賀君星，馬慶國，裴 東，張俊佩

(林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

核桃（Juglans regiaL.）是在全世界范圍內(nèi)廣泛栽培利用的重要經(jīng)濟樹種，中國是核桃的原產(chǎn)地之一。核桃種質(zhì)資源極為豐富，在我國華北、西北、中南、華東、四川以及西藏東南等地區(qū)均有分布，種植歷史達3 000余年[1]，截至2020年底，我國核桃種植面積達782.22 萬hm2，總產(chǎn)量479.59萬t，居世界首位[2]。核桃雌雄同株異形異花，育種周期長，多數(shù)品種親和力很強。20世紀(jì)60年代以來，我國的引種和雜交育種工作不斷推進，涌現(xiàn)了大量的自主知識產(chǎn)權(quán)品種，現(xiàn)有的國家審、認定良種17個，生產(chǎn)中使用較多的省審定良種和有效期內(nèi)的認定良種約計239個，遍布全國各地[3]，豐富的品種資源有力地支撐了我國核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記以其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、對基因組覆蓋度廣、易于擴增以及共顯性等顯著特點，成為目前遺傳學(xué)研究和植物品種鑒定中使用最便捷、應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記系統(tǒng)之一[4-6]，國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）生化和分子生物技術(shù)工作組（BMT）也將其作為用于品種鑒定和分子身份證構(gòu)建的最佳分子標(biāo)記[7]。SSR通常是以1～6個核苷酸為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，在基因組中廣泛分布。在微生物[8]、植物[9-10]、動物[11]和人類[12-13]等不同物種中都開展過全基因組范圍內(nèi)的SSR引物開發(fā)工作。Woeste等[14]首次基于美國東部黑核桃基因組DNA開發(fā)了SSR標(biāo)記，這些引物在后續(xù)核桃屬植物的遺傳研究中也得到了應(yīng)用[15]。Zhang等[16]、Dang等[17]基于核桃EST序列各開發(fā)了41和39對ESTSSR引物。陳凌娜等[18]、Ikhsan等[19]和Eser等[20]基于細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）序列分別開發(fā)了19、307和20對BES-SSR引物。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前大約已開發(fā)出770對SSR引物，多數(shù)是從J. regia這個種開發(fā)的，為核桃的分子標(biāo)記研究奠定了一定的基礎(chǔ)[20]。但是，由于核桃基因組的復(fù)雜性和越來越深入的研究工作對分子標(biāo)記產(chǎn)生新的需求，這些引物已經(jīng)不能滿足相關(guān)工作的需要，而可用于子代純度檢測等分子輔助育種研究的核桃單態(tài)性SSR位點則未見報道[21]。

隨著核桃基因組測序的開展和完善，本課題組已組裝完成并發(fā)表了一套染色體水平的高質(zhì)量參考基因組[22]，本研究基于該參考基因組序列分析其不同染色體上SSR位點的分布、重復(fù)單元數(shù)量及長度、稀有SSR堿基分布情況等特征，利用電子PCR技術(shù)分析SSR引物的多態(tài)性，并隨機選取部分單態(tài)性SSR引物進行PCR實驗驗證，旨在明確電子PCR方法在核桃SSR引物分析中的有效性，有助于核桃SSR引物的快速批量化開發(fā)，進而為核桃種質(zhì)資源保護及開發(fā)利用、遺傳研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取6個核桃主栽品種用于PCR實驗驗證，其名稱和來源地等信息見表1，于生長季采其健康、無病蟲害、中等成熟度的葉片，低溫帶回實驗室，立即提取其基因組DNA。

表1 供試核桃品種Table 1 Walnut cultivars used in this study

1.2 數(shù)據(jù)來源

FASTA格式的核桃品種‘中牧查一’的染色體水平參考基因組序列下載自國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中 心（CNCB-NGDC，網(wǎng) 址https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA002070），編號PRJCA002070，共包含16條染色體，全長為540 Mb，Contig N50為3.34 Mb[22]；核桃品種‘Chandler’[23]的染色體水平全基因組序列下載自GigaDB（http://gigadb.org/dataset/100735）。使用famap和fahash軟件將2套基因組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為hash數(shù)據(jù)庫，以備引物多態(tài)性電子PCR模擬評估使用。

