李鴻博，馬 莉，黃耀華，康定旭，伍建榕，馬煥成＊，陳 詩＊

(1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224；2.云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點實驗室，西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224)

高山櫟(Quercusspp.)，高山常綠硬葉植物，形態(tài)分喬木和灌木型。高山櫟作為橫斷山脈亞高山區(qū)域的典型植被和重要生態(tài)資源，其垂直分布跨度為900～4800 m，多集中于2400～3600 m之間[1]，水平分布特征為集中型森林分布和離散型散點分布，遍布整個橫斷山脈，作為優(yōu)勢種與建群種，構(gòu)成了橫斷山脈亞高山地區(qū)特有的森林植被生態(tài)系統(tǒng)[2-4]。高山櫟表現(xiàn)出對干旱和寒冷環(huán)境的高度適應(yīng)性，對造林困難地段水土保持和生態(tài)恢復(fù)具有重要作用[5]。高山櫟作為薪炭林，具極強(qiáng)的萌蘗更新能力，是理想的能源供應(yīng)物質(zhì)[6]。

真菌在土壤等自然環(huán)境中分布廣泛，許多菌種可侵染植物根系并與其形成互惠共生的菌根。此外，近些年來研究發(fā)現(xiàn)暗色有隔真菌（DSE）是植物根系常見的內(nèi)生菌，部分可與植物根系共生[7]，也有一些屬于植物病原菌，侵染根系后可對植物生理代謝造成嚴(yán)重破壞[8]。因此，研究植物根系內(nèi)生真菌的組成與多樣性對進(jìn)一步了解宿主植物生態(tài)適應(yīng)性機(jī)制，以及篩選對植物生長發(fā)育有促進(jìn)作用的內(nèi)生真菌具有理論意義和實際應(yīng)用價值。櫟屬植物根系能夠與部分真菌形成外生菌根（ECM），形成后可提高土壤酶活，并為植物宿主提供水分、氮、磷等營養(yǎng)元素，增強(qiáng)宿主植物對干旱等逆境的抵抗力[9-10]。ECM在與宿主植物形成共生關(guān)系的過程中，與土壤中各種病原菌競爭生態(tài)位，并最終形成定殖。

我國西部滇、藏地區(qū)國家自然資源雖儲備豐富，但高原生態(tài)環(huán)境脆弱，對其如何保護(hù)與治理已成為近年來生態(tài)文明建設(shè)的重要課題。選擇高山櫟作為研究對象，是因其長期適應(yīng)高原寒、旱等惡劣生態(tài)環(huán)境，可以作為高原地區(qū)植被恢復(fù)的造林備選樹種。楊淑嬌等[11]發(fā)現(xiàn)高山櫟林下菌塘同時存在外生菌根（ECMF）和從枝菌根真菌（AMF）。宋富強(qiáng)等[12]對川西亞高山帶森林生態(tài)系統(tǒng)外生菌根的研究表明，該地高山櫟0～20 cm與20～40 cm土壤中外生菌根侵染率與海拔高度呈顯著正相關(guān)。目前，聚焦于高山櫟根系菌根和益生真菌的研究仍較少。本研究以該地區(qū)3種典型高山櫟根系為研究對象，通過對其根系內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段鑒定真菌，并對其多樣性進(jìn)行分析，以明確該地區(qū)高山櫟根系內(nèi)共生真菌的組成和分布區(qū)系，為闡明高山櫟的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)，同時為篩選有益根系內(nèi)生真菌提供活體菌種資源。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

橫斷山脈縱貫我國西南部，緯度從25° N延伸至29°40′ N，北起西藏昌都，南至云南邊境，總體呈北高南低趨勢，是我國西南方地區(qū)的現(xiàn)代冰川分布區(qū)。該區(qū)域在27°40′ N以北垂直分帶明顯，氣候變化分明，植被分布隨海拔上升出現(xiàn)顯著差異[13]。橫斷山脈亞高山帶林木一直以來雖受到較好保護(hù)，但其生態(tài)環(huán)境整體脆弱，高原生態(tài)系統(tǒng)不穩(wěn)定，且時刻面臨高山冰川消融等威脅，區(qū)域內(nèi)部分地區(qū)水土流失較為嚴(yán)重[14]。

