禹 飛，梁俊峰

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 晉中 030801；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

外生菌根真菌與宿主植物共生過程中，外生菌根真菌可以為宿主植物提供水分以及氮、磷等必要的礦質(zhì)元素，來促進(jìn)宿主植物的生長和提高其抵抗不良環(huán)境的能力[1]；而宿主植物以脂質(zhì)或糖的形式為外生菌根真菌提供碳水化合物供菌絲的生長[2]。在森林生態(tài)系統(tǒng)中，宿主植物-外生菌根真菌-根際土壤微生物之間存在相互依存、協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系，根際土壤微生物不僅能夠提高外生菌根真菌的接種率[3]，還能促進(jìn)外生菌根真菌與宿主植物發(fā)生共生關(guān)系[4]，這類根際土壤微生物稱之為菌根輔助菌。大量研究表明，菌根輔助菌不僅能通過降解植物細(xì)胞壁等促進(jìn)外生菌根真菌定殖，提高外生菌根真菌菌絲的存活率，還能通過降解細(xì)胞壁獲得碳源供外生菌根真菌生長，誘導(dǎo)外生菌根真菌孢子萌發(fā)，抑制病原菌的產(chǎn)生[5]。菌根輔助菌還能分泌生長因子、次級代謝物等供外生菌根真菌生長，因此，篩選外生菌根真菌生長所需的菌根輔助菌對于提高外生菌根菌的產(chǎn)量十分重要[6]。

灰 肉 紅 菇（Russula griseocarnosaX.H.Wang,Zhu L.Yang &Knudsen 2009）又名“正紅菇”、“真紅菇”、“大紅菌”等，味道鮮美，干品價(jià)格為800～1 000 元·kg-1，常見于廣東、廣西、云南、福建、貴州等地[7]；玫瑰紅菇（Russula roseaPersoon 1796）別稱苦紅菇、紅辣子等，其菌肉硬，子實(shí)體中存在苦紅菇酸A和苦紅菇酸B四環(huán)三萜酸化合物，稍帶苦辣味[8]，很容易與灰肉紅菇混淆，價(jià)格為200～500 元·kg-1，分布地方比較廣，在全國各地均有分布。灰肉紅菇和玫瑰紅菇作為紅菇屬中常見的野生食藥用外生菌根菌，富含氨基酸、脂肪酸和礦質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)，不僅具有高蛋白、低脂肪、粗纖維等功能，還具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌等功效，是非常重要的林下非木質(zhì)林產(chǎn)品資源[9-10]。李國杰等[11]報(bào)道了我國82種可食用紅菇和22種可藥用紅菇，其中，灰肉紅菇和玫瑰紅菇均具有重要的食藥用價(jià)值?；胰饧t菇與玫瑰紅菇不僅在味道上有顯著差異，而且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[12-13]，目前均不能進(jìn)行人工栽培。在野外考察中，發(fā)現(xiàn)灰肉紅菇和玫瑰紅菇共存于同一片區(qū)域。

本研究以同一生態(tài)條件下2種外生菌根真菌玫瑰紅菇和灰肉紅菇的根際和非根際土壤微生物（細(xì)菌、真菌）作為研究對象，采用Illumina MiSeq二代雙端測序的方法進(jìn)行測序分析，通過比較2種紅菇根際與非根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)差異，篩選相應(yīng)的菌根輔助菌，結(jié)合土壤理化性質(zhì)和2種紅菇的生境，為2種紅菇的保育促繁、開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 采集地概況

在 廣 東 省 梅 州 市 豐 順 縣（116°16′58″ E,24°5′25″ N）采集到灰肉紅菇和玫瑰紅菇2種野生食藥用外生菌根菌，采集林分主要樹種為藜蒴（Castanopsis fissa(Champ.ex Benth.) Rehd.et Wils.），2種紅菇混雜于林內(nèi)，該地區(qū)海拔147 m，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫為21.4 ℃，年降水量為1 776.1 mm。