1.3 SSR位點搜索和引物設(shè)計

利用MIcroSAtellite（MISA,http://pgrc.ipkga tersleben.de/misa/）程序?qū)颂胰蚪M不同染色體中的SSR位點進行搜索和統(tǒng)計，設(shè)定單核苷酸（Mono-）、二核苷酸（Di-）、三核苷酸（Tri-）、四核苷酸（Tetra-）、五核苷酸（Penta-）和六核苷酸（Hexa-）的最少重復(fù)分別為10、6、5、5、5和5次，統(tǒng)計SSR位點的數(shù)量、長度和重復(fù)單元類型等信息，分析不同染色體上各種類型SSR位點的頻率分布。

利用Primer 3.0設(shè)計SSR引物，采用的參數(shù)及篩選標(biāo)準(zhǔn)主要有：引物長度為18～28 bp，20 bp為佳；產(chǎn)物長度100～500 bp；引物退火溫度為55～65 ℃，以60 ℃為佳；引物序列GC含量為40%～60%，以50%為佳；避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯配[6,24-25]。

1.4 SSR引物多態(tài)性的電子PCR檢測

利用電子PCR程序中的re-PCR模塊將篩選出的SSR標(biāo)記在1.2中構(gòu)建的基因組數(shù)據(jù)庫中進行模擬擴增，主要參數(shù)為：re-PCR-S＜hashfile＞-n 0-g 0100-1 000，根據(jù)模擬擴增結(jié)果將引物分為單態(tài)和多態(tài)兩類，其中，單態(tài)引物在基因組數(shù)據(jù)庫中只能擴增出一個位點，而多態(tài)引物可以擴增得到多個位點，即如果擴增產(chǎn)物大小相差≥2 bp，則SSR被歸類為多態(tài)性引物，擴增產(chǎn)物大小相同則被視為單態(tài)，而僅有1 bp差異的SSR位點則認為是不明確的，并從分析中刪除[26]。

1.5 單態(tài)性SSR引物的PCR驗證

從每條染色體上隨機選擇單態(tài)性SSR引物各2對，合成TP-M13引物（上海生工），M13尾巴序列為TGTAAAACGACGGCCAGT。采用改良的CTAB法[15]提取核桃葉片的基因組DNA，參照Chen等[27]的方法進行擴增和毛細管電泳檢測，利用GeneMarker v2.2.0讀取電泳條帶，然后使用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃全基因組SSR頻率及總體分布特征

利用MISA v2.1軟件對全長540 Mb的核桃全基因組序列中的SSR位點進行鑒定，共得到357 629個SSR位點，平均每1.51 kb出現(xiàn)1個SSR位點，SSR序列總長度為8 019 209 bp，占基因組全長的1.49%，包括4 005種重復(fù)單元。其中，單核苷酸重復(fù)單元占比最高，達58.93%；二核苷酸到四核苷酸重復(fù)單元占比分別為34.00%、5.19%、1.03%；五核苷酸和六核苷酸重復(fù)單元的占比則不足1.00%，但堿基組合可選擇性和隨機性更強，種類更加豐富，且重復(fù)單元占自身核苷酸重復(fù)類型的比例分布更加均勻。如ACTCCG/AGTCGG占六核苷酸重復(fù)的比例為8.96%，AAAAAT/ATTTTT占比為8.46%（圖1 a）。單核苷酸重復(fù)類型中(A)n最為豐富，接近所有核苷酸重復(fù)比例的一半，二核苷酸重復(fù)類型中(AT)n最多(32.10%)，三核苷酸類型中(AAT)n最多(16.50%)，而四核苷酸類型中(AAAT)n(9.00%)占比最高（圖1 b）。無論是單堿基還是多堿基重復(fù)，占比居前四位的重復(fù)基序中，僅有A、T堿基出現(xiàn)，說明核桃全基因組微衛(wèi)星具有A/T豐富的特性。AGG、AAC、AGC、ACT、ACG和CCG占比不足1.00%，可能屬于稀有SSR單元的主要基序組成成員。核桃SSR序列長度在10～297 bp間變化，平均為73.30 bp，以10～30 bp長度的短重復(fù)序列為主（95.93%），而長度大于30 bp的僅占4.07%，不同長度的SSR序列所占比例存在較大差異，其中，10 bp長度的SSR所占比例最大（18.09%），隨著SSR序列長度的增加，其占比呈下降趨勢（圖1 c）。