1.2 樣品采集

于2020年7月、10月分別從橫斷山脈亞高山 地 區(qū)28°45′3″～30°59′35″N,97°40′25″～102°50′18″E間的不同海拔（2610～3480 m）地區(qū)陽坡地段高山櫟林下拉設(shè)10 m×10 m樣方，于樣方內(nèi)高山櫟（Q. semicarpifoliaSmith）、長穗高山櫟（Q. longispica(Hand.-Mazz.) A.Camus）及川滇高山櫟（Q. aquifolioidesRehd.et Wils.）根部0～40 cm土層沿主根采集側(cè)根至根尖，每種樹選取3棵（3株長穗高山櫟均編號GSL2）（表1）。根系樣品分兩部分，清理并分別標(biāo)記，一份用干燥儲藏管存于含冰袋的保溫箱帶回，-4 ℃保存；另一份放入FAA固定液（用時稀釋一倍）保存，備后續(xù)試驗。

表1 橫斷山脈亞高山高山櫟樣地概況Table 1 Brief information of Quercus sampling plots in Hengduan Mountains

1.3 試驗方法

1.3.1 高山櫟根系內(nèi)真菌侵染情況觀察 為觀察根系內(nèi)潛在的AMF、DSE或其他真菌等，取去除根尖的次生根系樣本，經(jīng)清水反復(fù)沖洗3～5次后剪成0.5 cm的小段。將組織小段分別放入10%KOH溶液中，90 ℃水浴1.5 h，取出重復(fù)涮洗，浸入3%乳酸溶液脫色10 min。再次涮洗，并加入0.05%苯胺藍(lán)溶液，90 ℃水浴2 h，重復(fù)涮洗脫色，至根系顏色半透明或透明，取脫色較好的根系制片觀察并記錄侵染狀況[15]。

1.3.2 共生真菌的分離與純化 流水沖洗根系樣本12 h后，取待用根系裁成0.5 cm小段。分別以70% 酒精和0.1%升汞溶液消毒10 s和1 min，以五點培養(yǎng)法置于PDA和MA平板上，倒置后于25 ℃培養(yǎng)7～14 d[16]。根系組織塊上長出真菌菌落后進(jìn)行真菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)和純化，并保存菌株，經(jīng)PDA和MA平板標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定。

1.3.3 共生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 蓋玻片滅菌后呈45°斜插入菌落邊緣，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，制片并在LEICA MD750顯微鏡下觀察形態(tài)。查閱相關(guān)真菌分類書籍與文獻(xiàn)[17-18]，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.4 共生真菌的分子生物學(xué)鑒定 利用改良的DNA快速提取法[19]，提取菌體基因組DNA。選用ITS1、ITS4[20]通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測真菌DNA。PCR反應(yīng)體系為50 μL(ddH2O 20 μL，TaqPCR Master Mix 25 μL，ITS1 1.5 μL，ITS4 1.5 μL，DNA 2 μL)。94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s?；厥誔CR產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)（Molecular Imager GEL Doc TM XR）檢測。將條帶清晰的產(chǎn)物送生物公司（TSINGKE昆明）進(jìn)行測序。

1.3.5 共生真菌多樣性數(shù)據(jù)分析 α多樣性是指以一種或幾種多樣性指數(shù)來測度和描述某一均質(zhì)群落或生境內(nèi)個體數(shù)在物種總數(shù)上的分配狀況[21]。本研究選取Shannon-Wiener、Simpson多樣性指數(shù)和Margalef 豐富度指數(shù)作為判斷所分離菌落的物種多樣性指標(biāo)，以豐富度和均勻度相互補(bǔ)充說明菌種多樣性。以上述3種高山櫟根系樣本作為各真菌種類生存的生境，分離真菌總數(shù)作為高山櫟根系內(nèi)可被分離的真菌總載量，各項指數(shù)數(shù)值越大，意味著該菌種的多樣性越豐富。采用EXCEL2003 Biodiv統(tǒng)計CFU(菌落形成單位)分離頻率等指標(biāo)。經(jīng)Chromas2.22和DNAMAN8軟件對目標(biāo)真菌種類的序列進(jìn)行峰圖查驗與序列拼接處理后，提交至NCBI利用BLAST多重對比，以相似度為97%為基準(zhǔn)確定屬種分類關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 高山櫟根系內(nèi)生菌侵染觀察