2 研究方法

2.1 樣品采集

在野外藜蒴林發(fā)現(xiàn)野生的灰肉紅菇和玫瑰紅菇，用抖落法收集粘附在紅菇上的深度0～10 cm土壤作為根際土壤；在沒長紅菇、且與紅菇橫向距離相隔1 m地方，取深度0～10 cm的土壤作為非根際土壤。由于灰肉紅菇和玫瑰紅菇生長相距較近，非根際土壤采集可以共同使用。將上述采集的根際與非根際土壤分別分為2份，一份裝入無菌自封袋，液氮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在-70 ℃冰箱保存用于分子水平高通量測序研究；另一份帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，風(fēng)干后的土壤過2 mm篩，用于理化性質(zhì)測定。采集地的土壤為紅壤。樣品標(biāo)記中，RR為玫瑰紅菇根際土壤；RG為灰肉紅菇根際土壤；BK為非根際土壤。

2.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH使用土水比（w/v）為1∶2.5的pH510酸度計(jì)測定[14]；土壤有機(jī)碳使用重鉻酸鉀加熱法測定[15]；土壤有效氮利用堿解擴(kuò)散法測定[16]；土壤有效磷采取碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定[17]；土壤有效鉀使用火焰分光光度法測定[18]。

2.3 土壤微生物多樣性分析

2.3.1 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序 稱取0.30 g土壤，按照上海生工提供的Ezup 柱土壤DNA 抽提試劑盒說明提取土壤DNA樣品，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測DNA濃度和純度，確保DNA純度OD260/280處于1.8～2.0間，DNA濃度＞50 mg·L-1。

檢測合格的DNA樣品分別使用真菌ITS和細(xì)菌16S引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。真菌ITS引物片段約為300 bp，引物序列為：ITS1F（5′-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTG CGTTCTTCATCGATGC-3′）[19]。細(xì)菌16S的引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[20]，片段長度約為468 bp。20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為：5×PCR擴(kuò)增緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，2.0 g·L-1牛血清白蛋白溶液（BSA）0.2 μL，5 μmol·L-1正反向引物各0.8 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，50 mg·L-1DNA模板2 μL，ddH2O 9.8 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序均為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%（質(zhì)量體積比）瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測合格的樣品送至上海美吉生物公司進(jìn)行Illumina MiSeq PE300雙端測序。

2.3.2 測序分析 通過MiSeq PE300雙端測序獲得原始下機(jī)數(shù)據(jù)，對原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及質(zhì)量評估：選取平均質(zhì)量值＞20、長度＞100 bp的序列；根據(jù)首尾兩端的barcode和引物序列調(diào)整序列方向，去除首尾兩端的barcode和引物序列；利用FLASH v1.2.11軟件將成對reads拼接成一條序列，拼接后的序列最大錯(cuò)配比率＜0.2的作為有效序列，進(jìn)行后續(xù)分析。

使用Uparse v7.0.1 軟件對所有樣品的有效序列基于97%的相似性進(jìn)行OTUs聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTUs代表序列，將這些代表序列使用RDP classifier貝葉斯算法與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對得到物種的注釋信息。真菌的比對數(shù)據(jù)庫為Unite（Release 8.0）[21]；細(xì)菌的比對數(shù)據(jù)庫為Silva（Release138）[22]。結(jié)合比對物種組成信息可以得到不同樣品在各個(gè)分類水平的物種豐度表。土壤真菌多樣性研究，除去紅菇屬序列，避免對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響[23]。土壤真菌和細(xì)菌在數(shù)據(jù)分析前期，均使用最小樣本的序列數(shù)進(jìn)行抽平[24]。抽平后的OTUs豐度信息使用Qiime v1.9.0計(jì)算樣品的物種數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)等α多樣性指數(shù)。Chao指數(shù)反映物種群落豐富度，Shannon指數(shù)反映物種群落多樣性。

土壤細(xì)菌的功能預(yù)測先通過PICRUSt對OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，根據(jù)OTU對應(yīng)的greengene id，與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可獲得各個(gè)樣本在不同代謝通路的注釋結(jié)果[23]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)水平分析

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理，并進(jìn)行正態(tài)分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0進(jìn)行單因素鄧肯Duncan方差分析，數(shù)據(jù)的描述采取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，在統(tǒng)計(jì)學(xué)水平p＜0.05下，同列不同字母表示存在顯著差異，字母相同表示差異不顯著。兩組樣本在屬水平上的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差不等的情況下，選擇Welch'st檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析[25]，并使用STAMP軟件進(jìn)行繪制。