圖1 核桃全基因組SSR位點重復(fù)類型的分布特征Fig.1 Genome-wide distribution of SSR repeat types in walnut

2.2 核桃不同染色體上SSR的數(shù)量及其分布

核桃參考基因組包含16條染色體，即Chr1～Chr16。不同染色體上SSR位點數(shù)量差異較大（圖2 a），其Chr1上數(shù)量最多（34 749，9.72%），Chr16上數(shù)量最少（13 666，3.82%）。采用一元線性回歸分析擬合發(fā)現(xiàn)，SSR位點數(shù)量與染色體長度間的線性關(guān)系明顯，得到回歸方程y=1 437x+1 679 338，決定系數(shù)為0.96，擬合效果較好，即染色體長度越大，相應(yīng)的SSR位點數(shù)量越多（圖2 b）。各染色體上SSR位點的分布密度相對穩(wěn)定，數(shù)量變化幅度為1 427～1 685個，其中，Chr9最低，Chr15最高。同時，進一步對SSR的數(shù)量、種類與染色體長度間的相關(guān)分析表明，染色體長度與SSR數(shù)量（r=0.982 0，p＜0.01）、種類（r=0.900 3，p＜0.01）間均呈極顯著正相關(guān)，表明隨著染色體長度的增加，其SSR的種類與數(shù)量均呈增加趨勢。

對16條染色體上不同重復(fù)類型的SSR位點數(shù)量進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同重復(fù)類型SSR位點間均呈極顯著相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），其中，單核苷酸與二核苷酸位點數(shù)的相關(guān)系數(shù)（r）最大（0.986 3），四核苷酸和六核苷酸的相關(guān)系數(shù)最小，僅為0.785 4（表2）。單核苷酸到四核苷酸間聯(lián)系極緊密（r＞0.90）；而5～6核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量和其它重復(fù)類型間相關(guān)系數(shù)較低，最大為0.879 6，最小僅為0.785 4。

表2 核桃不同重復(fù)類型SSR相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficient of different SSR repeat types in Walnut

根據(jù)SSR位點不同重復(fù)類型和重復(fù)次數(shù)等，構(gòu)建不同染色體SSR位點280×16階分布矩陣，并進行相關(guān)性分析建立相關(guān)系數(shù)矩陣，通過相關(guān)系數(shù)矩陣，對染色體進行聚類分析（圖2 d）。以遺傳距離0.075為閾值可將核桃16條染色體分為4組（Ⅰ～Ⅳ），其中，第Ⅰ組只有1條染色體，即Chr10；第Ⅱ組包括2個成員，即Chr1和Chr3；第Ⅲ組包括Chr14和Chr16這2條染色體；第Ⅳ組則囊括了其余11條染色體，這個組又可分為2個亞組，第1個亞組中有Chr4、Chr7、Chr5和Chr11這4條染色體，第2個亞組包括Chr6、Chr13、Chr2、Chr9、Chr15、Chr8和Chr12這7條染色體，這2個亞組中的成員也是SSR分布模式最相似的染色體?？傮w上，第Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組回溯到同一個主枝，而第Ⅰ組則歸類于單獨的一個主枝，表明Chr10上SSR位點的數(shù)量、分布和頻率等與其他15條染色體相比差異較大。

