD的Meta分析 基于5項(xiàng)CK-MM篩查新生兒DMD研究[14-18]的敏感度對數(shù)與(1-特異度)對數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.158，P=0.800，提示不存在閾值效應(yīng)；Cochran’s Q=3.21，P=0.523 9，提示不存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，圖2A和B顯示，敏感度100%(95%CI:100%～100%)，I2=0，P=1.00；特異度100%(95%CI:100%～100%)，I2=93.92%，P=0.00；PLR 3 925(95%CI: 3 925～3 925)，I2=85.40%，P=0.00；NLR 0.00(95%CI:0.00～0.00)，I2=99.84%，P=0.00；DOR 23 094(95%CI:5 773～92 384)；圖2C顯示，AUC為0.925 2, Q指數(shù)為0.859 4。

圖2 CK-MM篩查DMD的診斷參數(shù)

2.5 CK篩查DMD的Meta分析 基于11項(xiàng)CK篩查DMD的研究[19-29]敏感度對數(shù)與(1-特異度)對數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)為 -0.187，P=0.581，提示不存在閾值效應(yīng)；Cochran’s Q=49.14，P=0.00，提示存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，圖3A和B顯示，敏感度97%(95%CI:88%～99%)，I2=45.7%，P=0.05；特異度100%(95%CI:100%～100%)，I2=99.88%，P=0.00；PLR 1 131(95%CI:370～3 456)，I2=98.9%，P=0.00；NLR 0.01(95%CI:0.00～0.19)，I2=44.8%，P=0.05；DOR 16 476 (95%CI:4 115～65 963)。圖3C顯示，AUC為0.995 4，Q指數(shù)為0.974 0。

圖3 CK篩查DMD的診斷參數(shù)

采用單變量Meta回歸方式從可能影響異質(zhì)性的因素(樣本量、確診的金標(biāo)準(zhǔn)、篩查人群、研究對象所處的地區(qū)、篩查時(shí)間、截?cái)嘀?中尋找潛在的異質(zhì)性來源，為避免漏掉重要影響因素，將檢驗(yàn)水準(zhǔn)α放寬至0.1，表2顯示，樣本量為異質(zhì)性的因素(P=0.027 4)，確診的金標(biāo)準(zhǔn)(P=0.058 5)及篩查人群(P=0.086 2)為可能的異質(zhì)性因素。

表2 CK篩查新生兒DMD研究Meta回歸分析結(jié)果

行亞組分析，表3顯示，在11項(xiàng)研究中，樣本量亞組的界點(diǎn)分別設(shè)為5萬和10萬時(shí)，其中的大樣本(>5萬和>10萬)的異質(zhì)性均高過小樣本(≤5萬和≤10萬)，且有明顯的異質(zhì)性；金標(biāo)準(zhǔn)為基因檢測異質(zhì)性為0，肌肉活檢可能存在異質(zhì)性，基因檢測或肌肉活檢混合存在異質(zhì)性；篩查人群為男嬰有明顯的異質(zhì)性。

表3 CK篩查新生兒DMD研究亞組分析結(jié)果

圖6顯示，采用Deeks漏斗圖對所納入研究的發(fā)表偏倚進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果提示發(fā)表偏倚可能性小(P=0.12)。

圖6 Deeks漏斗圖檢驗(yàn)

3 討論

DMD基因突變可引起肌肉發(fā)生炎癥和萎縮，導(dǎo)致CK從破壞的肌肉組織中滲漏入血液，使血清CK水平顯著升高，所以CK檢測一直被視為新生兒DMD篩查的重要指標(biāo)[30]。本文針對CK篩查新生兒DMD的診斷試驗(yàn)研究進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)及Meta分析，共納入 11篇文獻(xiàn)，發(fā)表偏倚小。Meta分析結(jié)果顯示，敏感度97%(95%CI：88%～99%)，特異度100%(95%CI：100%～100%)，具有良好的檢測效能。似然比能全面反映診斷試驗(yàn)的診斷價(jià)值，比敏感度和特異度更穩(wěn)定，且不受患病率的影響[31]。PLR>10或NLR<0.1表示準(zhǔn)確性高，本文Meta分析結(jié)果顯示，每個(gè)研究的PLR均>10，合并PLR為1 131(95%CI:370～3 456)，表明篩查結(jié)果陽性時(shí)為真陽性的概率大；合并NLR為0.01(95%CI:0.00～0.19)，表明試驗(yàn)結(jié)果陰性時(shí)為真陰性的概率大；逐篇分析11篇文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，9篇[20-27, 29]NLR<0.2，準(zhǔn)確性較高，樣本量最小的2篇[19, 28]NLR為0.25，準(zhǔn)確性一般。AUC越接近1.0，其診斷價(jià)值越高，本研究的AUC為0.995 4，Q指數(shù)為0.974 0，說明以CK為檢測指標(biāo)篩查新生兒DMD具有很高的準(zhǔn)確性。