分別對土壤細(xì)菌、真菌的OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行去趨勢對應(yīng)排序分析（DCA）[26]，DCA分析結(jié)果顯示第一軸的長度均＜3，因此使用R v 4.1.0語言vegan包進(jìn)行冗余分析（RDA），探討樣本、菌群與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。

在屬水平上，物種的豐度注釋信息以及土壤微生物與土壤理化性質(zhì)的Spearman相關(guān)性分析均使用R v 4.1.0語言中Pheatmap 包繪制。利用R語言繪制稀釋性曲線圖和在門水平上的物種相對豐度柱狀圖。

3 結(jié)果分析

3.1 2種紅菇根際與非根際土壤理化性質(zhì)

2種紅菇根際與非根際土壤理化性質(zhì)表明：灰肉紅菇和玫瑰紅菇根際土壤的有機(jī)碳（p=0.047）和有效鉀（p=0.046）顯著高于非根際土壤，在土壤pH、有效氮和有效磷中差異不顯著（表1）。

表1 2種紅菇根際與非根際土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of mycosphere and bulk soil of two species of Russula

3.2 2種紅菇對根際微生物多樣性的影響

通過對2種紅菇根際與非根際土壤細(xì)菌、真菌的高通量測序分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、質(zhì)控后，玫瑰紅菇根際、灰肉紅菇根際和非根際土壤細(xì)菌分別獲得39 685、40 681、33 688條有效數(shù)據(jù)；玫瑰紅菇根際、灰肉紅菇根際和非根際土壤真菌分別獲得46 151、52 073、65 339條有效數(shù)據(jù)。2種紅菇根際與非根際土壤的細(xì)菌、真菌實(shí)際測量出的OTU數(shù)目的稀釋性曲線均趨于平坦（圖1），說明測序的結(jié)果合理可靠，更多的測序數(shù)據(jù)量發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較低。在本研究中，土壤細(xì)菌共獲得2 914個(gè)OTU，土壤真菌共獲得536個(gè)OTU。

圖1 2種紅菇根際與非根際土壤微生物的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curve of mycosphere and bulk soil in two species of Russula

2種紅菇根際土壤細(xì)菌Chao指數(shù)顯著高于非根際土壤（p=0.03），Shannon指數(shù)低于非根際土壤，2種紅菇的根際土壤細(xì)菌多樣性差異不顯著（表2）。在土壤真菌多樣性中發(fā)現(xiàn)，灰肉紅菇的根際土壤真菌Chao指數(shù)（p=0.034）和Shannon指數(shù)（p=0.01）顯著高于玫瑰紅菇根際土壤（表2）。

表2 2種紅菇根際與非根際土壤微生物多樣性指數(shù)的比較分析Table 2 Diversity index of mycosphere and bulk soil microorganism of two species of Russula

3.3 2種紅菇對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2種紅菇的根際和非根際土壤共注釋到24個(gè)細(xì)菌門，5個(gè)真菌門，其中，變形菌門（Proteobacteria）、酸 桿 菌 門（Acidobacteria）、綠 彎 菌門(Chloroflexi)和放線菌門（Actinobacteria）為主要的細(xì)菌門（圖2A）；子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）為主要的真菌門（圖2B）?；胰饧t菇和玫瑰紅菇的根際土壤細(xì)菌中變形菌門（p=0.017）、酸桿菌門（p＜0.01）和土壤真菌中擔(dān)子菌門（p=0.002）均顯著高于非根際土壤（圖2）。

圖2 2種紅菇根際與非根際土壤微生物在門水平上的群落組成 （A：細(xì)菌 B：真菌）Fig.2 Community composition of mycosphere and bulk soil in two species of Russula at phylum level ( A: Bacterial B: Fungal)