將染、脫色處理的根系制片后在顯微鏡下觀察形態(tài)，可見根細(xì)胞內(nèi)菌絲、微菌核以及暗色有隔真菌（DSE）等形態(tài)結(jié)構(gòu)，觀測到DSE在根系表皮部的侵入位點。菌絲直徑6.2～15.8 μm，微菌核直徑19.3～46.7 μm（圖1-A至1-I）。根據(jù)菌絲在高山櫟根系的侵染點和形態(tài)特征，初步判斷有2種以上DSE。另外，在高山櫟根皮層細(xì)胞內(nèi)觀察到大量疑似AM泡囊結(jié)構(gòu)（圖1-J、1-L），判斷其為高山櫟菌根結(jié)構(gòu)。該類結(jié)構(gòu)在3種高山櫟根皮層細(xì)胞中均可發(fā)現(xiàn)，但以長穗高山櫟居多，其他兩種高山櫟較少。

圖1 3種高山櫟根系中的真菌侵染結(jié)構(gòu)Fig.1 Fungal colonization and structures in roots cortex of Quercus spp.

2.2 高山櫟共生真菌的形態(tài)多樣性

顯微觀測發(fā)現(xiàn)3種高山櫟根皮層細(xì)胞中均存在DSE和AM等真菌結(jié)構(gòu)。對3種高山櫟根系內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)，共獲得519株真菌，從高山櫟、長穗高山櫟、川滇高山櫟的根系中分別分離得到174株、163株、182株，經(jīng)形態(tài)鑒定，共27種真菌。從種類數(shù)量上看，高山櫟根系內(nèi)生真菌具有明顯的形態(tài)多樣性[21]，而且在菌落形態(tài)、顏色、生長速度、表面分泌物、菌落質(zhì)地及產(chǎn)孢（表2）（圖2）等方面存在較大差異。

圖2 從高山櫟根系分離真菌的菌落及顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 The colonies and microscopic structures of fungi isolated from three speices of alpine Quercus

表2 從3種高山櫟根系中分離獲得的各真菌菌株的菌落特征Table 2 Morphology characteristics of fungal colonies isolated from three species of Quercus

2.3 高山櫟根系內(nèi)生真菌的分子鑒定

對各內(nèi)生真菌菌株的ITS區(qū)段序列擴(kuò)增獲得長度500 bp左右的序列。在NCBI的GenBank中比對分析表明，除GSL1-7(96.96%)和GSL3-1(95.75%)可鑒定至科和屬，其余菌株與GenBank中的同源菌株相似度均高于97%[22-23]，可鑒定至種水平。通過對獲得的各菌株ITS rRNA gene序列比對分析，共鑒定出17科20屬27種真菌。文獻(xiàn)記載表明包括4種DSE，2種有益菌或生防菌,以及部分病原菌(表3)。

表3 橫斷山脈高山櫟根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比對結(jié)果Table 3 Blasting comparison results for rDNA ITS sequences of root endophytic fungi from three species of Quercus in Hengduan Mountains

2.4 高山櫟根系定殖真菌物種多樣性指數(shù)

通過對3種高山櫟根系內(nèi)生真菌物種多樣性和豐度分析發(fā)現(xiàn)，其多樣性豐度表現(xiàn)為高山櫟＞長穗高山櫟＞川滇高山櫟。從真菌種類來看，Trichoderma tomentosum（綠色木霉）的分離頻率最高（7.13%），在3種高山櫟根系中均可分離到，其次為Fusarium acuminatum、Phoma herbarum(DSE) 和Trichocladium opacum。另3種DSE如Boeremiaexiguavar.exigua、Phialophora mustea、Paraboeremia putaminum分離頻率分別為3.47%、6.74%和5.20%；Pseudogymnoascus roseus的分離頻率為4.05%，有文獻(xiàn)報道該菌對植物生長有促進(jìn)作用。Mucor nederlandicus分離頻率最低（0.96%），僅分離自高山櫟根系。經(jīng)對3種高山櫟根系內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)Shannon指數(shù)明顯大于1，Simpson指數(shù)均接近于1，說明3種高山櫟根系內(nèi)生真菌物種多樣性較豐富，但3種高山櫟間根內(nèi)真菌多樣性無顯著差異（表4）。