2.3 核桃不同染色體上SSR的重復(fù)單元類型和稀有SSR位點

不同染色體間重復(fù)單元數(shù)及重復(fù)堿基的種類存在一定的差異（圖2 c），Chr1染色體上最多（406種），其次為Chr3、Chr5和Chr11，而Chr16染色體上最少（188種），其中，單核苷酸重復(fù)SSR序列均以A/T重復(fù)單元為主，其含量在不同染色體上相對穩(wěn)定，其中，Chr4上最低（93.76%），Chr12上最高（95.05%）；二核苷酸重復(fù)SSR序列均以AT/AT重復(fù)單元為主，所占比例在53.61%（Chr12）～59.43%（Chr9）間變化；三核苷酸重復(fù)SSR序列的重復(fù)單元不同染色體均為10種重復(fù)單元類型，主導(dǎo)單元均為AAT/ATT，其所占百分比在48.34%（Chr16）～55.35%（Chr12）間變化；四核苷酸SSR序列的主要重復(fù)單元是AAAT/ATTT，其所占百分比在30.52%（Chr13）～52.29%（Chr14）間變化；五核苷酸重復(fù)SSR序列在不同染色體上的重復(fù)單元類型數(shù)量為18（Chr12、13、16）～36（Chr3）種，其中，Chr3（22.73%）和Chr14（29.29%）上的SSR主導(dǎo)單元為AAAAG/CTTTT，Chr6（23.91%）、Chr13（29.32%）和Chr15（25.47%）染色體上為AAAAG/CTTTT和AGATG/ATCTC且占比相同，其余11條染色體的SSR主導(dǎo)單元均為AGATG/ATCTC，所占百分比為27.52%（Chr4）～34.78%（Chr10）；六核苷酸重復(fù)單元的類型為13（Chr14）～43（Chr1）種，且大部分染色體都以AAAAAT/ATTTTT或AAAAAG/CTTTTT單元為主，所占比例在8.32%（Chr2）～22.73%（Chr11）間變化。

圖2 核桃基因組不同染色體SSR位點分布Fig.2 Distribution of SSR loci in different chromosomes of walnut genome

核桃基因組中存在644種稀有SSR單元（即該重復(fù)單元僅在單一染色體中存在），不同染色體上存在的SSR稀有單元數(shù)存在較大差異，其中，Chr4中最少，為22 種，Chr5中最多，達64 種（表3）。稀有SSR單元為4～6核苷酸重復(fù)，其中以六核苷酸最多（426 種），四核苷酸最少（38種），說明SSR單元組成的核苷酸越多，其所占比例越低，成為稀有SSR單元的概率越大。

表3 核桃參考基因組不同染色體的稀有SSR重復(fù)單元Table 3 Rare SSR units of different chromosomes in Walnut reference genome

續(xù)表 3

2.4 核桃全基因組單態(tài)性SSR引物開發(fā)與PCR驗證

利用Primer 3.0軟件根據(jù)SSR位點側(cè)翼的保守序列，從357 629個SSR位點中共設(shè)計出303 009對（91.51%）SSR引物，包括6種完全微衛(wèi)星（258 024,85.15%）、不完全微衛(wèi)星（1 688,0.56%）和復(fù)合型微衛(wèi)星（43 297,14.29%）等3種類型。然后，利用re-PCR將2～6核苷酸重復(fù)的完全型SSR引物比對到基因組hash數(shù)據(jù)庫，通過電子模擬擴增評價其多態(tài)性，根據(jù)在不同基因組中的電子模擬擴增條帶將其分為單態(tài)和多態(tài)兩類，條帶大小差異僅1 bp的引物將被棄用。電子模擬擴增分析發(fā)現(xiàn)，不同染色體上的單態(tài)性標(biāo)記最少為2 295個（Chr16），最多為10 881個（Chr3），長重復(fù)單元（＞30 nt）的引物中多態(tài)性引物的比例要高于短重復(fù)單元的引物，這與Biswas等[26]在甜橙基因組中的研究結(jié)果類似。