盡管CK篩查新生兒DMD的診斷參數(shù)優(yōu)秀，但特異度和PLR均具有高異質(zhì)性，Meta回歸分析提示異質(zhì)性來源為樣本量，可能的異質(zhì)性還包括金標(biāo)準(zhǔn)及篩查人群。

亞組分析結(jié)果顯示，樣本量亞組的界點(diǎn)分別設(shè)為5萬和10萬，大樣本組的異質(zhì)性均高于小樣本組。有研究發(fā)現(xiàn)以I2為代表的“異質(zhì)性檢驗(yàn)”在方法學(xué)上可能存在缺陷，當(dāng)納入Meta分析的文獻(xiàn)數(shù)量和樣本量大幅增加時(shí)，I2值也穩(wěn)步增加，提示I2可能僅適用于小樣本量試驗(yàn)的異質(zhì)性檢驗(yàn)，當(dāng)樣本量和文獻(xiàn)數(shù)量大幅增加時(shí)不適用[32]。

亞組分析結(jié)果也顯示，金標(biāo)準(zhǔn)為可能的異質(zhì)性因素，金標(biāo)準(zhǔn)為基因檢測或肌肉活檢混合有明顯的異質(zhì)性，單純基因檢測沒有異質(zhì)性，提示同一研究應(yīng)采用同一金標(biāo)準(zhǔn)，并且診斷金標(biāo)準(zhǔn)并非固定不變，隨著對疾病認(rèn)識和診斷技術(shù)的進(jìn)步，基因檢測已逐漸替代有創(chuàng)的肌肉活檢，成為DMD診治指南中最新的金標(biāo)準(zhǔn)[33]。亞組分析結(jié)果還顯示，篩查人群為可能的異質(zhì)性因素，單純篩查男嬰組具有較高的異質(zhì)性，提示今后的篩查工作應(yīng)考慮開展普篩，既要確診男性患兒，還要篩查出女性攜帶者[34]。

CK截?cái)嘀档膭澐謱⒅苯佑绊懨舾卸群吞禺惗?，截?cái)嘀档脑O(shè)置要考慮患病率因素，對于DMD截?cái)嘀灯涂蓪?dǎo)致假陽性率較高，而選擇較高的截?cái)嘀祫t可能導(dǎo)致假陰性率高，出現(xiàn)漏檢。Mendell等[21]研究采用600 U·L-1、750 U·L-1的高截?cái)嘀?，也出現(xiàn)較高的假陽性率；而Moat等[20]研究設(shè)置較低的截?cái)嘀?250 U·L-1)，結(jié)果也出現(xiàn)了較高的假陰性率，提示CK檢測值與DMD之間的關(guān)系尚無明確標(biāo)準(zhǔn)。本文納入的11項(xiàng)研究中CK篩查新生兒DMD的截?cái)嘀捣秶?68～750 U·L-1，非常寬泛。應(yīng)通過權(quán)衡假陽性和假陰性造成的后果，選擇合適的截?cái)嘀?，并?yōu)化、完善篩查模型，提高篩查準(zhǔn)確度，以達(dá)到篩查新生兒DMD的臨床需要。

CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，其作為骨骼肌損傷的指標(biāo)更具有特異性[6]。本文納入的5篇[14-18]CK-MM篩查新生兒DMD的文獻(xiàn)中，金標(biāo)準(zhǔn)均為基因檢測，其中4篇[14-17]采用的是Perkin Elmer公司的GSP血清CK-MM 試劑盒，結(jié)果顯示沒有閾值效應(yīng)和非閾值效應(yīng)，合并敏感度和特異度均為100%，PLR為3 926>10，NLR為0.00<0.1，AUC為0.925 2, Q指數(shù)為0.859 4，提示CK-MM用于新生兒DMD篩查具有很高的準(zhǔn)確性。

5篇文獻(xiàn)均未報(bào)告假陰性，考慮研究起始時(shí)間為2019至2021年，而DMD通常2～3歲隱匿起病，可能隨訪時(shí)間尚不足。

本文的局限性: ①只納入中英文文獻(xiàn)；②各研究間樣本量差別大；③陰性檢測樣本缺乏足夠隨訪，導(dǎo)致研究的假陰性率可能被低估；④各研究間截?cái)嘀挡唤y(tǒng)一，部分未報(bào)告截?cái)帱c(diǎn)的選擇方法并說明其合理性；⑤未對篩查試驗(yàn)在臨床應(yīng)用后是否會改善臨床結(jié)局進(jìn)行評價(jià)；⑥未評估醫(yī)生和父母對“新生兒DMD篩查”的態(tài)度以及假陽性對家庭心理因素的影響。