表4 3種高山櫟根內(nèi)生真菌的α多樣性指數(shù)Table 4 α diversity indices of endophytic fungal species of three alpine species of Quercus

3 討論

對橫斷山脈亞高山帶3種高山櫟根系內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)共獲得519株真菌，鑒定出真菌17科20屬27種。根系染色結(jié)果表明，3種高山櫟根皮層內(nèi)均存在內(nèi)生真菌，可見包括菌絲、微菌核及疑似AMF的泡囊結(jié)構(gòu)。3種高山櫟根內(nèi)真菌α多樣性分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌物種多樣性較豐富，其中包含較多有益真菌或生防菌。

本研究分離鑒定出的27種真菌中，Ceratobasidiaceae科真菌（GSL1-7）為外生菌根菌[24]，其與NCBI中已知菌株序列相似度低于97%，說明該菌種為尚未被描述。Boeremia exiguavar.exigua、Phoma herbarum、Phialophora mustea及Paraboeremia putaminum為DSE。Pseudogymnoascus roseus、Trichocladium opacum、Thelonectria veuillotiana及Mucor nederlandicus曾在采自川、滇、藏等地的蟲草菌核中分離得到，其中P. roseus能夠促進(jìn)植物生長并抑制病害[25-26]。綠色木霉Trichoderma tomentosum為土壤習(xí)居菌，可用于植物病害生物防治[16,26]。

Plectania rhytidia和Ilyonectria crassa曾在2種西藏藥用植物根系中分離得到[27]，此次從高山櫟根系分離獲得，說明2者在橫斷山區(qū)分布廣泛，但其對宿主植物的作用尚不明確。Kehr[28]報道Pezicula cinnamomea可侵染美國紅櫟而造成嚴(yán)重?fù)p失。Kwa?na等[29]研究從洪水浸泡后的羅布櫟(Quercus robur)分離出Pezicula radicicola，故推測這兩種真菌對高山櫟具有潛在致病性。此外，Cladosporium cladosporioides、 Dactylonectria estremocensis、D. torresensis、Pestalotiopsis kenyana、Fusarium acuminatum、F. redolens、Thelonectria veuillotiana及Ilyonectria robusta等為潛在的病原菌[30-31]。近年來，不斷有研究報道，DSE是植物根的常見內(nèi)生菌[29]，且在促進(jìn)植物生長、改善植物礦質(zhì)營養(yǎng)、調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素平衡、增強(qiáng)植物耐重金屬離子和抗環(huán)境污染等方面意義重大[32-33]。DSE普遍存在于高山櫟根系內(nèi)，具有某種生理和生態(tài)功能，以提升高山櫟的抗逆適應(yīng)能力。

高山櫟是橫斷山脈亞高山的優(yōu)勢樹種，具有重要的生態(tài)價值。但本研究中喬木和灌木型高山櫟根系木質(zhì)化程度均較高，不利于菌種回接。由于本研究取樣范圍和數(shù)量有限，只獲得了初步研究結(jié)果，因此，對該地區(qū)不同海拔分布的高山櫟根系內(nèi)生真菌種類和功能仍有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過組織顯微觀察，發(fā)現(xiàn)橫斷山脈亞高山3種高山櫟的根皮層細(xì)胞內(nèi)有菌絲、微菌核、泡囊等結(jié)構(gòu)，反映出其根系普遍存在DSE等內(nèi)生真菌。從橫斷山脈亞高山3種高山櫟根系中分離鑒定出3門17科20屬27種內(nèi)生真菌，表明橫斷山脈亞高山3種高山櫟根內(nèi)真菌物種多樣性豐富，存在菌根菌、DSE和木霉等內(nèi)生真菌及部分潛在的病原菌。初步研究發(fā)現(xiàn)3種高山櫟根系內(nèi)生真菌的多樣性豐度差異不顯著。