在細(xì)菌屬共計(jì)注釋到445個(gè)屬，變異桿菌屬（Variibacter）、熱酸菌屬（Acidothermus）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Candidatus_Solibacter屬和Burkholderia-Paraburkholderia屬等13個(gè)屬的相對豐度大于0.1%，為主要的細(xì)菌屬。在前50個(gè)屬中，玫瑰紅菇和灰肉紅菇根際土壤細(xì)菌的變異桿菌屬（Variibacter）（p＜0.01）、Candidatus_Solibacter屬（p=0.033）、堆囊菌屬（Sorangium）（p=0.029）、分 枝 桿 菌 屬（Mycobacterium）（p＜0.01）、Singulisphaera屬（p=0.023）、Isosphaera屬（p=0.001）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）（p=0.034）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（p=0.005）顯著高于非根際土壤，這些可能是紅菇屬生長的主要菌根輔助細(xì)菌；叢生放線菌屬（Actinospica）（p=0.016）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（p=0.023）、Chthonomonas屬（p=0.001）和Vicinamibacter屬（p＜0.01）等顯著低于非根際土壤（圖3A）。在土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，灰肉紅菇和玫瑰紅菇處于同一支，說明二者之間的菌群結(jié)構(gòu)相似。進(jìn)一步對灰肉紅菇和玫瑰紅菇的根際土壤細(xì)菌進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，灰肉紅菇根際土壤細(xì)菌中變異桿菌屬（Variibacter）（p=0.022）、Bryobacter屬（p=0.023）和芽生綠菌屬（Blastochloris）（p=0.008 9）顯著高于玫瑰紅菇根際土壤細(xì)菌，而熱酸菌屬（Acidothermus）（p=0.013）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）（p=0.044）、Reyranella屬（p=0.009）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）（p=0.013）和羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）（p=0.013）顯著低于玫瑰紅菇根際土壤細(xì)菌（圖4A），這說明不同紅菇中的土壤細(xì)菌優(yōu)勢輔助菌略有差異。

在土壤真菌屬共計(jì)注釋到146個(gè)屬，木霉屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）、青霉屬（Penicillium）、棉革菌屬（Tomentella）和粘頭束霉屬（Gliocephalotrichum）為主要的真菌屬。在前50個(gè)屬中，灰肉紅菇和玫瑰紅菇根際土壤真菌中木霉屬（Trichoderma）（p=0.023）、青霉屬（Penicillium）（p=0.038）和Hypomyces屬（p=0.038）顯著高于非根際土壤，而豆馬勃屬（Pisolithus）（p=0.023）、枝孢屬（Cladosporium）（p=0.030）和擬棘殼孢屬（Pyrenochaetopsis）（p=0.003）顯著低于非根際土壤（圖3B）。進(jìn)一步對灰肉紅菇和玫瑰紅菇的根際土壤真菌進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)玫瑰紅菇根際土壤真菌的Oidiodendron屬（p=0.018）和木霉屬（Trichoderma）（p=0.018）顯著高于灰肉紅菇根際土壤真菌，灰肉紅菇根際土壤真菌的Cladophialophora屬（p=0.049）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）（p=0.023）、擬青霉屬（Paecilomyces）（p=0.020）和節(jié)菱孢屬（Arthrinium）（p=0.044）顯著高于玫瑰紅菇根際土壤真菌（圖4B），這些結(jié)果表明不同紅菇中主要的優(yōu)勢真菌菌群略有差異。

圖3 2種紅菇根際與非根際土壤微生物在前50個(gè)屬水平上的群落組成（A：細(xì)菌 B：真菌）Fig.3 Community composition of mycosphere and bulk soil in two species of Russula at the top 50 genera (A: Bacterial B: Fungal)

圖4 2種紅菇根際土壤微生物在屬水平上的比較分析 （A：細(xì)菌 B：真菌）Fig.4 Comparative analysis of mycosphere soil microorganisms of two species Russula at genus level (A: Bacterial B: Fungal)

3.4 土壤理化性質(zhì)對根際微生物的影響

RDA結(jié)果分析可以反映菌群、樣本和環(huán)境之間的關(guān)系。通過對2種紅菇根際與非根際土壤（細(xì)菌、真菌）在97%水平上的OTU進(jìn)行RDA分析，結(jié)果表明：2兩種紅菇根際土壤樣品與非根際土壤樣品相距較遠(yuǎn)，菌群結(jié)構(gòu)差異明顯，而2種紅菇樣品相距較近，菌群結(jié)構(gòu)相似，重復(fù)樣地之間測序結(jié)果合理（圖5）。通過對樣地菌群與環(huán)境因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)pH與土壤細(xì)菌（p=0.020）、真菌（p=0.048）群落之間的相關(guān)性最大，說明pH是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。