為了驗證電子模擬擴增結(jié)果的可靠性和新開發(fā)的SSR標(biāo)記的有效性，從經(jīng)re-PCR評估的單態(tài)引物中隨機均勻地選擇三堿基重復(fù)引物32對（表4），合成TP-M13引物在‘強特勒（Chandler）’等6個品種中擴增，并利用毛細管電泳技術(shù)進行檢測（圖3）。所選32對引物中除CAF36和CAF350以外，其余30對SSR引物（93.75%）均可以在供試樣品中擴增出清晰的目標(biāo)產(chǎn)物，PCR擴增結(jié)果與電子模擬評估結(jié)果一致性較好。此外，30對SSR引物中有4對（CAF11、CAF129、CAF271和CAF364）在供試樣品之間表現(xiàn)出多態(tài)性。

圖3 CAF11引物在6個核桃主栽品種中的毛細管電泳圖譜Fig.3 The capillary electrophoresis patterns from primer CAF11 in 6 main cultivars of walnut.

表4 32對核桃單態(tài)SSR引物信息Table 4 Information of 32 primers from walnut genome

3 討論

3.1 核桃全基因組SSR分布特征

SSR在基因組中的出現(xiàn)主要源于進化過程中的突變，如滑鏈錯配、一個或多個重復(fù)基序的插入缺失等，因此，特定數(shù)量和長度的SSR可以作為進化過程中遺傳變異的指標(biāo)[24]。本研究從‘中牧查一’核桃參考基因組16條染色體中共鑒定出了357 629個SSR位點，其密度為662.28 SSRs·Mb-1，低于石榴（1 294.62 SSRs·Mb-1）[6]和棗（872.60 SSRs·Mb-1）[28]等樹種，高于亞麻（225.3 SSRs·Mb-1）[29]、茶樹（216.88 SSRs·Mb-1）[30]和花生（392.45 SSRs·Mb-1）[31]等植物，而與楊樹（667.9 SSRs·Mb-1）[32]在基因組上的研究結(jié)果相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)可能反映了不同物種本身基因組大小的差異以及基因組序列中堿基排列組合方式的隨機性和變異性，以往研究表明基因組大小會影響SSR的密度，但并不是所有物種中二者之間都具有顯著相關(guān)性[33-34]，而本研究中核桃基因組SSR的數(shù)量、種類與染色體序列長度均呈極顯著正相關(guān)。同時，SSR的分布和密度變化很大，也可能是由于搜索標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)庫挖掘工具的不同導(dǎo)致的。

單堿基重復(fù)的SSR是核桃基因組每條染色體上最常見的類型，2～3堿基重復(fù)次之，4～6堿基重復(fù)則較少，這在小麥[24]和甜橙[26]等物種的基因組中也有報道，但與煙草[35]中以二堿基重復(fù)類型為主的情況不同。核桃的SSR基本組成在所有重復(fù)類型中以A和T為主，而CG/CG在二核苷酸重復(fù)序列中密度最低，這與煙草[35]和四倍體野花生[36]等物種相似，核桃SSR中最多的二核苷酸重復(fù)是AT/AT，其次是AC/GT和AC/GT，王玉龍等[36]報道，四倍體野花生基因組中數(shù)量最多的重復(fù)單元依次是A/T、AT/AT、AAT/ATT，AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT和AAAAAT/ATTTTT。Lu等[31]對栽培花生的研究結(jié)果與此類似。盡管分布模式有所差異，但對許多植物基因組而言，AAN、AAAN、AAAAN和AAAAN比其他重復(fù)基序更常見。

研究指出，單堿基或二堿基重復(fù)單元大量發(fā)生則表明該物種的進化水平較高[37]，而核桃單核苷酸與二核苷酸數(shù)量的總和占所有微衛(wèi)星位點的92.80%，這可能說明核桃起源相對較晚同時容易發(fā)生SSR變異，從而產(chǎn)生更多的堿基重復(fù)類型，其中，單堿基重復(fù)占58.85%。有研究表明，單堿基重復(fù)的數(shù)量隨物種基因組大小不同而產(chǎn)生差異，相比而言物種基因組增大，其單堿基相對豐富增加[38]。Song等[39]分析了112種植物3 951 919條基因序列中SSR的分布情況，發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)SSR數(shù)量超過50%，與核桃SSR數(shù)量分布比例有所不同，這可能與密碼子以3個堿基為組成單位有關(guān)。近期的一項研究將石榴基因組中的SSR分為三大類，即class I（＞30 nt）,class II（20～30 nt）和class III（＜20 nt），其中，第一類SSR可能更易發(fā)生突變呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)[6]，更早的研究中Portis等[40]、陳凌娜等[18]和Temnykh等[41]也強調(diào)了SSR片段長度在標(biāo)記開發(fā)和育種中的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)，核桃SSR序列主要以10～30 bp的短重復(fù)序列為主，SSR序列的出現(xiàn)頻率呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化，重復(fù)長度越長，出現(xiàn)頻率則越低。

3.2 核桃全基因組特異性單態(tài)SSR引物開發(fā)與驗證

以往研究表明，單核苷酸重復(fù)的SSR并不適宜于開發(fā)SSR引物[26,42]，因此，本文在引物設(shè)計和開發(fā)時僅使用了2～6核苷酸重復(fù)的類型；以往研究表明，單態(tài)SSR標(biāo)記可作為遺傳分析和育種子代群體“私生檢測”的有力工具[21,43]，也有將單態(tài)性標(biāo)記轉(zhuǎn)換為多態(tài)性標(biāo)記的報道[44-45]。在re-PCR檢測到的單態(tài)性標(biāo)記中，二核苷酸基序（77.28%）最常見，其中，Chr3染色體含有最多的單態(tài)性標(biāo)記，其可能是核桃分子標(biāo)記輔助育種的較好選擇。隨機選擇32對單態(tài)性SSR引物在6個不同核桃主栽品種中進行PCR驗證，其中，4對預(yù)測為單態(tài)的引物擴增出了多個基因座，這可能是由于電子PCR分析僅采用了2套基因組所致，也有可能是核桃的全基因組尚有未完全揭示的序列，而多達28對引物獲得了與電子PCR分析相一致的PCR實驗擴增結(jié)果。由此可見，基于全基因組序列采用電子PCR結(jié)合傳統(tǒng)分子標(biāo)記篩選策略的方法進行SSR標(biāo)記開發(fā)效果較好。

4 結(jié)論

核桃是世界范圍廣泛栽培的重要經(jīng)濟樹種，本研究從‘中牧查一’核桃參考基因組中鑒定了357 629個SSR位點，這些位點在不同染色體上的數(shù)量和重復(fù)類型具有明顯差異，其中，單堿基重復(fù)占比較高，A/T堿基重復(fù)是其優(yōu)勢重復(fù)單元。在此基礎(chǔ)上，建立了聯(lián)合應(yīng)用電子PCR和傳統(tǒng)引物篩選方法進行引物開發(fā)的新策略，每條染色體上隨機選取2對共計32對引物以6個核桃主栽品種為試材進行擴增，結(jié)果顯示其中30對引物的擴增效果較好，28對（87.50%）引物的擴增結(jié)果與電子PCR分析結(jié)果相一致，從而驗證了這一引物開發(fā)策略的有效性，為核桃SSR引物的個性化快速開發(fā)提供了有效策略，篩選獲得的28對單態(tài)性引物可為分子輔助育種中雜交子代“私生檢測”等研究提供科學(xué)借鑒與參考。