圖5 樣地與土壤理化性質(zhì)的RDA冗余分析 （A：細(xì)菌 B：真菌）Fig.5 Redundancy analysis (RDA) between soil physicochemical properties and sample( A: Bacterial B: Fungal)

通過對前50個(gè)屬水平的菌群和環(huán)境因子進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：有效氮（AN）、有效磷（AP）、有機(jī)碳（SOC）、有效鉀（AK）為一類，pH為單獨(dú)的一類，說明pH對菌群的影響較大（圖6）。在土壤細(xì)菌中，變異桿菌屬（Variibacter）（p=0.049）、堆 囊 菌 屬（Sorangium）（p=0.025）、分 枝 桿 菌 屬（Mycobacterium）（p=0.038）、根 微 菌 屬（Rhizomicrobium）（p=0.005）、芽生綠菌屬（Blastochloris）（p=0.030）、Reyranella屬（p=0.036）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）（p=0.020）和北里孢菌屬（Kitasatospora）（p=0.049）與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，Chthonomonas屬（p=0.007）、Aquicella屬（p=0.013）和玫瑰彎菌屬（Roseiflexus）（p=0.015）與pH呈顯著正相 關(guān)；Candidatus_Solibacter屬、堆 囊 菌 屬（Sorangium）和Mucilaginibacter屬與土壤SOC、AN、AP和AK呈顯著正相關(guān)，Chthonomonas則與土壤SOC、AN、AP和AK呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6A）。在土壤真菌中，木霉屬（Trichoderma）、被 孢 霉 屬（Mortierella）、粘 頭 束 霉 屬（Gliocephalotrichum）、莖霉屬（Chaunopycnis）和瘤孢屬（Sepedonium）與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)；Arnium屬、豆馬勃屬（Pisolithus）和隱囊菌屬（Aphanoascus）與pH呈顯著正相關(guān)，與有機(jī)碳、AK呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6B）。

圖6 前50個(gè)屬的土壤微生物與土壤理化性質(zhì)的Spearman相關(guān)性分析（A：細(xì)菌 B：真菌）Fig.6 Spearman correlation analysis between the top 50 genera and soil physicochemical properties (A: Bacterial B: Fungal)

3.5 2種紅菇對土壤細(xì)菌群落功能的影響

通過對2種紅菇根際與非根際土壤細(xì)菌在KEGG代謝通路注釋結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)相對豐度超過0.5%的代謝通路共有71條，其中具有顯著性差異的代謝通路有33條（圖7）。玫瑰紅菇和灰肉紅菇根際土壤細(xì)菌在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Two-component system）（p＜0.001）]、氨基酸代謝[甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine,serine and threonine metabolism）（p＜0.001）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）（p=0.026）、組氨酸代謝（Histidine metabolism）（p=0.001）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）（p=0.001）]、能量代謝[氮代謝（Nitrogen metabolism）（p＜0.001）]、膜運(yùn)輸[分泌系統(tǒng)（Secretion system）（p＜0.001）、細(xì)菌分泌系統(tǒng)（Bacterial secretion system）（p＜0.001）]、細(xì)胞遷移[細(xì)菌趨化性（Bacterial chemotaxis）（p＜0.001）]、聚糖生物合成與代謝[脂多糖生物合成蛋白（Lipopolysaccharide biosynthesis proteins）（p=0.014）]顯著高于非根際土壤（圖7），其中，灰肉紅菇的分泌系統(tǒng)（Secretion system）和細(xì)菌分泌系統(tǒng)（Bacterial secretion system）代謝途徑顯著高于玫瑰紅菇（圖7），而甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine,serine and threonine metabolism）和組氨酸代謝（Histidine metabolism）顯著低于玫瑰紅菇（圖7）。

圖7 根際與非根際土壤細(xì)菌在KEGG level3水平上具有顯著性差異的代謝通路Fig.7 KEGG level3 metabolic pathways with significant differences between mycosphere and bulk soil bacteria

4 討論

已有研究表明，外生菌根真菌如牛肝菌科、鵝膏菌科和紅菇科等多生長于植物覆蓋度較大、腐殖質(zhì)豐富、土壤肥沃的森林環(huán)境中[27]。范俐等[28]發(fā)現(xiàn)正紅菇根際土壤中全氮、有機(jī)質(zhì)的含量豐富；羅佳煜等[29]在樟子松根際土壤接種褐環(huán)乳牛肝菌和互作細(xì)菌假單胞桿菌發(fā)現(xiàn)，根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、全磷、速效磷含量顯著提高。本研究中，2種紅菇根際的SOC、AN、AP和AK均高于非根際土壤，表明由于2種紅菇的生長使得土壤養(yǎng)分含量增加，這與前人的研究結(jié)果一致，說明外生菌根真菌與植物共生能夠改善根際土壤的養(yǎng)分狀況。外生菌根真菌的生長也受土壤因子如pH值、N和P等影響[30]，特別是pH值，研究發(fā)現(xiàn)，外生菌根菌喜酸性土壤，最適宜生長的pH值范圍在4～6[31]，本研究中玫瑰紅菇和灰肉紅菇的根際土壤pH值介于4.2～4.3，證實(shí)了外生菌根菌喜好酸性土壤的結(jié)論。Avis等[32]發(fā)現(xiàn)，土壤氮元素增加可以刺激外生菌根真菌定植和生長[33]。土壤中磷在一定臨界值有利于外生菌根形成，若土壤中磷含量過高，則降低外生菌根真菌的侵染率[34]，這些結(jié)果說明了外生菌根菌能影響土壤的養(yǎng)分狀況，反過來，土壤養(yǎng)分也能調(diào)節(jié)外生菌根菌的定殖及生長。

Oh等[23]發(fā)現(xiàn)，松茸根際土壤細(xì)菌、真菌多樣性顯著低于非根際土壤（p＜0.05）。本研究中，2種紅菇根際與非根際土壤微生物多樣性指數(shù)存在顯著差異，表明2種紅菇不僅依據(jù)偏向影響了根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，而且影響了微生物的多樣性。在細(xì)菌屬水平上，2種紅菇根際土壤中變異桿菌屬、Candidatus_Solibacter屬、堆囊菌屬、分枝桿菌屬、Singulisphaera屬、Isosphaera屬、蛭弧菌屬和類芽孢桿菌屬顯著高于非根際土壤；在真菌屬水平上，木霉屬、青霉屬和Hypomyces屬顯著高于非根際土壤，這些可能是紅菇屬生長的重要微生物。進(jìn)一步比較2種紅菇的根際土壤微生物之間的差異，發(fā)現(xiàn)相對豐度較高的類群相似，含量略有差異，如根際土壤細(xì)菌中，灰肉紅菇根際土壤中變異桿菌屬和Bryobacter屬顯著高于玫瑰紅菇根際土壤，而熱酸菌屬和分枝桿菌屬顯著低于玫瑰紅菇根際土壤；根際土壤真菌中，玫瑰紅菇根際土壤中Oidiodendron屬和木霉屬顯著高于灰肉紅菇根際土壤，這些可能是由于兩種紅菇特異性地選擇對自己生長有益的土壤微生物[5]。因此，可以推測這些共有的和特異性的微生物可能是2種紅菇的菌根輔助菌。研究發(fā)現(xiàn)，變異桿菌屬（Variibacter）、慢生根瘤菌屬、Candidatus_Solibacter屬和伯克氏菌屬為外生菌根真菌中主要的菌根輔助菌[35-37]。在歐洲赤松的根際土壤中加入伯克氏菌屬，紅乳菇的侵染率增加1.9～2.4倍[36]，而加入芽孢桿菌屬，褐環(huán)乳牛肝菌的侵染率增加2.1倍[38]；在三角葉楊根際土壤中加入類芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)雙色蠟?zāi)⒌那秩韭侍岣吡?.5倍[3]。Kataoka等[39]發(fā)現(xiàn)，土壤中慢生根瘤菌屬和伯克氏菌屬存在外生菌根真菌紅菇屬、牛肝菌屬與宿主植物共生的根尖部位。Oh等[23,40]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌伯克霍爾德氏菌屬、分枝桿菌屬和類芽孢桿菌和真菌青霉屬、木霉屬、被孢霉屬和毛霉屬均是外生菌根真菌松茸的菌根輔助菌。Yu等[7]對不同地區(qū)的灰肉紅菇土壤細(xì)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)伯克氏菌屬、分枝桿菌屬、Candidatus_Xiphinematobacter屬、Roseiarcus屬和堆囊菌屬是灰肉紅菇主要的外生菌根輔助菌，這些研究表明菌根輔助菌在外生菌根菌生長過程中具有重要的作用。2種紅菇中主要的菌根輔助菌具有能夠影響外生菌根菌定殖的生態(tài)功能，如在根際土壤細(xì)菌中，Candidatus_Solibacter屬可以有效分解有機(jī)質(zhì)[41]；堆囊菌屬存在降解木聚糖酶，可以降解植物細(xì)胞壁和生物大分子，有利于外生菌根真菌定殖，提高外生菌根真菌產(chǎn)量[42]；分枝桿菌屬具有固氮功能，能為外生菌根真菌的生長提供氮源[43]；Singulisphaera屬能夠降解木聚糖和果膠[44]；而土壤真菌中，木霉屬不僅分泌降解植物細(xì)胞壁的纖維素酶和半纖維素酶、降解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)酶等[45]，還能與被孢霉屬和青霉屬溶解土壤中的有機(jī)磷和無機(jī)磷，促進(jìn)植物對土壤磷元素的吸收，參與土壤碳、磷循環(huán)[46]。兩種紅菇根際土壤中具有降解植物細(xì)胞壁功能的微生物顯著高于非根際土壤，這表明這些微生物菌群參與外生菌根真菌與宿主植物的共生機(jī)制。此外，在根際與非根際土壤中相對豐度高的菌群也具有類似的生態(tài)功能，如Bryobacter可以促進(jìn)土壤碳循環(huán)[41]；慢生根瘤菌屬起到固氮、溶解土壤有機(jī)和無機(jī)磷能力[46]；伯克氏菌屬不僅具有固氮作用，還能優(yōu)先與菌根結(jié)合，隨著外生菌根菌菌絲進(jìn)行遷移[35]，說明這些微生物菌群對紅菇的生長也起到了促進(jìn)作用。Oh等[23]通過對松茸根際土壤細(xì)菌的功能進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，根際土壤主要參與氨基酸代謝和碳水化合物代謝。2種紅菇在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、能量代謝、膜運(yùn)輸、細(xì)胞遷移等代謝途徑中顯著高于非根際土壤，這可能是由于菌根菌與植物的共生導(dǎo)致根系分泌物中氨基酸、脂肪酸、碳水化合物等增加，為土壤微生物提供重要的碳源，有助于土壤微生物的富集[23,47]。2種紅菇根際土壤微生物群落功能存在差異，可能是由于不同的菌根菌對根際微生物的偏向性選擇，導(dǎo)致微生物菌群的功能表現(xiàn)出差異，這些差異也可能會(huì)反過來影響2種紅菇的特性。

5 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰紅菇和灰肉紅菇2種紅菇根際土壤微生物與非根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異，細(xì)菌（變異桿菌屬、Candidatus_Solibacter屬、堆囊菌屬、分枝桿菌屬、Singulisphaera屬、Isosphaera屬、蛭弧菌屬、類芽孢桿菌屬）和真菌（木霉屬、青霉屬和Hypomyces屬）為2種紅菇共有的優(yōu)勢菌根輔助菌，這些菌群具有降解植物細(xì)胞壁、固氮和溶磷等功能，能促進(jìn)紅菇與植物根系形成共生關(guān)系。2種紅菇根際土壤微生物菌群之間也存在顯著差異，這是由于2種紅菇會(huì)特異性地選擇對自己生長有益的土壤微生物。pH是影響2種紅菇生長的主要因素。2種紅菇根際土壤細(xì)菌群落在能量代謝，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，膜運(yùn)輸通路等顯著高于非根際土壤。本研究的目的是篩選外生菌根真菌紅菇的菌根輔助菌，制備專用微生物菌肥，擴(kuò)大林下經(jīng)濟(jì)規(guī)模，為紅菇的保育促繁提供理論依據(jù)。